Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Zusammenfassung

Elektronenspin-Resonanz (EPR)-Spektroskopie wurde eingesetzt, um Stickoxid aus Rinder-Endothelzellen und Superoxidradikalanion von menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD) erkennen ₂ Und 5,5-Dimethyl-1-pyroroline-N-oxid, DMPO, jeweils.

Zusammenfassung

Reaktivem Stickstoff / Sauerstoff-Spezies (ROS / RNS) in geringen Konzentrationen spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellfunktion, Signal-, und Immunantwort aber in unregulierten Konzentrationen sind schädlich für die Lebensfähigkeit der Zellen ^{1, 2.} Während lebenden Systemen mit endogenen und diätetische antioxidativen Mechanismen entwickelt, um ROS zu regulieren, werden ROS kontinuierlich natürliche Nebenprodukte der normalen Stoffwechsel von Sauerstoff erzeugt und kann oxidativen Schäden an Biomolekülen was zu einem Verlust der Funktion des Proteins, DNA-Spaltung, oder Lipid zu Peroxidation ^3, und schließlich gegen oxidativen Stress, der zu Verletzung oder Tod Zelle ^4.

Superoxid-Radikal-Anion (O ₂ • -) ist das wichtigste Vorläufer einige der stark oxidierenden Spezies, auf die in biologischen Systemen, wie Peroxynitrit und Hydroxylradikale abgegeben. Die Erzeugung von O ₂ • - signalisiert den ersten Anzeichen von oxidativem Burst, und deshalb habe ichts Nachweis und / oder Speicherung in biologischen Systemen wichtig ist. In dieser Demonstration O ₂ • - wurde von neutrophilen Granulozyten (PMN) generiert. Durch chemotaktische Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), erzeugt PMN O ₂ • - über die Aktivierung von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) Oxidase ^5.

Stickoxid (NO)-Synthase, die in drei Isoformen kommt, induzierbare-, neuronale und Endothel-NOS oder iNOS, nNOS oder eNOS, jeweils, katalysiert die Umwandlung von L-Arginin, L-Citrullin, mit NADPH, um NO ^{6 zu} erzeugen . Hier erzielten wir NO aus Endothelzellen. Unter oxidativem Stress kann zum Beispiel von eNOS Herstellung NO zu O ₂ • wechseln - in einem Prozess namens Entkopplung, die vermutlich durch Oxidation von ^Häm-7 oder der Co-Faktor, Tetrahydrobiopterin (BH ₄₎ ⁸ verursacht wird.

Es gibt nur wenigezuverlässiger Verfahren zur Detektion von freien Radikalen in biologischen Systemen, aber von Spezifität und Sensitivität begrenzt. Spin trapping wird allgemein für die Identifizierung von freien Radikalen verwendet und umfasst die Addition von einem Rest einer Spin-Trap Bilden einer persistenten Spinadduktes, die durch paramagnetische Elektronenresonanz (EPR)-Spektroskopie nachgewiesen werden kann. Die verschiedenen Radikaladdukte zeigen markante Spektrum, mit dem die Radikale erzeugt identifizieren und können eine Fülle von Informationen über die Art und Kinetik der Radikal-Produktion ⁹ bieten kann.

Die cyclischen Nitrone, 5,5-Dimethyl-pyrrolin-N-oxid, DMPO ^10, die Phosphoryl-substituiert DEPMPO ¹¹ und die Ester-substituierte, EMPO ¹² und BMPO ^13, werden weithin als Spinfallen verwendet - letztere Spin Fallen ausstellenden längere Halbwertszeiten für O ₂ • - Addukt. Eisen (II)-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat, Fe (MGD) _{2 <}/ Sub> wird häufig verwendet, um die NO aufgrund der hohen Rate von Adduktbildung und der hohen Stabilität des Spin-Addukt ¹⁴ abfangen.

Protokoll

1. Kultur von Bovine Endothelzellen (BAEC)

1. Die richtige aseptische Techniken befolgt wurden.
2. In einem Wasserbad, warme Medium ohne Antibiotika bei 37 ° C

Hinweis: Das Medium besteht aus Phenol Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l D-Glucose, 4 mM L-Glutamin, 1% nicht essentielle Aminosäuren, mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 2,5 ergänzt mg / L endothelial growth factor.

3. Entfernen Sie die T75 Kolben mit Zellen aus dem Inkubator und reinigen Sie die Oberfläche der Flasche mit 70% Ethanol, bevor Sie es im Inneren der Kapuze.
4. Entfernen Sie die alte Medium mit einem Saug und Waschen zweimal mit 5 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS).
5. 2 ml Trypsin und warten Sie 4-5 min für Zellen zu trennen, während in regelmäßigen Abständen Inspektion unter dem Mikroskop.
6. 3 ml des Mediums und immer wieder mischen mit einer Pipette zu trennen ter Zellen und erzeugen eine gleichmäßige Suspension.
7. Übertragen 5 ml des Mediums mit Trypsin zu einer 15 ml-Röhrchen und zentrifugiert bei 121 g für 5 min.
8. Entfernen Sie den Überstand mit einem Aspirator. 5 ml DPBS und gründlich mischen. Zentrifugieren bei 121 g für 5 min.
9. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet durch Zugabe von 6 ml des Mediums.
10. Auf einer 6-Well-Platte, 1 ml der Zellsuspension in jede Vertiefung dann 1 ml des Mediums. Mischen Sie die Suspension mit einer Pipette.
11. Beschriften Sie die Platte und Inkubation über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.

2A. Detektion von NO mit BAEC Zelle

1. Die richtige aseptische Techniken befolgt wurden.
2. Entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und Saugen Sie das Medium aus der ersten Bohrung. Die Zellen werden zweimal mit 1 ml DPBS.
3. Fügen Sie 210 ul von 1,9 mm Eisen (II) sulfat-Heptahydrat (FeSO _{4 · 7H 2} O, bereiten frisch durch Lösen von 0,8 mg in1 ml DPBS mit CaCl ₂ und MgCl ₂₎ und 210 ul von Ammonium-N-Methyl-D-glucamin Dithiocarbamat (MGD, frisch zubereitet und durch Auflösen von 2,7 mg in 500 ul DPBS mit CaCl ₂ und MgCl ₂₎ mit einem Verhältnis von 1:7 . (Hinweis:. Dieses Verhältnis, wo überschüssiges MGD verwendet wird, wurde herkömmlicherweise für die Herstellung von Fe ^{2 +-MGD-Komplex} durch die Tatsache, dass die Ausbeute für Fe ^{3 +-MGD} in Gegenwart von überschüssigem MGD maximiert wird eingesetzt Die Zugabe von Ascorbat in Lösung, um die Fe ^{2 +-MGD} Stabilisierung ist nicht notwendig, da die NO-Fe ^{3 +-MGD} endogen gebildet wird, um den EPR-detektierbare NO-Fe ² durch Ascorbat, Hydrochinon, oder Cystein mit Wirkungsgrad von bis ^+-MGD reduziert auf 99,9% .. Die Low-Spin-Zustand diamagnetisch von Fe ^{2 +} ermöglicht den Nachweis von NO mit flachen Zelle oder Kapillarrohr, ohne die Notwendigkeit eines niedrigen Temperatur-Gerät) ^15.
4. Schwenken Sie die resultierende Suspension gut und fügen 4,6 μl Calcium-Ionophor (CAI) (hergestellt aus einer Stammlösung von 1,9 mM durch Lösen von 1 mg in 1 ml DMSO).
5. Strudel die Lösung wieder und bei 37 ° C für 36 min, um eine weitere Reduktion von NO ermöglichen-Fe ³ zum EPR nachweisbare NO-Fe ^{2 +-MGD +-MGD.}
6. Die überstehende Flüssigkeit (425 ul) in ein Eppendorf-Röhrchen und Überweisung auf ein EPR flache Zelle (oder einem 50 ul Kapillarrohr).
7. EPR-Aufnahme-Parameter sind: Mikrowellen-Frequenz: 9,8 GHz; Center-Bereich: 3427 G; Modulationsamplitude: 6,0 g; Sweep-Breite: 100 g; Empfänger Gewinn: 1 x 10 ^5; Mikrowelle: 10 mW; Gesamtzahl der Scans: 121; Ablaufzeit: 10 s; und die Zeitkonstante von 20 ms (Anmerkung: Da die Parameter von einem Instrument und die experimentellen Bedingungen zur anderen variieren, daher nur die mittlere Feld, Frequenz und der Modulationsamplitude die wichtigsten Parameter zu prüfen.).
8. Die Spektren bei Raumtemperatur und die 2-D-Spektren wurden integribewertet, um die Hintergrundgeräusche und Grundlinie korrigiert Bruker WinEPR Data Processing Software oder andere Software zur Datenverarbeitung zu reduzieren. Zur Quantifizierung der Adduktbildung, kann Standardkurven Konzentration gegen Signalintensität (oder Fläche) ausgebildet ist unter Verwendung eines NO-Donors SNAP werden.

2B. eNOS Entkopplung Experiment

1. Entfernen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und Saugen Sie das Medium aus der zweiten gut waschen und zweimal mit 1 ml DPBS.
2. Ein Donor Peroxynitrit, 5-Amino-3-(4-Morpholinyl) -1,2,3-oxadiazolium chlorid (SIN-1) wurde verwendet, um eNOS ¹⁶ zu entkoppeln. Fügen Sie 100 ul 0,5 mM SIN-1 (M _r 206,6 g / mol, von 10 mM Stammlösung frisch durch Lösen von 1 mg SIN-1 in 500 ul PBS ohne Ca / Mg-Ionen vorbereitet) und verdünnte bis 2 ml mit DPBS und 10% FBS.
3. Inkubieren für 2 h bei 37 ° C und 5% CO _2.
4. Die Platte aus Inkubator und waschen zweimal mit DPBS.
5. Fügen Sie 210 ul2,8 mM FeSO _{4 · 7H 2} O und 210 ul von 19,6 mm MGD frisch nach dem Verfahren des oben genannten vorbereitet.
6. Schwenken Sie die Lösung und fügen 4,6 ul von 1,9 mm Cai.
7. Schwenken Sie die Lösung wieder und Inkubation bei 37 ° C für 36 min.
8. Die überstehende Flüssigkeit (425 ul) in ein Eppendorf-Röhrchen und Überweisung auf ein EPR Flachzelle.
9. EPR-Aufnahme-Parameter sind: Mikrowellen-Frequenz: 9,8 GHz; Center-Bereich: 3427 G; Modulationsamplitude: 6 G; Sweep-Breite: 100 g; Empfänger Gewinn: 1 x 10 ^5; Mikrowelle: 10 mW; Gesamtzahl der Scans: 121; Sweep-Zeit: 10 s; und Zeitkonstante: 20 ms.
10. Die Spektren und die 2-D-Spektren wurden integriert, um das Hintergrundrauschen und Baseline-korrigierte wie oben erwähnt zu reduzieren.

3. Nachweis von O ₂ • - von neutrophilen Granulozyten (PMN)

1. Neutrophile wurden aus menschlichen Blutprobe isoliert, wie zuvor ¹⁷ beschriebenen.
2. Machen Sie eine Stammlösung von 1 M * DMPO in PBS mit 0,1 mM Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA). DMPO hat einen Schmelzpunkt von 25-29 ° C, so ist es bequemer, um Flüssigkeit DMPO (Dichte ~ 1,02 g / ml bei 25 ° C) in einem Glasfläschchen (Anmerkung pipettieren: Verwenden Sie keine Kunststoff-Fläschchen zum Wiegen da reines DMPO reagiert mit Kunststoff). Gefrorene DMPO kann durch Ausführen von lauwarmem Wasser auf dem Fläschchen (: Führen Sie nicht heißes Wasser als DMPO kann sich zersetzen Hinweis) geschmolzen werden.
3. Es ist wichtig, um die hohe Reinheit DMPO (> 99%) zu verwenden, da einige der im Handel erhältlichen Spinfallen paramagnetische Verunreinigungen enthalten, und daher ist es unerlässlich, EPR-Spektrum nur die DMPO Lösung allein (10 mM in diesem Fall) ausgeführt. Entscheidend ist, dass kein Hintergrund-Signal erkennbar ist (siehe Abbildung 3A).
4. Planen-Stammlösung (1 mg / ml) Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) in DMSO. Machen Aliquots durch Verdünnen der Lösung auf 10 pg / ml in PBS.
5. In einem 1.5 ml Eppendorf-Röhrchen, Herstellung einer Lösung mit einem Gesamtvolumen von 0,6 ml in folgender Reihenfolge der Zugabe: ~ 10 ⁶ Zellen pro ml PMN, D-Glucose (1 mg / ml) und Albumin (1 mg / ml), 10 DMPO mM und 0,2 ug / ml PMA. (Hinweis: PMA ist die radikale Aktivator und sollte als letztes zugegeben werden).
6. Die Lösung wird in einem EPR Flachzelle.
7. EPR-Aufnahme-Parameter sind: Mikrowellen-Frequenz: 9,8 GHz; Center-Bereich: 3486 G; Modulationsamplitude: 0,5 g; Sweep-Breite: 100 g; Empfänger Gewinn: 5 x 10 ^5; Gesamtzahl der Scans: 10; Sweep-Zeit: 30 s ; Mikrowellenleistung: 20 mW; und Zeitkonstante: 81 ms. Zur Quantifizierung der Adduktbildung, kann Standardkurven Konzentration gegen Signalintensität (oder Fläche) unter Verwendung der stabilen Nitroxide, wie TEMPO oder 3-carbonsäure-PROXYL werden.

* Wichtiger Hinweis zur Verwendung von DMPO: Durch die Verwendung eines flachen Zellen, kann man erhöhen die Zelldichte und erhöht damit die SignalqualitätIntensität des Spinadduktes, aber die Halbwertszeit von O ₂ • - Addukt von DMPO kurz ist (t _1/2 ~ 1 min), welche zersetzt DMPO-OH ist. DMPO können substituiert mit den gleichen Konzentrationen von EMPO, BMPO oder DEPMPO im Handel erhältlich sind für eine erhöhte Stabilität Addukt mit t _1/2 ~ 8 und 14 min, jeweils werden.

4. Repräsentative Ergebnisse

Spintrapping der NO-Radikal wurde mit Fe ^{2 +-MGD.} 2A und 2B zeigen kein EPR-Signal von Fe ^{2 +-MGD} oder eine Mischung von Fe ^{2 +} mit Cai-MGD, was darauf hinweist, dass kein Signal von NO Hintergrund dieser Reagenzien stammt. BAEC nach Stimulation mit CaI NO freisetzt, die mit Fe ^{2 +-MGD} reagiert, um die Spinadduktes, NO-Fe ^{2 +-MGD} zu bilden, und zeigt ein charakteristisches Signal mit Triplett Hyperfeinaufspaltung Konstante (HFSC) Wert eines _N = 12,66 g und g-Faktor von g = 2,040. (Abbildung 2C). Die HF-SC-Wert wurde mit Hilfe des WinSim Simulationsprogramm, das aus NIEHS EPR-Software Datenbank-Website heruntergeladen werden kann. Die experimentelle HFSC steht im Einklang mit der Literatur Wert einer _N = 12,70 G und g = 2,041 ¹⁸ für NO-Fe ^{2 +-Addukt} MGD. In ähnlicher Weise abgesenkt die Wirkung von SIN-1 auf die NO-Produktion BAEC durch eNOS Entkopplung, wie in 2D gezeigt ist.

Erkennung - DMPO wurde für O ₂ • Einsatz. DMPO allein nicht ein Signal geben, wie in den 3A bestätigt, dass der Spin-frei von paramagnetischen Verunreinigungen gezeigt. 3B ist das Spektrum der DMPO und PMN nur, und in ähnlicher Weise gibt es kein nachweisbares Signal ab, dass die nicht zu DMPO Aktivierung des Enzyms NADPH-Oxidase. 3C zeigt die beobachteten EPR-Signals nach der Stimulierung von PMN durch PMA. Die HFSC Werte für dieses Signal waren entschlossen, ein _N = 14,71 g, a _& seinbeta;-H = 11,40 g _{γ und-H} = 1,25 G und stehen im Einklang mit den Literaturwerten von einer _N = 14,3 g, einer _β-H = 11,7 G und einer _γ-H = 1,3 G ¹⁹ für-O DMPO ₂ H-Addukt.

1. Ablaufdiagramm für den Nachweis von Resten von Neutrophilen und BAEC mit EPR Spin trapping. (A) PMNs wurden gemischt mit DMPO und PMA, und die resultierende Mischung eine EPR Flachzelle zur Datenerfassung übertragen. (B) BAEC wurden auf eine Platte gezüchtet, gewaschen und mit DPBS. Der Spin-Trap-Fe (MGD) ₂ wurde zusammen mit Cai hinzu. Die Lösung wurde gründlich gemischt und inkubiert. Das Gemisch wurde auf einem EPR Flachzelle für EPR Datenerfassung übertragen.

Abbildung 2. EPR Detektion von NO aus BAEC. (A) Spektrum des Fe ^{2 +-MGD} nur (B) Spektrum von Fe ^{2 +-MGD} + CaI nur. (C) Triplettspektrum aufgrund fehlender Trapping von Fe ^{2 +-MGD} mit CAI-Zellen stimuliert. (D) Spectrum zeigt Rückgang der NO-Produktion durch 0,5 mM SIN-1 Behandlung von Zellen.

Abbildung 3. EPR Detektion von DMPO-O ₂ H aus aktivierten neutrophilen Granulozyten. (A)-Spektrum von 10 mM DMPO nur. (B) Spektrum von PMN allein in der Gegenwart von 10 mM DMPO. (C) Spektrum von PMN durch PMA in Gegenwart von 10 mM DMPO aktiviert.

Diskussion

EPR Spin trapping wurde in einem weiten Bereich von biomedizinische Anwendungen für die Quantifizierung und Identifizierung von freien Radikalen verwendet. Spin trapping ist hochempfindlich, zum Aufspüren von Resten in Konzentrationen von nM bis uM eignet sich daher für die Anwendung in biologischen Systemen. Die Bildung des paramagnetischen Addukt, NO-Fe ^{2 +-MGD,} ist die Basis der NO-Erkennung durch EPR. Fe ^{2 +-MGD} reagiert mit NO schnell ¹⁸ an einer Rate von ~ 10 ⁶

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Phenol freien DMEM-Medium Hohe Glukose-1X	GIBCO	31053
0,25% Trypsin-EDTA	GIBCO	25200
L-Glutamin	Fisher Scientific	BP379-100
MEM nicht-essentiellen Aminosäuren	GIBCO	11140
Rinderfötenserum	Atlanta Biologicals	S11550
Endothelial growth factor	Millipore	02-102
CaI	Enzo Life Sciences	A-23187	Man löst in DMSO
SIN-1	Enzo Life Sciences	BML-CN245-0020
DMPO	Dojindo Laboratories	D048-10
FeSO 4 · 7H 2 O	Sigma Aldrich	215422-250G	Lösen Sie in PBS mit Ca und Mg
MGD	Enzo Life Sciences	ALX-400-014-M050	Lösen Sie in PBS mit Ca 2 + und Mg 2 +
BAEC Zellen	Cell Systems	2B2-C75
DMSO	Fisher Scientific	BP231-100
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
DPBS mit CaCl 2 und MgCl 2	Sigma Aldrich	D8662
Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)	Sigma Aldrich	79346-1MG