Impressões Digitais de DNA de Mycobacterium leprae Estirpes Usando Repita Tandem número variável (VNTR) - Análise Fragmento (FLA)

Resumo

Hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, Ainda é endêmica em muitos lugares. A fim de aprender sobre a propagação e modo de transmissão da hanseníase, é importante para determinar qual a tensão de M. leprae Contaminou um paciente. Número variável de repetições em tandem (VNTR) a digitação é um tal método.

Resumo

O estudo da transmissão da hanseníase é particularmente difícil, pois o agente causador, o Mycobacterium leprae, não podem ser cultivadas em laboratório. As únicas fontes de bactérias são pacientes de hanseníase, e tatus infectados experimentalmente e camundongos nude. Assim, muitos dos métodos utilizados em epidemiologia moderna não estão disponíveis para o estudo da hanseníase. Apesar de um programa de tratamento global de drogas extensa para a lepra implementado pela OMS ^1, a hanseníase ainda é endêmica em muitos países, com aproximadamente 250.000 casos novos a cada ano. ² A M. inteira leprae genoma foi mapeado ^3,4 e muitos loci foram identificados que têm repetido segmentos de 2 ou mais pares de bases (chamada de micro e minissatélites). ⁵ cepas clínicas de M. leprae podem variar no número de segmentos em tandem repetidas (repetições em tandem curtas, STR) em muitos destes loci. ^5,6,7 tandem repeat número variável (VNTR) ⁵ análise tem sido utilizada para distinguir diferentes cepas do bacilo da lepra. Alguns dos loci parecem ser mais estáveis ​​do que outros, mostrando uma menor variação no número de repetir, enquanto outros parecem mudar mais rapidamente, às vezes em um mesmo paciente. Enquanto a variabilidade dos VNTRs certas trouxe à tona questões sobre a sua adequação para a digitação tensão ^7,8,9, os dados emergentes sugerem que a análise de múltiplos locais, que são diferentes em sua estabilidade, pode ser usado como uma valiosa ferramenta epidemiológica. Múltiplos lócus VNTR análise (MLVA) ¹⁰ tem sido usado para estudar a evolução da hanseníase e de transmissão em vários países, incluindo China ^11,12, Malawi ^8, Filipinas ^10,13, e Brasil ^14. MLVA envolve várias etapas. Primeiro, o DNA bacteriano é extraído juntamente com o DNA do hospedeiro de tecido de biópsias clínicas ou manchas da pele de fenda (SSS). ¹⁰ O loci desejado são amplificados a partir do DNA extraído por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR). Primers fluorescentes marcado por 4-5 loci diferentes são usados ​​por reação, com 18 loci sendo amplificado em um total de quatro reações. ¹⁰ Os produtos de PCR pode ser submetido a eletroforese em gel de agarose para verificar a presença dos segmentos de DNA desejado, e então submetidos para análise fluorescentes fragmento de comprimento (FLA), utilizando eletroforese capilar. DNA de bactérias tatu várias passagens com um número conhecido de cópias de repetição para cada locus é usado como um controle positivo. Os cromatogramas FLA são então analisados ​​usando o software de scanner de pico e de comprimento de fragmentos é convertido em número de cópias VNTR (alelo). Finalmente, os haplótipos VNTR são analisados ​​por padrões, e quando combinados com os dados clínicos do paciente pode ser usado para controlar distribuição dos tipos de tensão.

Protocolo

O objetivo deste artigo vídeo é fornecer uma visão geral do fluxo de trabalho, juntamente com formato de dados e interpretação para os pesquisadores que pode ser apenas a partir deste tipo de trabalho (Figura 1). Ele inclui demonstração de técnicas, protocolos simplificados e dicas práticas descritas nas obras publicadas anteriormente. ^5,10

Fluxo de Trabalho em geral e instalações de laboratório:

Deve haver pelo menos três áreas de trabalho separadas para esse tipo de pesquisa. O laboratório deve ter 1) uma área pré-PCR com um capuz PCR (caixa de ar limpo ou área de trabalho isolada) para a preparação de primer (diluição, preparo e mistura da alíquota), 2) um gabinete de bio-seguro, separado para o manuseio e adição de DNA para as misturas PCR, e 3) uma área de trabalho pós-PCR para a preparação e carregamento de géis e para a preparação de amostras para FLA. Primers e amostras de DNA deve ser mantido em separado freezers e refrigeradores. Contaminação Primer é um dos principais problemas e mais persistentes no trabalho de laboratório deste tipo. Pipetas usadas para primers e mistura PCR não devem ser usadas para o DNA. Deve haver duas séries de pipetas para a pré-PCR, PCR e áreas de pós-PCR trabalho. Geralmente, um pesquisador pode processar 18/12 amostras em um período de 12-24 horas usando o equipamento padrão de laboratório.

Antes de começar cada fase do trabalho:

• Vestir um jaleco e luvas. Devem ser usadas luvas qualquer momento amostras biológicas, primers, DNA e brometo de etídio estão sendo manipulados. Mudar de luvas com freqüência.
• Trabalho em uma capa de gabinete PCR, biossegurança gabinete ou local de trabalho limpo.
• Use um papel de banco frescos ou almofada.
• Configurar recipientes adequados para resíduos líquidos e ponteiras.
• Limpe-se com o interior do exaustor PCR e pipetas com etanol 70%.
• Pipetas assunto e área de trabalho à luz UV por 15 minutos antes PCR configurar. (Ultravioleta luz ligações cruzadas contaminantes DNA superfície.)
• Sempre usar dicas de prevenção aerosol pipeta para materiais que contenham DNA, primers e reagentes PCR.
• Centrifugar todos os tubos / tiras / placas contendo líquido antes de abrir para impedir a fuga de aerossóis e contaminação cruzada por manuseio.

1. M. leprae preparação DNA

Amostras clínicas contendo M. leprae são obtidas de pacientes com hanseníase que visitam clínicas de pele. Rotina de amostras de diagnóstico pode ser biópsias de pele soco, manchas de pele cortada ou swab nasal. Geralmente, por punch ou manchas da pele fendas são os melhores para a epidemiologia molecular, porque eles são limpos e contêm quantidades suficientes de M. leprae. Utilização destes materiais para pesquisa deve ser aprovado de acordo com as diretrizes institucionais.

1. Preservar amostras de biópsia ou fenda esfregaço de pele em um frasco com tampa de rosca com 1 ml de etanol 70%.
2. Centrífuga cada amostra em uma velocidade variável centrífuga de bancada a 12.000 xg por 15 minutos.
3. Remover o sobrenadante e colocá-lo em um tubo de microcentrífuga. Se necessário, pode ser útil para re-centrífuga estas amostras e recuperar o tecido adicional ou DNA mais tarde.
4. Adicionar mL 500 de tampão fosfato salino (PBS) para as amostras de tecido e deixe de molho por uma hora de trocar conservante etanol residual e reidratar a amostra.
5. Centrifugar as amostras em uma centrífuga de bancada a 12.000 xg por 20 minutos. Descartar a solução PBS em um recipiente parcialmente preenchido com solução desinfetante.
6. Extrair DNA de bactérias usando a Qiagen Sangue Dneasy e kit Tissue seguindo as orientações prescritas.
7. DNA extraído deve ser aliquotado em 4 frascos. Loja 2 alíquotas a -80 ° C para uso futuro, se / quando a reprodutibilidade dos resultados dos testes é necessário ou quando novas tecnologias se tornam disponíveis. Alíquota de uma loja a -20 ° C e uma temperatura de 4 ° C para uso mais imediato.
8. É prudente preparar um "branco de extração", juntamente com as amostras de tecido. O branco é submetido a todos os mesmos tratamentos descritos acima, mas é realizada sem tecido. PCR em branco, juntamente com a extração de amostras de pacientes para garantir que a técnica do operador de extração é correta e que os reagentes estão livres de contaminação de DNA.

2. Preparação Primer

1. Primers para os loci para os quais não são o tipo de dados mais extensa tensão estão listadas na Tabela 1. Quatro ou cinco primers são combinados para multiplex PCR. Uma cartilha para cada locus carrega a 5 tag 'químicos fluorescentes que será detectado durante a análise capilar de comprimento eletroforese fragmento (FLA).
2. Para cada combinação de multiplex PCR, a cartilha marcados e primer reverso correspondentes para cada lócus são combinados em tubos separados Eppendorf: primers para a frente em um tubo, reverter em outro. Primers ações são preparadas como soluções 100μM (Figura 2a), uma parte dos quaisé diluído 10x para uma concentração de 10 mM com TE (Tris-EDTA 1x, pH 8,0). Alíquotas remanescentes das 100 mM de primer soluções são armazenadas a -20 ° C para uso posterior.
3. Quantidades iguais de cada primer M 10 são mistos, resultando em concentrações 2μM final de cada primer. Quando a combinações de primers são adicionados à mistura de PCR (Tabela 3), a concentração final de cada primer cai para 0,2 mM.

Quando o primers combinados são adicionados às misturas PCR (Tabela 3), as concentrações finais cair para 0,2 Hm cada.

3. DNA bacteriano ampliando usando PCR multiplex

1. PCR Setup
   • Registrar o número de amostras que serão utilizados e preparar uma planilha com os reagentes necessários e seus volumes antes de recolher os plásticos e outros materiais necessários.
   • Rotular os tubos estéreis / tiras / chapas a serem utilizados para a PCR com os números da amostra. Lembre-se de incluir controles positivos e negativos.
2. Limpar o termociclador com uma solução de limpeza (como Decon ELIMINase) e programá-lo de acordo com a Tabela 2. Mudar de luvas após a limpeza e antes de manusear primers e outros reagentes.
3. Prepare PCR Mastermix acordo com a Tabela 3 e rotular os tubos de PCR / tiras / placa com a combinação de primer e números de amostra a ser utilizada.
4. Alíquota de 18μl Mastermix a cada tubo rotulado amostra PCR ou bem. Mudar de luvas.
5. Limpe um gabinete de biossegurança em separado e pipetas com etanol 70% para ajudar a limpar e desinfectar a área de trabalho e ferramentas, então sujeitas a área de trabalho e pipetas à luz UV por 15 minutos para atravessar-link quaisquer contaminantes DNA. Mudar de luvas.
6. No gabinete do bio-seguro e limpo, adicione 2μl do molde de DNA à Mastermix em cada tubo de PCR / placa bem a adquirir um volume total de 20μl (Figura 2b). Use dicas aerosol pipeta de prevenção para todos os materiais líquidos.
7. Centrifugue os tubos PCR / tiras / placas brevemente para misturar o conteúdo.
8. Coloque os tubos de amostra / tiras / placa no termociclador e iniciar o programa de PCR.
9. Quando o programa estiver concluído, retire os produtos do termociclador e armazenar a 4 ° C até eletroforese.

4. Eletroforese em gel de PCR produtos

* Este protocolo foi padrão por muitos anos e é um passo opcional que pode ser empregado se a confirmação da PCR produtos é desejado antes de enviá-los para FLA.

1. Em uma área de trabalho separada pós-PCR, prepare a 2% gel agarose. Use 2,0 g de agarose powder/100ml de 1x TBE (Tris / Borato / EDTA) solução tampão em um frasco. Aqueça a mistura por cerca de 1,5-2 minutos em um forno de microondas. Agitar o conteúdo, aquecimento novamente se necessário para dissolver a agarose. Deixe esfriar um pouco e despeje o gel em um formulário usando um pente com poços suficiente para as amostras.
2. Remover os produtos de PCR de 4 ° C e centrifugar por cerca de 30 segundos.
3. Mix 2-5μl de produto de PCR com 0,5-1μl de tampão 5x ou 6x gel loading (buffer Carregando está disponível de várias empresas, ou podem ser misturados no laboratório. Receitas estão disponíveis online.)
4. Os poços do gel com a mistura de buffer 6μl amostra / carregamento. Adicionar uma escada molecular de um bem (de preferência a 20 bp ladder).
5. Executar o gel em 100V por aproximadamente 90 minutos.
6. Embeber o gel em solução de brometo de etídio por 15-30 minutos, depois com água destilada ultrapura para uma quantidade igual de tempo.
7. A imagem do gel enquanto a luz UV é aplicada. Não deve ser uma banda para cada um dos segmentos de DNA 4-5 na combinação (Figura 3).
8. Elimine o gel de acordo com a política da instituição de materiais perigosos. Solução de brometo de etídeo pode ser usado várias vezes antes do descarte adequado.

5. Preparando amostras para análise de comprimento de fragmentos (FLA)

1. Em um tubo Eppendorf limpo, prepare uma mistura master contendo 12μl de Hi-Di solução formamida a partir de uma alíquota fresca e 0.3μl de GeneScan -500 LIZ dimensionamento padrão (ambos da Applied Biosystems) para cada amostra a ser testada. (Hi-Di formamida quimicamente desnatura as fitas de DNA antes de eletroforese capilar, eliminando a necessidade de aquecimento.) Usando uma placa de 96 poços de reação óptica de qualidade, 12.3μl alíquota do mix formamida-LIZ a cada poço a ser utilizado para amostras e definir o prato de lado.
2. Faça um mapa da placa para seus registros indicando que amostras de DNA é em cada poço (Figura 4a).
3. Utilizando tubos / tiras ou uma placa de 96 poços, adicionar 1μl do produto da PCR (da parte 3) para 59μl de PCR de qualidade da água criando uma diluição de 1:60 do produto da PCR. Diluições podem ser ajustada com base na intensidade do sinal a partir dos dados FLA ou o brilho das bandas de gel. Concentrações ainda menores de DNA podeser suficiente (1:120 ou 1:180).
4. Adicionar 1μl do produto da PCR diluído para o correto bem na placa contendo a mistura de formamida-LIZ.
5. Velocidade e eficiência pode ser muito maior se a PCR também foi feito em uma placa de 96 poços. Pode-se simplesmente line up 3 placas em seqüência como: Placa 1 com produtos de PCR, Placa 2 com água estéril para a diluição dos produtos de PCR, e Placa 3 com formamida e escada de dimensionamento para a análise do comprimento do fragmento. A pipeta multicanal permite um processo rápido de preparação FLA.

Análise de amostra via Analyzer genética

6. Calibrar o Genetic Analyzer detectar a flurophores aplicada por instrução do fabricante. Tenha certeza de usar uma tinta que inclui set-LIZ.
7. Repor a água da lavagem de contentores e adicionar tampão de corrida novo com EDTA (1x) (Applied Biosystems) para o buffer câmaras.
8. Adicionar um pré-fenda septo de silicone para a placa e colocar a placa na bandeja segurando projetado. Pressione o "Bandeja" botão no Genetic Analyzer para trazer o atacante amostrador automático. Coloque a bandeja para amostrador automático e fechar a porta para o Analisador de Genética.
9. Criar ou importar uma planilha para a análise. Arquivos importáveis ​​têm uma extensão. Plt e estão em formato delimitado por tabulação. Os arquivos podem ser modificados no Excel (Microsoft) ou programas similares.
10. As amostras são injetadas no capilar (comprimento 50 cm, POP-7 polímero) pela aplicação de uma injeção de tensão de 1,6 kV para 15 s. A eletroforese capilar é executado em uma tensão de 15 kV a 60 ° C para 1800 segundos. O processo inteiro leva cerca de 45 minutos.
11. Uma vez que uma corrida é completa, os dados de cada amostra analisada são convertidos em arquivos com uma extensão de fsa. E colocado em uma pasta de arquivo da placa (Figura 4b). Cada arquivo de dados é de aproximadamente 100 KB de tamanho e pode ser armazenado em uma unidade flash ou compactado e enviado por email. Arquivos de dados podem ser visualizados usando software adequado, como GeneMapper ABI ou Scanner Peak.

6. Análise dos resultados de comprimento de fragmentos

1. Análise dos dados de eletroforese capilar fluorescente requer software especial. Se esse software não está disponível, vá ao site da Applied Biosystems e baixar Scanner Peak. O software é gratuito e funciona muito bem. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. Scanner Peak aberto e 'Start New Project "seguido de" Add Files ". Carregar o selecionado. Fsa arquivos de dados no programa, incluindo os controles positivos e negativos.
3. Selecione (destaque) e "analisar" todos os arquivos carregados. Certifique-se de cada amostra é definida como "Standard Tamanho: GS500 (-250) e Método de Análise:. Dimensionamento Default-pp Imprensa" Analisar ".
4. Examine o tamanho em pares de base de cada pico coloridas produzidas por fragmentos de DNA nas amostras.
5. Registro de cada valor de tamanho máximo em pares de base e compará-lo com o pico de controle positivo.
6. Picos nas amostras de controlo positivo deve se comparam favoravelmente com os números de pares de base e os números correspondentes de repetições em tandem listados nas Tabelas 4-7.
7. Determinar quantos segmentos de repetição em tandem curtos estão presentes em cada alelo da amostra por comparação com o controle positivo. Usamos NHDP63 que foi seqüenciado para o número de cópias em cada locus VNTR sendo examinada. ⁴
8. Digite os dados registrados em uma planilha para análises comparativas e / ou matemática. 'Impressões digitais' VNTR ou haplótipos, são seqüências de alelos em loci definidos que são característicos de um M. leprae tensão.

7. Resultados representante

Eletroforese em gel dos produtos de PCR, esperamos produzir uma banda para cada loco na combinação primer (Figura 3). Na Figura 3, há duas seções para o gel: a seção superior tem uma combinação amostras PCR ea porção inferior Combinação 2 amostras. Cada seção contém uma escada 20 pares de base molecular, seguido por produtos de PCR obtidos a partir de 8 amostras de pacientes. Uma combinação também tem um controle negativo e, finalmente, o controle positivo (NHDP63 tensão). (Os controles para a combinação 2 foram em um gel diferente.) Note que a maioria das amostras de mostrar claramente cinco bandas, uma para cada lugar na combinação. Em alguns casos, as faixas podem ser muito próximas umas das outras para aparecer como loci separados resultando no aparecimento de apenas 4 bandas.

Amplicon tamanhos esperados estão listados na Tabela 1. Nosso laboratório emprega NHDP63 cepa de M. leprae como um controle positivo. Dois tipos de segmentos de repetição foram estudados: loci microssatélites (com 1-5 repete base) e loci minissatélite (com segmentos superior a 5 pares de bases repetidas várias vezes). ⁵

Interpretação dos arquivos de dados de eletroforese capilar depende de dois padrões: um fragmento de DNA interna dimensionamento padrão chamado GeneScan-500LIZ (ABI) e uma amostra controle externo positivo de amplificação do DNA bacteriano.

Os cromatogramas FLA, visto usando software Scanner Peak, pode ser visto nas Figuras 5A, 5B e 6.

Scanner de pico fornece dados sobre o tamanho amplicon (eixo-x em pares de bases) e intensidade do sinal (eixo y). (Figura 5b) Dados adicionais sobre a área do pico, etc também estão disponíveis, embora o tamanho e os valores da altura dos picos são mais importantes. Picos menos de 100 unidades de altura são geralmente considerado muito fraco sinal para ser confiável.

Figura 6 compara o controle positivo (NHDP63) e duas amostras de pacientes, mostrando uma variação no número de repetições em tandem no locus (GTA) 9. No controle positivo, a seqüência (GTA) é repetido 10 vezes. O VNTR NHDP63 e tamanho amplicon foram verificados por meio do seqüenciamento genético. 4 paciente PCR amplicon é de 3 pb menor do que o controlo positivo indicando existem apenas 9 unidades de repetição, enquanto paciente 6 tem um amplicon que é de 3 bp maior do que NHDP63 revelando repetições de 11 (GTA). Paciente 2 teve índice baixo bacteriana (BI) com pouca ou nenhuma replicação PCR DNA, portanto, nenhum sinal de FLA.

Dificuldade na interpretação dos dados FLA, por vezes, ocorre como resultado da "gagueira". Durante a reação de PCR, o DNA polimerase pode produzir fragmentos que são um ou mais se repete mais ou menos do que o alelo fonte. Estes são geralmente reconhecidos como picos de menor altura ao redor do pico principal. Eles serão 'na escada ", isto é, o número correto de pares de bases do segmento de repetição maior ou menor que o pico principal. O resultado é uma família de picos da mesma cor. Figura 7 mostra isso com locus (TA) 10.

Outra dificuldade, às vezes encontrados com FLA envolve '+ A' ou 'A-rejeito, em que a DNA polimerase adiciona uma única base [geralmente adenina (A)] para terminar a 3' do segmento de DNA copiado. Este aparece em FLA como um pico à direita de um pico principal ou gaguejar que é um par de base maior do que o pico adjacentes, como mostrado na Figura 8. Não deve ser confundido com um pico principal ou gaguejar. Um pico principal e seus A cauda são considerados uma única espécie. A cauda não altera o número de repetições VNTR. (Alguns kits DNA polimerase são projetados especificamente para promover a A-rejeito, a fim de reduzir este efeito de confusão. Promoção de A a cauda tende a produzir um único pico, em vez de um par de picos).

A extração de DNA e produtos de PCR contêm tanto M. leprae e DNA humano, porém com exceção do (TA) 18, os primers são específicos o suficiente para que eles só amplificar o DNA bacteriano, e há pouca ou nenhuma amplificação do DNA humano. (TA) 18 vezes produz um pico de 242 pares de base que é a partir de DNA humano e não é visto em amostras de tatu várias passagens DNA (Figura 9).

A vida útil de primers é geralmente boa, desde que sejam mantidas a -20 ° C, apenas removido para uso imediato, e armazenado a 4 ° C até consumido. Primers deve ser estável a 4 ° C por 1-2 semanas. Apesar de fazer combinações de primers para PCR é um pouco demorado, recomenda-se que apenas uma combinação de primer suficiente para uso imediato estar preparado. Combinações de primers parecem degradar um pouco quando armazenadas por longos períodos.

TE deve ser aliquotado de ações maiores, e as alíquotas podem ser armazenadas congeladas ou em temperatura ambiente. Alíquotas maiores de 200-400μl são bons para diluir estoques cartilha secas ou concentrado (Figura 2a). Alíquotas menores de 10-50 mL são úteis para complementar os volumes de combinações de primers 3 e 4. TE é barato e alíquotas devem ser descartados após o uso.

Kits enzima Multiplex são muito caros e devem ser mantidos congelados (-20 ° C) até o uso. Após o preparo PCR, todas as soluções multiplex deve ser devolvido imediatamente a 4 ° C. O pequeno Multiplex PCR Qiagen Kit vem com 3 tubos de mix multiplex, cada um contendo 0.85ml (850μl) de solução; suficiente para cerca de 65-70 PCRs.

Geralmente, o melhor é evitar a repetição, mudanças de temperatura maior para os materiais utilizados neste tipo de trabalho de laboratório, incluindo as amostras de DNA, primers e soluções kit multiplex. Todos os materiais devem ser armazenadas a -20 ° C até ser necessário, em seguida, mantido a 4 ° C até consumido. Armazenamento a longo prazo de DNA deve ser a -80 ° C.

Todos os materiais que contenham gastos tecido, primers e / ou DNA deve ser autoclavado e descartado quando não mais de qualquer uso. Todas as amostras tratadascom brometo de etídio ou formamida devem ser tratados como resíduos perigosos e eliminados de acordo com a política da instituição de materiais perigosos.

Tabela 1: Tamanhos Amplicon para tensão NHDP63

Tabela 2: Parâmetros para Ciclismo VNTR PCR

Tabela 3: Preparação de PCR

Tabela 4: Chamadas para combinação dos alelos 1

Tabela 5: Chamadas alélica para Combinação 2

Tabela 6: Chamadas para combinação dos alelos 3

Tabela 7: Chamadas para combinação dos alelos 4

Figura 1: VNTR-FLA Diagrama de Fluxo de Processo

Figura 2. (A) Preparação de Primers Combinação uma superior (Eppendorf cortesia do tubo de imagem de www.clker.com ). (B) Setup PCR (para 8 PCRs) (Eppendorf cortesia do tubo de imagem de www.clker.com)

Figura 3. Gel de agarose de 2 Combinações VNTR 1 e DNA produto da PCR

Figura 4. . (A) FLA Placa Mapa (b) os arquivos FLA dados: *. fsa

Figura 5. (A) Cromatograma FLA de Controle Positivo (NHDP63) para loci VNTR Combinação 1. (B) os dados Scanner Peak para o tamanho do amplicon e abundância de (GTA) 9

Figura 6. Comparação das amostras de PCR para o PC (NHDP63) para locus (GTA) 9

Figura 7. Principais Picos para Stutter (TA) 10

Figura 8: A + (A-tail) Peaks Adjacente ao Peaks principal ou Stutter.

Figura 9: (TA) 18 de pico principal, Stutter Peaks e Peak DNA Humano

Figura 10:. (A) Diferenciação Strain do M. leprae com base em dados VNTR Diferenciação Strain (B) de M. leprae com base no DNA Fingerprint MLVA

Discussão

A coleta de amostras de pele de pacientes com hanseníase exige clínicos qualificados ou técnicos que trabalham em clínicas da pele. Pessoal de laboratório manipulando essas amostras devem tomar muito cuidado para vestir jalecos, luvas e óculos de proteção e de trabalhar em um gabinete de bio-segurança ao manusear amostras de tecido humano infectado ou tatu. Desinfecção de superfícies e ferramentas também é crítica. Trabalhando em um ambiente limpo, gabinete bio-segurança estéril é importante para evitar a contaminação de amostras de DNA.

Extração de DNA tornou-se relativamente fácil, graças ao desenvolvimento de kits de extração de empresas como a Qiagen. Direções devem ser seguidas rigorosamente. Todas as amostras devem ser mantidas frio quando não em uso. Evite a repetição, mudanças extremas de temperatura para as amostras.

Primers DNA utilizado neste trabalho pode ser encomendado a partir de várias empresas que foram citadas na lista de referências bibliográficas no final deste artigo. Cuidados devem ser tomados para trabalhar com primers de DNA em um ambiente livre, a fim de evitar a contaminação. Primers vir na forma de pó seco e deve ser misturado com TE e diluído a uma concentração 100μM, em seguida, separada em quantidades menores (Figura 2a). Soluções de trabalho de primers são ainda mais diluído em concentrações 10μM. Mais uma vez, não usam amostras de DNA em áreas / capuzes onde primers são usados ​​e preparados.

Os produtos de PCR também deve ser mantido frio quando não em uso.

A 3% agarose gel preparação dará melhor separação da banda DNA, mas demora mais tempo para ser executado. Para fins puramente qualitativa, 2% é geralmente suficiente. Solução de brometo de etídio utilizado para a coloração do DNA em gel de agarose é um genotoxin altamente ativa que é absorvida através da pele. Lidar com esta solução e géis corados com ele usando muito cuidado e sempre tendo a certeza de usar luvas. Lave bem as mãos após manusear qualquer DNA de amostras ou materiais brometo de etídio. Dispor de etídio solução corante brometo, lave e géis de acordo com as diretrizes institucionais. Géis não são rotineiramente necessárias; esta etapa pode ser eliminada de uma vez métodos FLA foram estabelecidas. É tempo e consumindo reagente.

A solução formamida utilizados na preparação de amostras para FLA também é altamente tóxico e deve ser manuseado com cuidado. Lavar as mãos após o uso. Descartá-lo seguindo as diretrizes institucionais.

Leitura dos resultados da FLA usando o software de scanner de pico pode ser desafiador. Um conjunto básico de chamadas alelos (número de repetições em tandem) foi desenvolvido no CSU (Tabelas 4-7). (Note-se que os quadros 07/04 pode não ser tudo incluído. Como outras cepas de M. leprae são estudados, os alelos com números de cópia fora dos intervalos listados podem ser encontrados.) Um desafio particular envolve 'gaguejar' picos. São famílias de picos, especialmente dos STRs que envolvem apenas repete 2-3 pares de base, tais como (TA) 10. Às vezes, selecionando o pico correto de ler é difícil (Figura 7). Nesta figura, o pico no controle positivo em 190 bp é o pico principal. Picos mais baixos de altura que são 2, 4 ou mesmo 6 pares de bases maiores ou menores do que o pico principal são chamados "picos de gaguejar." A-rejeito também pode causar confusão. A-rejeito é descrito anteriormente no texto e na Figura 8. Finalmente, se produtos de PCR são muito abundantes nas amostras, os picos podem aparecer com um pico duplo. Neste caso, leia o centro do pico de forma. (Veja a Figura 6, paciente 6).

Gerenciamento de dados pode ser uma tarefa formidável para esse tipo de trabalho. É importante registrar todas as informações pertinentes para todos os experimentos, tais como: data de uma tarefa ou procedimento, a operadora, tira / chapa de mapas, ordens FLA, as condições de PCR e receitas, datas de géis e fotografias, temperaturas de armazenamento, diluições modelo de DNA, FLA locais de armazenamento de arquivo eletrônico, etc Uma boa organização e gerenciamento de dados podem salvar horas de tempo gasto à procura de informações específicas no futuro.

O trabalho de laboratório descritas aqui vem acontecendo há vários anos na Colorado State University e em outras localidades ao redor do mundo. O grande retrato do que todos os dados coletados significa e como ela pode ser de uso futuro está começando a emergir. Figuras 10A e 10B demonstram como estas impressões digitais de DNA pode ser usado para distinguir diferentes M. leprae tensões entre países (10A) ou mesmo entre as famílias (10B). Família e na comunidade casos relacionados foram mostrados para transportar M. leprae de tipos de tensão semelhante ou idêntico VNTR. A esperança é que isso pode ser possível obter mais conhecimentos sobre o modo (s) de transmissão da hanseníase para que um sistema de detecção precoce de redes de transmissão pode ser desenvolvida para aqueles mos pessoast em risco, e que a terapia de droga curativa pode começar antes que os danos neurológicos e dermatológicos permanente é feito.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Sangue Dneasy e Kit Tissue	Qiagen	69504
Multiplex PCR Kit	Qiagen	206143
Primers do DNA	Vários
Gel de agarose	Vários
Tampão de carregamento 5x ou 6x Gel	New England Biolabs	B7021S	Receitas disponíveis para fazer a sua própria *
Solução de brometo de etídio	Vários		Diluir de con.
Oi-Di Solução Formamida	Applied Biosystems	4311320
Gene digitalização -500 LIZ	Applied Biosystems	4322682

Equipamento	Comentários
2 Refrigeradores	4 ° C: 1 para amostras de DNA, 1 de primers e reagentes Multiplex
Um forno de microondas	Ou uma maneira adequada para o aquecimento agarose e água para fazer géis
Uma autoclave	Ou panela de pressão para esterilizar materiais
Máquina de PCR	Termociclador
2 conjuntos de pipetas	0,5-10 mL, 10-100 mL, 2-20 mL, 1000 set 1 ml de primers, um conjunto de DNA
Caixa de eletroforese em gel de submarinos	Com formas e pentes para preparar géis.
Fonte de alimentação de eletroforese	Com cabos para ligação à caixa de gel
Bloco de aquecimento	Para tubos Eppendorf
Centrifugador	Para tubos Eppendorf / tiras
Sistema de eletroforese capilar (analisador de genética)	Ou o acesso a uma instituição que pode realizar esta análise
Plásticos	Descartáveis ​​aerosol ponteiras, tubos Eppendorf, tiras de 8 poços, placas de 96 poços, alguns de qualidade óptica
Computador com ligação à Internet