טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

Summary

צרעת, הנגרמת על ידי Mycobacterium leprae, היא עדיין אנדמית במקומות רבים. על מנת ללמוד על התפשטות ומצב של שידור של צרעת, חשוב לקבוע איזה זן של מ leprae נגוע חולה. מספר משתנה של חזרות טנדם (VNTR) הקלדה היא שיטה אחת כזו.

Abstract

המחקר של השידור של הצרעת הוא קשה במיוחד מאחר הסוכן סיבתי, Mycobacterium leprae, לא יכול להיות מתורבת במעבדה. המקורות רק של חיידקים הם מטופלים צרעת, ארמדילים נגוע בניסוי ועכברים בעירום. לכן, רבים מן השיטות באפידמיולוגיה מודרנית אינם זמינים עבור המחקר של צרעת. למרות תוכנית התרופה נרחב העולמי לטיפול בצרעת מיושם על ידי ארגון הבריאות העולמי ^1, צרעת נשאר אנדמי במדינות רבות עם כ 250,000 מקרים חדשים בכל שנה. ² מ 'שלמה leprae הגנום כבר ממופה ^3,4 ו לוקוסים רבים זוהו חזרו מקטעים של 2 או יותר זוגות בסיסים (נקרא מיקרו minisatellites). ⁵ זנים קלינית של מ ' leprae עשוי להשתנות במספר מגזרים טנדם חוזרות ונשנות (חזרות טנדם קצרות, STR) בשעה שרבים לוקוסים אלו. ^5,6,7 מספר משתנה במקביל לחזור (VNTR) ⁵ ניתוח נעשה שימוש כדי להבחין בין זנים שונים של החיידקים הצרעת. חלק מהאתרים נראים יציבים יותר מאחרים, מראה וריאציה פחות במספרים חוזרים, בעוד אחרים נראים לשנות במהירות רבה יותר, לפעמים באותו חולה. למרות ההשתנות של VNTRs מסוים הביא את שאלות לגבי התאמתם הקלדה זן ^7,8,9, הנתונים מראים כי ניתוח המתעוררים לוקוסים מרובים, שהם מגוונים היציבות שלהם, יכול לשמש ככלי אפידמיולוגי יקר. מספר מוקד VNTR ניתוח (MLVA) ¹⁰ נעשה שימוש כדי ללמוד את תורת האבולוציה צרעת והעברת במספר מדינות כולל סין ^{11,12, 8} מלאווי, פיליפינים ^{10,13, 14} ו ברזיל. MLVA כרוך שלבים מרובים. ראשית, ה-DNA חיידקי מופק יחד עם ה-DNA המארח רקמה ביופסיות עור קליני או חריץ מריחות (SSS). ¹⁰ לוקוסים הרצוי ואז הם מוגבר באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR) מ-DNA המחולץ. Primers fluorescently שכותרתו עבור לוקוסים שונים 4-5 משמשים לכל תגובה, עם 18 לוקוסים להיות מוגבר בסך של ארבע תגובות. ¹⁰ המוצרים PCR עשוי להיות נתון ג'ל אלקטרופורזה agarose כדי לוודא את נוכחותו של המגזרים ה-DNA הרצוי, ולאחר מכן הגישה לניתוח פלורסנט אורך קטע (FLA) באמצעות אלקטרופורזה נימי. דנ"א ארמדיל passaged חיידקים עם מספר ידוע של עותקים חוזרים עבור כל מוקד משמש כביקורת חיובית. Chromatograms FLA נבחנים אז באמצעות תוכנה סורק שיא אורך קטע מומר מספר העותקים VNTR (אלל). לבסוף, haplotypes VNTR מנותחים על דפוסים בשילוב עם נתונים קליניים המטופל יכול לשמש כדי לעקוב אחר התפלגות סוגי המתח.

Protocol

מטרת מאמר זה היא לספק וידאו סקירה של זרימת העבודה, יחד עם תבנית נתונים ופרשנות לחוקרים כי עשוי להיות המוצא זה סוג של עבודה (איור 1). הוא כולל הדגמה של טכניקות, פרוטוקולים פשוטים טיפים מעשיים המתואר יצירות שפורסמו בעבר. ^5,10

תזרים עבודה כללי שרותי מעבדה:

לא צריך להיות לפחות 3 אזורי עבודה נפרדים עבור סוג זה של מחקר. המעבדה צריך 1) אזור טרום PCR עם ברדס PCR (תיבת אוויר נקי או פינת עבודה מבודדת) להכנת פריימר (דילול, הכנה aliquot ערבוב), 2) ארון נפרד ביו בטוח טיפול נוסף של דנ"א על תערובות ה-PCR, ו - 3) אזור שלאחר PCR עבודה להכנת וטעינה ג'לים להכנת דגימות FLA. Primers דגימות DNA יש לשמור מקפיאים ומקררים נפרד. זיהום פריימר היא אחת הבעיות העיקריות והעקבית ביותר בעבודת מעבדה מסוג זה. Pipettes המשמש primers ו-PCR מתערבב לא אמור לשמש עבור ה-DNA. לא צריך להיות מערכות נפרדות של pipettes עבור טרום PCR, PCR ופוסט PCR שטחי העבודה. בדרך כלל, חוקר אחד יכול לעבד 12-18 דגימות בתקופה 12-24 שעה באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

לפני תחילת כל שלב של העבודה:

• ללבוש חלוק מעבדה וכפפות. יש ללבוש כפפות בכל עת דגימות ביולוגיות, primers, דנ"א ברומיד ethidium מטופלות. שנה כפפות בתדירות גבוהה.
• עבוד במנדף PCR הממשלה, הקבינט biosafety או אזור העבודה נקי.
• השתמש בנייר ספסל כרית טריים או.
• הגדרת קיבול מתאים פסולת נוזלים טיפים פיפטה.
• נגב למטה בחלק הפנימי של מכסה המנוע PCR ו pipettes עם אתנול 70%.
• Pipettes נושא ואת אזור העבודה לאור UV למשך 15 דקות לפני PCR להגדיר. (אור אולטרה סגול משטח crosslinks מזהמים DNA).
• השתמש תמיד אירוסול פיפטה טיפים למניעת חומרים המכילים DNA, primers ו ריאגנטים PCR.
• צנטריפוגה כל צינורות / רצועות / צלחות המכילות נוזל לפני הפתיחה כדי למנוע בריחה אירוסול ו צולבות זיהום על ידי טיפול.

1. M. leprae DNA הכנה

דוגמאות קליניות המכילות מ leprae מתקבלים חולי צרעת המבקרים במרפאות העור. דגימות לאבחון שגרתי עשוי להיות אגרוף ביופסיות עור, עור מריחות חריץ או מטליות האף. באופן כללי, ביופסיות אגרוף או חריצים כתמי העור הם הטובים ביותר עבור אפידמיולוגיה מולקולרית כי הם נקיים מכילים כמויות מספיקות של מ ' leprae. שימוש בחומרים אלה למחקר חייב להיות מאושר על פי הנחיות מוסדיים.

1. שמור על ביופסיה או חריץ למרוח דגימות העור בקבוקון בורג, כובע עם 1 מ"ל של אתנול 70%.
2. כל צנטריפוגה מדגם צנטריפוגה משתנה במהירות הספסל העליון בבית XG 12,000 במשך 15 דקות.
3. הסר את supernatant ולמקם אותו צינור microcentrifuge. אם יש צורך, זה עשוי להיות שימושי מחדש צנטריפוגות אלה דגימות DNA לשחזר רקמות נוספות או במאוחר.
4. הוסף 500 μl של בופר פוספט (PBS) על דגימות רקמה ומשרים למשך שעה 1 להחליף משמר אתנול שיורית רעננותם ואת המדגם.
5. צנטריפוגה דגימות בצנטריפוגה הספסל העליון בבית XG 12,000 במשך 20 דקות. מחק את הפתרון PBS במיכל אשפה מלא חלקית עם פתרון חיטוי.
6. תמצית ה-DNA חיידקי באמצעות דם DNEasy Qiagen וערכת רקמות לפי ההנחיות שנקבעו.
7. DNA חולץ צריך להיות aliquoted לתוך 4 מבחנות. 2 חנות aliquots ב -80 ° C לשימוש עתידי אם / כאשר שחזור של תוצאות הבדיקה נדרשת או כאשר טכנולוגיות חדשות הופכות לזמינות. חנות אחת aliquot ב -20 ° C ואחד ב 4 ° C לשימוש מיידי יותר.
8. זה נבון להכין "ריק החילוץ" יחד עם דגימות רקמה. ריק הוא נתון כל הטיפולים זהה שתוארו לעיל, אך מבוצע ללא רקמות. PCR הריק החילוץ יחד עם דגימות החולה כדי להבטיח מיצוי טכניקה של המפעיל היא נכונה ריאגנטים כי הם ללא זיהום DNA.

2. פריימר הכנה

1. Primers עבור לוקוסים אשר יש סוג נתונים נרחב ביותר זן מפורטים בטבלה 1. ארבע או 5 primers משולבים עבור זמנית PCR. אחת תחל עבור כל מוקד נושאת תג כימיים פלורסנט '5 כי יהיה מזוהה במהלך ניתוח שבר נימי אורך אלקטרופורזה (FLA).
2. לכל שילוב זמנית PCR, תחל מתויג פריימר הפוכה המתאימה עבור כל מוקד משולבים נפרד צינורות Eppendorf: primers קדימה צינור אחד, להפוך אחר. Primers במלאי מוכנים כמו 100μM פתרונות (איור 2 א), חלק מהםהוא מדולל 10x עד ריכוז של 10 מיקרומטר באמצעות TE (1x טריס-EDTA, pH 8.0). Aliquots נותרת של פתרונות פריימר 100 מיקרומטר מאוחסנים ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
3. כמויות שוות של כל פריימר 10 מיקרומטר מעורבבים והתוצאה הסופית 2μM ריכוזים של כל פריימר. כאשר שילובים פריימר מתווספים לתערובת PCR (לוח 3), את הריכוז הסופי של כל פריימר יורדת 0.2 מיקרומטר.

כאשר primers בשילוב מוספים את תערובות PCR (לוח 3), ירידה בריכוז הסופי כדי 0.2μM כל אחד.

3. DNA חיידקי הגברה באמצעות PCR זמנית

1. הגדרת ה-PCR
   • שיא מספר דוגמאות אשר ישמשו להכין גליון עבודה עם חומרים כימיים הדרושים כרכים שלהם לפני איסוף פלסטיק וחומרים אחרים הדרושים.
   • לייבל צינורות סטרילי / רצועות / צלחות לשמש עבור ה-PCR עם מספרים המדגם. זכור לכלול בקרות חיוביות ושליליות.
2. נגבו את thermocycler בחומר ניקוי (כגון Decon ELIMINase) תוכנית זאת לפי טבלה 2. כפפות שנה לאחר ניקוי לפני טיפול primers ו ריאגנטים אחרים.
3. הכן PCR Mastermix לפי לוח 3 התווית PCR צינורות / רצועות / צלחת עם שילוב פריימר ומספרי מדגם לשמש.
4. Aliquot 18μl של Mastermix אל צינור כל PCR שכותרתו מדגם או טוב. שנה כפפות.
5. נגבו את ארון נפרד ביו בטיחות pipettes עם אתנול 70% כדי לעזור לנקות ולחטא את אזור העבודה וכלים, ואז נושא את אזור העבודה pipettes לאור UV למשך 15 דקות לחצות, כל קישור מזהמים DNA. שנה כפפות.
6. בארון ביו בטוח ונקי, להוסיף 2μl של תבנית דנ"א כדי Mastermix שימוש ב-PCR כל צינור / צלחת גם לרכוש סך היקף 20μl (איור 2b). תרסיס למניעת טיפים פיפטה עבור כל חומרים נוזליים.
7. צנטריפוגה צינורות PCR / רצועות / צלחות בקצרה לערבב תוכן.
8. מניחים את דוגמיות / רצועות / צלחת thermocycler ועל להפעיל את תוכנית ה-PCR.
9. כאשר התוכנית תושלם, להסיר את המוצרים thermocycler ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד אלקטרופורזה.

4. ג'ל אלקטרופורזה של מוצרי ה-PCR

* פרוטוקול זה היה רגיל במשך שנים רבות היא צעד אופציונלי, כי יכול להיות מועסק, אם אישור של ה-PCR המוצרים הוא הרצוי לפני שליחתם עבור FLA.

1. באזור מוצב-PCR נפרד לעבוד, להכין ג'ל 2% agarose. השתמש 2.0g agarose powder/100ml של 1x TBE (טריס / borate / EDTA) פתרון חיץ בבקבוק. מחממים את התערובת במשך כ - 1.5-2 דקות במיקרוגל. מערבולת את התוכן, חימום שוב אם יהיה צורך לפרק את agarose. מצננים מעט ויוצקים את הג'ל בצורה באמצעות מסרק עם בארות מספיק דגימות.
2. הסר את מוצרי ה-PCR של 4 ° C ו צנטריפוגות במשך כ -30 שניות.
3. מערבבים 2 5μl של מוצר ה-PCR עם 0.5-1μl של חיץ 5x 6x או ג'ל העמסה (חיץ טוען זמין מחברות שונות, או עלולים להיות מעורבבים במעבדה. מתכונים זמינים באופן מקוון).
4. טען את הבארות של ג'ל עם תמהיל המדגם / טעינת 6μl חיץ. הוסף סולם מולקולרית לטיפוס אחד מוכר היטב (רצוי על סולם 20 נ"ב).
5. הרץ את הג'ל על 100V למשך כ 90 דקות.
6. משרים את הג'ל בתמיסה ברומיד ethidium עבור 15-30 דקות, ולאחר מכן במים מזוקקים ultrapure עבור כמות שווה של זמן.
7. תמונה הג'ל תוך אור UV מוחל. לא צריך להיות להקה לכל אחד מקטעי DNA 4-5 בשילוב (איור 3).
8. השלך את הג'ל בהתאם למדיניות חומרים מסוכנים של המוסד. פתרון Ethidium ברומיד ניתן להשתמש מספר פעמים לפני לסילוק נאות.

5. הכנה לניתוח דגימות אורך קטע (FLA)

1. בתוך צינור Eppendorf נקי, להכין תערובת המכילה מאסטר 12μl של פתרון Hi-Di לפוראמיד מ aliquot 0.3μl טריים של GeneScan -500 ליז גודל סטנדרטי (הן Applied Biosystems) עבור כל דגימה להיבדק. (Hi-Di לפוראמיד כימית denatures גדילי הדנ"א לפני נימי אלקטרופורזה, ומבטל את הצורך לחימום.) באמצעות 96-גם איכות אופטית תגובה צלחת, 12.3μl aliquot תמהיל לפוראמיד-ליז זה גם בשימוש עבור דגימות ולהגדיר את הצלחת בצד.
2. הכן מפת צלחת לצורך תיעוד המעיד על דגימת DNA אשר נמצא גם כל (איור 4 א).
3. באמצעות צינורות / רצועות או צלחת 96-היטב, להוסיף 1μl של מוצר ה-PCR (חלק מ - 3) כדי 59μl מים באיכות PCR יצירת דילול 1:60 של המוצר PCR. דילולים יכול להיות מותאם על בסיס עוצמת האות מהנתונים FLA או הבהירות של להקות ג'ל. גם בריכוזים נמוכים של ה-DNA עשויהלהספיק (1:120 או 1:180).
4. הוסף 1μl של המוצר PCR מדולל כדי הנכון היטב צלחת המכילה את תערובת לפוראמיד-ליז.
5. מהירות ויעילות ניתן לשפר מאוד אם PCR נעשה גם צלחת 96-היטב. אפשר פשוט בשורה 3 צלחות כאלה ברצף: 1 צלחת עם מוצרי ה-PCR, פלייט 2 עם מים סטריליים עבור דילול של מוצרי ה-PCR, ו - 3 פלייט עם לפוראמיד ואת סולם גודל לניתוח אורך קטע. פיפטה רב מאפשר תהליך מהיר הכנה FLA.

לדוגמא ניתוח באמצעות מנתח גנטי

6. כייל את Analyzer גנטית כדי לזהות את flurophores מיושם לכל הוראה של היצרן. הקפד להשתמש צבען סט הכולל ליז.
7. לחדש את המים לשטוף מכולות להוסיף מאגר פעולה חדש עם EDTA (1x) (Applied Biosystems) למאגר החדרים.
8. הוספת מראש חריץ סיליקון מחצה הצלחת ומניחים את הצלחת במגש מחזיק מעוצב. לחצו על "מגש" כפתור מנתח גנטית כדי להביא את קדימה autosampler. מניחים על מגש autosampler ולסגור את הדלת מנתח גנטית.
9. יצירה או ייבוא ​​גיליון אלקטרוני לניתוח. יביא קבצים בעלי סיומת. PLT הם בפורמט מופרד באמצעות טאבים. קבצים יכול להיות שונה ב-Excel (Microsoft) או תוכניות דומות.
10. הדגימות מוזרקים (אורך 50 ס"מ, POP-7 פולימר) נימי ידי יישום מתח הזרקה של kV 1.6 עבור 15 s. אלקטרופורזה נימי פועל במתח של 15 kV ב 60 ° C עבור 1800 שניות. התהליך כולו לוקח כ -45 דקות.
11. לאחר הפעלת תושלם, הנתונים עבור כל דגימה נותחו מומרים קבצים עם סיומת ה-FSA. והניח בתיקייה צלחת קובץ (איור 4 ב). כל קובץ הנתונים הוא בערך 100 KB בגודל ניתן לאחסן בכונן הבזק או בקובץ ZIP ו בדוא"ל. קבצי נתונים ניתן לראות באמצעות תוכנה מתאימה, כגון GeneMapper של ABI או מסורק שיא.

6. ניתוח התוצאות אורך קטע

1. ניתוח של נתוני אלקטרופורזה פלורסנט נימי דורש תוכנה מיוחדת. אם תוכנה כזו אינה זמינה, ללכת לאתר ולהוריד יישומי BioSystems סורק שיא. התוכנה היא בחינם עובד די טוב. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. סורק שיא פתוח "התחל פרוייקט חדש" ואחריו "הוסף קבצים". טען שנבחר. FSA קבצי הנתונים לתוכנית, כולל בקרות חיוביות ושליליות.
3. בחר (סמן) "לנתח" את כל הקבצים טעון. הקפד כל מדגם מוגדר התקן "גודל: GS500 (-250) וניתוח שיטה:. מדידות Default-PP לחץ" ניתוח ".
4. בדוק את גודל זוגות בסיסים של שיא כל צבעוניים המיוצרים על ידי שברי הדנ"א בדגימות.
5. שיא כל ערך בגודל שיא בזוגות בסיס להשוות אותו לשיא הביקורת החיובית.
6. פיקס בדגימות בקרה חיובית צריך להשוות לטובה עם המספרים של זוגות בסיסים ומספרי המקביל חוזר טנדם המפורטים בטבלאות 4-7.
7. לקבוע כמה קטעים קצרים לחזור טנדם נמצאים אלל אחד מדגם בהשוואה לשלוט חיובית. אנו משתמשים NHDP63 אשר כבר רצף של מספר העותקים VNTR על כל מוקד נבדקות ^4.
8. הזן את הנתונים שנרשמו לגיליון אלקטרוני עבור ניתוחים השוואתיים ו / או מתמטית. "טביעות אצבע" VNTR או haplotypes, הם מחרוזות של אללים בכל לוקוסים מוגדרים האופייניים מ leprae זן.

7. נציג תוצאות

ג'ל אלקטרופורזה של תוצרי PCR יהיה בתקווה לייצר הלהקה עבור כל מוקד בשילוב פריימר (איור 3). באיור 3, ישנם 2 חלקים כדי הג'ל: בחלק העליון יש שילוב 1 דגימות PCR שילוב התחתון חלק 2 דגימות. כל פרק מכיל 20 זוג בסיס הסולם מולקולרית, ואחריו מוצרי ה-PCR המתקבלים 8 דגימות המטופל. 1 שילוב יש גם בקרה שלילית ולבסוף בקרה חיובית (NHDP63 זן). (שולטת על שילוב 2 היו על ג'ל שונה.) שים לב שרוב הדוגמאות להציג בבירור 5 להקות, 1 עבור כל מוקד בשילוב. במקרים מסוימים, להקות עשוי להיות קרובים מדי זה לזה להיראות כמו לוקוסים נפרד וכתוצאה מכך הופעתו של רק 4 להקות.

גדלים amplicon צפוי מפורטים בטבלה 1. מעבדה שלנו משתמשת NHDP63 זן של מ ' leprae כביקורת חיובית. שני סוגים של מקטעים חוזרים נחקרו: לוקוסים microsatellite (1-5 חזרות עם בסיס) ו לוקוסים minisatellite (עם קטעים של יותר מ -5 זוגות בסיסים חזר מספר פעמים). ⁵

פרשנות של קבצי נתונים אלקטרופורזה נימי מסתמך על 2 תקנים: שבר פנימי DNA לגודל הסטנדרטי שנקרא GeneScan-500LIZ (ABI) ו מדגם חיצוני בקרה חיובית של ה-DNA חיידקי מוגבר.

Chromatograms FLA, שנצפו באמצעות תוכנת סורק שיא, ניתן לראות דמויות 5b 5a, ו 6.

סורק שיא מספק נתונים על גודל amplicon (ציר x של זוגות בסיסים) לבין עוצמת האות (ציר y). (איור 5 ב) נתונים נוספים על אזור השיא, וכו 'זמינים גם, אם כי גודל וגובה ערכי השיא הם החשובים ביותר. פיקס פחות מ -100 יחידות גובה נחשבים בדרך כלל חלש מדי אות להיות אמין.

איור 6 משווה את השליטה חיובי (NHDP63) ושתי דגימות החולה, מראה וריאציה במספר חזרות טנדם בכל מקום (GTA) 9. בשנת לשלוט חיובית, רצף (GTA) הוא חזר 10 פעמים. VNTR NHDP63 וגודל amplicon אומתו באמצעות רצפי גנים. PCR 4 החולה amplicon הוא 3 נ"ב קטן יותר לשלוט חיובי המעיד יש רק 9 יחידות חוזרות, בעוד החולה 6 יש amplicon זה 3 נ"ב גדול יותר NHDP63 חושף חוזרת של 11 (GTA). החולה 2 היה המדד נמוך חיידקי (BI) עם מעט או ללא שכפול PCR DNA, ולכן אין אות FLA.

קושי בפרשנות הנתונים FLA לפעמים מתרחשת כתוצאה של "גמגום". במהלך תגובת PCR, את פולימראז ה-DNA עשויה לייצר שברי כי הם 1 או יותר חוזר ארוך או קצר יותר מאשר אלל המקור. אלה מוכרים בדרך כלל כמו פסגות בגובה נמוך סביב שיא הראשי. הם יהיו "על הסולם", כלומר, את המספר הנכון של זוגות בסיסים של המגזר לחזור גדול או קטן יותר מאשר השיא העיקרי. התוצאה היא משפחה של פסגות של אותו צבע. איור 7 מראה את זה עם מוקד (ת"א) 10.

קושי נוסף נתקל לפעמים עם FLA כרוך "+ A" או "A-עוקב", שבו ה-DNA פולימראז מוסיף בסיס אחת [בדרך כלל אדנין (A)] עד הסוף '3 של קטע ה-DNA העתיק. זה מופיע FLA כמו שיא מימין לשיא הראשי או לגמגם כי הוא 1 זוג בסיס גדול יותר מאשר השיא הסמוך כפי שמוצג באיור 8. זה לא צריך להיות מבולבל עם שיא הראשי או לגמגם. שיא המנהל שלה זנב נחשבים מין אחד. זנב A-אינו משנה את מספר חוזר VNTR. (DNA פולימרז כמה ערכות נועדו במיוחד לקדם A-עוקב על מנת להפחית את האפקט הזה מבלבלים. קידום להשלים A-עוקב נוטה לייצר שיא אחד ולא זוג פסגות).

הפקת DNA ומוצרים PCR להכיל מ leprae ו-DNA האנושי, לעומת זאת למעט (ת"א) 18, primers הם ספציפיים מספיק שהם רק להגביר את ה-DNA בקטריאלי, ויש מעט או ללא הגברה DNA האנושי. (ת"א) 18 פעמים מייצרת לשיא של 242 זוגות בסיסים כלומר מ-DNA האנושי אינו נראה passaged ארמדיל דגימות DNA (איור 9).

חיי המדף של primers טוב בדרך כלל בתנאי שהם נשמרים -20 ° C, הוסרו רק לשימוש מיידי, ואז מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד נצרך. Primers צריך להיות יציב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות. למרות ביצוע שילובים פריימר עבור ה-PCR היא קצת זמן רב, מומלץ כי רק שילוב פריימר מספיק לשימוש מיידי להיות מוכנים. שילובים פריימר נראה לבזות במקצת כאשר מאוחסן לפרקי זמן ממושכים.

TE צריך להיות aliquoted ממניות גדול יותר, aliquots עשוי להיות מאוחסן קפוא או בטמפרטורת החדר. Aliquots מוגדלת של 200-400μl טובים דילול מניות פריימר מיובשים או מרוכז (איור 2 א). Aliquots קטנות של 10-50 μl שימושיים להשלים את הכרכים של שילובים פריימר 3 ו -4. TE זול aliquots אמור להיות מושלך לאחר שימוש.

אנזים ערכות Multiplex יקרים למדי צריך להישמר קפוא (-20 ° C) עד לשימוש. לאחר הכנה PCR, פתרונות כל זמנית בשימוש יש להחזיר מיד 4 ° C. קטן Qiagen Multiplex PCR Kit מגיעה עם 3 צינורות של תמהיל זמנית, כל אחד המכיל 0.85ml (850μl) של פתרון: מספיק כ 65-70 PCRs.

ככלל, עדיף להימנע חוזרות ונשנות, שינויי טמפרטורה גדולים עבור החומרים המשמשים לסוג זה של עבודה במעבדה כולל דגימות DNA, primers וערכת פתרונות זמנית. כל החומרים צריכים להיות מאוחסנים ב -20 ° C עד הצורך, והמשיך לאחר מכן ב 4 מעלות צלזיוס עד נצרך. אחסון לטווח ארוך של DNA צריך להיות ב -80 ° C.

כל החומרים המכיל בילו, רקמה primers ו / או ה-DNA יש autoclaved ו מסולק כאשר כבר לא כל שימוש. כל הדגימות טופלועם ברומיד ethidium או לפוראמיד יש להתייחס כאל פסולת מסוכנת ולהיפטר בהתאם למדיניות חומרים מסוכנים של המוסד.

טבלה 1: גדלים Amplicon עבור זן NHDP63

טבלה 2: רכיבה פרמטרים VNTR PCR

לוח 3: הכנת PCR

טבלה 4: שיחות אלל עבור שילוב 1

טבלה 5: שיחות אלל עבור שילוב 2

לוח 6: שיחות אלל עבור שילוב 3

לוח 7: שיחות אלל עבור שילוב 4

איור 1: VNTR-FLA תרשים זרימה תהליך

איור 2. (א) הכנת primers שילוב 1 העליון (תמונה Eppendorf צינור באדיבות www.clker.com ). (ב) הגדרת ה-PCR (עבור 8 PCRs) (תמונה Eppendorf צינור באדיבות www.clker.com)

איור 3. Agarose ג'ל של צירופי DNA 1and 2 PCR מוצר VNTR

איור 4. . (א) FLA מפת פלייט (ב) FLA קבצי נתונים: *. FSA

איור 5. (א) FLA Chromatogram של בקרה חיובית (NHDP63) עבור 1 לוקוסים שילוב VNTR. (ב) נתונים שיא סורק בגודל amplicon ושפע (GTA) 9

איור 6. השוואה בין דגימות ה-PCR למחשב (NHDP63) עבור מוקד (GTA) 9

איור 7. הראשי פיקס הגמגום עבור (ת"א) 10

איור 8: + A (זנב) סמוך פיקס פיקס ראשי או לגמגם.

איור 9: (ת"א) 18 שיא הראשי, פיקס לגמגם שיא ה-DNA האנושי

איור 10:. (א) דיפרנציאציה הזנים של M. leprae מבוסס על נתונים VNTR (ב) מסננים דיפרנציאציה של M. המבוסס על טביעות אצבע leprae DNA MLVA

Discussion

אוסף דגימות עור מחולים צרעת דורש רופאים מיומנים או טכנאים עובדים במרפאות העור. עובדי המעבדה טיפול דגימות אלה צריכים להקפיד ללבוש חלוקי מעבדה, כפפות ללבוש עין מגן לעבודה בארון ביו בטיחות בעת הטיפול בדגימות של רקמות נגועות אדם או ארמדיל. חיטוי של משטחים וכלים גם קריטי. עבודה ממשלה נקייה, ביו בטוח סטרילי חשוב למניעת זיהום של דגימות DNA.

מיצוי DNA הפכה קלה יחסית הודות לפיתוח של ערכות חילוץ מחברות כמו Qiagen. כיווני חייב להיות אחריו בזהירות. כל הדגימות צריך להישמר קר כאשר אינו בשימוש. הימנע חוזרות ונשנות, שינויי טמפרטורה קיצוניים של הדגימות.

Primers DNA המשמשים בעבודה זו ניתן להזמין מחברות שונות אשר צוטטו ברשימת הפניות ספרות בסוף מאמר זה. יש להקפיד לעבוד עם primers בסביבת ה-DNA בחינם על מנת למנוע זיהום. Primers לבוא כמו אבקה יבשה והוא חייב להיות מעורב עם TE ו מדולל לריכוז 100μM, מופרדים מכן לתוך כמויות קטנות (איור 2 א). פתרונות עבודה של primers הם מדולל יותר לריכוזים 10μM. שוב, אין להשתמש דגימות DNA באזורים / ברדסים שם primers משמשים ומוכן.

מוצרי ה-PCR צריך גם להישמר קר כאשר אינו בשימוש.

הכנה 3% agarose ג'ל ייתן יותר הלהקה ההפרדה DNA, אבל לוקח יותר זמן לרוץ. לענין איכותי בלבד, 2% מספיקה בדרך כלל. פתרון Ethidium ברומיד המשמש מכתים את ה-DNA בשנת agarose ג'ל הוא genotoxin פעיל מאוד, כי הוא נספג דרך העור. טפל זה הפתרון ג'ל מוכתם אותו באמצעות בזהירות רבה, ותמיד להיות בטוח ללבוש כפפות. לשטוף ידיים ביסודיות לאחר כל טיפול דגימות DNA או חומרים ברומיד ethidium. השלך פתרון מכתים ethidium ברומיד, לרחוץ ג'לים בהתאם להנחיות מוסדיים. ג'ל אינם נדרשים באופן שגרתי; שלב זה אפשר לחסל אחת השיטות FLA הוקמו. זה זמן רב מגיב.

הפתרון לפוראמיד המשמשים להכנת דגימות FLA הוא גם רעיל מאוד ויש לטפל בזהירות. רחצו ידיים לאחר השימוש בו. השלך אותו בעקבות הנחיות מוסדיים.

קריאת התוצאות של FLA באמצעות תוכנת סורק שיא יכול להיות מאתגר. סט בסיסי של שיחות האלל (מספר חזרות טנדם) פותחה על CSU (לוחות 4-7). (יצוין כי לוחות 4-7 לא יכול להיות הכל כלול. כמו זנים אחרים של M. leprae נלמדים, אללים עם מספרים להעתיק מחוץ טווחי הרשומים ניתן למצוא.) אתגר אחד מסוים כרוך פסגות "לגמגם". אלו הן משפחות של פסגות, במיוחד של STRs כי רק לערב 2-3 זוג בסיס חוזר, כגון (ת"א) 10. לפעמים בחירה נכונה שיא לקרוא קשה (איור 7). באיור זה, שיא שליטה חיובית 190 נ"ב הוא שיא הראשי. פיקס נמוך בגובה כי הם 2, 4 או אפילו 6 זוגות בסיסים גדולים יותר או קטנים יותר מאשר השיא העיקריים הם בשם "פסגות לגמגם." A-עוקב יכול גם לגרום לבלבול. A-עוקב מתואר בתחילת הטקסט באיור 8. לבסוף, אם PCR מוצרים נפוצים מאוד הדגימות, פסגות עשויה להופיע עם ספייק כפול. במקרה זה, לקרוא למרכז של הטופס שיא. (ראה תרשים 6, החולה 6.)

ניהול נתונים יכולה להיות משימה קשה עבור סוג זה של עבודה. חשוב לתעד כל מידע רלוונטי עבור כל הניסויים, כגון: תאריך של משימה או נוהל, מפעיל, רצועה / צלחת מפות, הזמנות FLA, תנאי PCR ומתכונים, תאריכי ג'לים תצלומים, טמפרטורות האחסון, דילולים תבנית ה-DNA, FLA אחסון קבצים אלקטרוניים מיקומים, וכו 'ארגון טוב וניהול נתונים יכול לחסוך שעות של זמן בילה מחפש חלקים מסוימים של מידע בעתיד.

העבודה במעבדה המתואר כאן נמשך כבר מספר שנים באוניברסיטת קולורדו ו במקומות אחרים ברחבי העולם. תמונה גדולה של מה כל הנתונים שנאספו באמצעות ואיך זה יכול להיות שימוש עתידי מתחיל להתגלות. איורים 10A ו - 10B להדגים כיצד אלה טביעות DNA יכול לשמש כדי להבדיל מ שונות leprae זנים בין המדינות (10A) או אפילו בין משפחות (10 ב). המשפחה והקהילה המקרים קשור הוכחו נושאים מ leprae סוגי זן דומה או זהה VNTR. התקווה היא כי זה עשוי להיות אפשרי להשיג תובנה נוספת במצב (ים) של שידור צרעת כך מערכת לגילוי מוקדם של רשתות שידור עשוי להיות מפותח עבור אותם אנשים חודשלא בסיכון, וכי טיפול תרופתי מרפא יכולים להתחיל לפני נזק נוירולוגי קבוע עור נעשה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
דם DNeasy וקיט רקמות	Qiagen	69504
Multiplex PCR Kit	Qiagen	206143
ה-DNA primers	שונים
Agarose ג'ל	שונים
או 5x 6x טוען ג'ל הצפת	ניו אינגלנד Biolabs	B7021S	זמין כדי להפוך * משלך מתכונים
Ethidium פתרון ברומיד	שונים		מדולל של קון.
Hi-Di לפוראמיד פתרון	Applied Biosystems	4311320
ג'ין סריקה -500 ליז	Applied Biosystems	4322682

ציוד	תגובות
2 מקררים	4 ° C: 1 עבור דגימות DNA, 1 עבור primers ו ריאגנטים Multiplex
1 מיקרוגל	או דרך מתאים לחימום agarose ומים כדי להפוך ג'לים
1 החיטוי	או סיר לחץ לעיקור חומרים
מכונת ה-PCR	Thermocycler
2 סטים של pipettes	0.5-10 μl, 10-100 μl, 20-200 μl, 1000 להגדיר μl 1 עבור primers, 1 להגדיר עבור ה-DNA
ג'ל אלקטרופורזה תיבת הצוללת	עם טפסים מסרקים עבור הכנת ג'ל.
אספקת החשמל אלקטרופורזה	עם כבלים לחיבור תיבת ג'ל
מחממים לחסום	עבור Eppendorf צינורות
סרכזת	עבור צינורות Eppendorf / רצועות
אלקטרופורזה מערכת נימית (מנתח גנטי)	או גישה למוסד כי ניתן לבצע את הניתוח הזה
פלסטיקה	פנויה אירוסול פיפטה טיפים, Eppendorf צינורות, רצועות 8-היטב, צלחות 96-טוב, כמה איכות אופטית
מחשב עם חיבור לאינטרנט