Снятие отпечатков пальцев ДНК из Микобактерии лепры Штаммы Использование переменных Повторите Тандем номер (VNTR) - Анализ фрагментов Длина (FLA)

Резюме

Проказа, вызванных Микобактерии лепры, По-прежнему эндемичных во многих местах. Для того, чтобы узнать о распространении и способ передачи инфекции от проказы, важно определить, какой штамм М. лепры Заразил пациента. Переменная числа тандемных повторов (VNTR) набрав является одним из таких методов.

Аннотация

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory. The only sources of the bacteria are leprosy patients, and experimentally infected armadillos and nude mice. Thus, many of the methods used in modern epidemiology are not available for the study of leprosy. Despite an extensive global drug treatment program for leprosy implemented by the WHO¹, leprosy remains endemic in many countries with approximately 250,000 new cases each year.² The entire M. leprae genome has been mapped^3,4 and many loci have been identified that have repeated segments of 2 or more base pairs (called micro- and minisatellites).⁵ Clinical strains of M. leprae may vary in the number of tandem repeated segments (short tandem repeats, STR) at many of these loci.^5,6,7 Variable number tandem repeat (VNTR)⁵ analysis has been used to distinguish different strains of the leprosy bacilli. Some of the loci appear to be more stable than others, showing less variation in repeat numbers, while others seem to change more rapidly, sometimes in the same patient. While the variability of certain VNTRs has brought up questions regarding their suitability for strain typing^7,8,9, the emerging data suggest that analyzing multiple loci, which are diverse in their stability, can be used as a valuable epidemiological tool. Multiple locus VNTR analysis (MLVA)¹⁰ has been used to study leprosy evolution and transmission in several countries including China^11,12, Malawi⁸, the Philippines^10,13, and Brazil¹⁴. MLVA involves multiple steps. First, bacterial DNA is extracted along with host tissue DNA from clinical biopsies or slit skin smears (SSS).¹⁰ The desired loci are then amplified from the extracted DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescently-labeled primers for 4-5 different loci are used per reaction, with 18 loci being amplified in a total of four reactions.¹⁰ The PCR products may be subjected to agarose gel electrophoresis to verify the presence of the desired DNA segments, and then submitted for fluorescent fragment length analysis (FLA) using capillary electrophoresis. DNA from armadillo passaged bacteria with a known number of repeat copies for each locus is used as a positive control. The FLA chromatograms are then examined using Peak Scanner software and fragment length is converted to number of VNTR copies (allele). Finally, the VNTR haplotypes are analyzed for patterns, and when combined with patient clinical data can be used to track distribution of strain types.

протокол

Целью этого видео статьи является дать обзор работы потока наряду с форматом и интерпретации данных для исследователей, которые могут быть просто начиная с этого вида работы (рис. 1). Она включает в себя демонстрацию техники, упрощенные протоколы и практические советы описаны в ранее опубликованных работ. ^5,10

Общий поток работы и лабораторное оборудование:

Там должно быть не менее 3 отдельные рабочие зоны для такого рода исследований. В лаборатории должен быть 1) предварительно ПЦР области с капюшоном ПЦР (чистое поле воздуха или изолированной рабочей зоны) для грунтовки подготовки (разведение, подготовка аликвоты и смешивание), 2) отдельных биологически безопасной шкаф для обработки и добавления ДНК для ПЦР-смеси, и 3) пост-ПЦР рабочей области для подготовки и загрузки гели и для подготовки образцов для FLA. Грунты и образцы ДНК должны храниться в отдельных морозильники и холодильники. Грунтовка загрязнения является одной из главных и самых постоянных проблем в лабораторной работе этого типа. Пипетки для праймеров и ПЦР-смеси не должны быть использованы для ДНК. Там должны быть отдельные комплекты пипетки для предварительного ПЦР, ПЦР и пост-ПЦР рабочих зон. Как правило, один исследователь может обработать 12-18 образцов в 12-24 часов с использованием стандартного лабораторного оборудования.

Перед началом каждого этапа работы:

• Надевайте халат и перчатки. Перчатки необходимо надевать в любое время биологических образцов, грунтовки, ДНК и бромистый этидий решаются. Изменение перчатки часто.
• Работа в капот ПЦР-кабинет, кабинет биологической безопасности или чистой зоне работы.
• Используйте свежие бумаги на столе или панели.
• Настройка отходов сосудам, подходящая для жидкостей и наконечники пипеток.
• Протрите внутреннюю часть капота ПЦР и пипетки с 70% этанола.
• Тема пипетки и рабочей области для ультрафиолетового света за 15 минут до ПЦР создана. (Ультрафиолетовый свет сшивки загрязнения поверхности ДНК.)
• Всегда используйте аэрозольные предотвращения наконечники для материалов, содержащих ДНК, грунтовки и ПЦР реагентов.
• Центрифуга любые трубы / полосы / чашки, содержащие жидкости, прежде чем открыть, чтобы предотвратить выход аэрозоля и перекрестного загрязнений путем обработки.

1. М. лепры препарата ДНК

Клинические образцы, содержащие М. лепры получаются из больных лепрой, которые посещают кожи клиник. Рутинное диагностические пробы могут быть кожа удар биопсия, мазки щели кожи или носовые тампоны. Как правило, удар биопсии или мазков разрезами кожи лучше всего подходит для молекулярной эпидемиологии, потому что они чисты и содержать достаточное количество M. лепры. Использование этих материалов для исследования должны быть одобрены в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

1. Заповедник биопсии или щели образцы кожи Папаниколау в завинчивающейся крышкой флакон с 1 мл 70% этанола.
2. Центрифуга каждого образца в переменной скоростью настольная центрифуга на 12 000 мкг в течение 15 минут.
3. Удалить супернатант и поместить его в микроцентрифужных трубки. При необходимости он может быть полезным для повторного центрифуги эти образцы и восстановить дополнительные тканей или ДНК позже.
4. Добавить 500 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) в образцах тканей и выдержите в течение 1 часа для обмена остаточной консерванта этанола и увлажняет образца.
5. Центрифуга образцов в настольные центрифуги при 12000 мкг в течение 20 минут. Отменить решение PBS в контейнер для отходов, частично заполненной дезинфицирующим раствором.
6. Извлечение бактериальной ДНК с использованием крови Qiagen DNEasy и тканей комплект следующих принципов предписано.
7. Извлеченные ДНК должны быть аликвоты на 4 ампул. Магазин 2 аликвоты при -80 ° C для использования в будущем, если / когда воспроизводимость результатов испытаний требуется или когда новые технологии становятся доступными. Храните одну аликвоту при температуре -20 ° С, и один при 4 ° С в течение более немедленному использованию.
8. Целесообразно подготовить "добычу пустой 'вместе с образцы тканей. Заготовка подвергается все же лечению, изложенные выше, но выполняется без ткани. ПЦР извлечения пустой наряду с образцов пациентов, чтобы гарантировать, что добыча техника оператора правильно и что реагенты не содержат ДНК загрязнения.

2. Грунтовка подготовки

1. Грунтовки для локусов, для которых Есть самые обширные данные штамм типа приведены в таблице 1. Четыре или пять праймеров объединены для мультиплексной ПЦР. Один грунт для каждого локуса несет флуоресцентные теги химических 5 ", которые будут обнаружены в процессе капиллярного электрофореза длины фрагмента анализа (FLA).
2. Для каждой комбинации мультиплексной ПЦР, помеченные грунт и соответствующий обратный праймер для каждого локуса объединены в отдельные трубы Эппендорф: вперед праймеров в одной из труб обратной в другом. Сток грунтовки готовятся как 100 мкм решений (рис. 2а), часть из которыхразбавляют в 10 раз до концентрации 10 мкМ использованием TE (1x Трис-ЭДТА, рН 8,0). Оставшиеся аликвоты 100 решений мкМ грунтовки хранятся при температуре -20 ° C для дальнейшего использования.
3. Равные количества каждого 10 мкМ грунтовки смешивают в результате чего 2 мкм конечные концентрации каждого праймера. Когда грунтовка комбинации добавляются в смесь ПЦР (табл. 3), конечная концентрация каждого праймера снижается до 0,2 мкм.

При комбинированной грунтовки добавляют в ПЦР смеси (табл. 3), конечные концентрации снизится до 0,2 мкм каждая.

3. Усиление бактериальной ДНК с помощью мультиплексной ПЦР

1. ПЦР-установки
   • Запись количество образцов, которые будут использоваться и подготовить лист с необходимыми реагентами и их объемы до сбора необходимых пластмасс и других материалов.
   • Этикетка стерильные пробирки / полосы / пластин, которые будут использоваться для ПЦР с образцами чисел. Не забудьте указать положительные и отрицательные контроли.
2. Протрите Термоциклер с чистящим раствором (например, Decon ELIMINase) и программу его в соответствии с Таблица 2. Изменение перчатки после очистки и перед работой грунтовки и других реагентов.
3. Подготовка ПЦР Mastermix в соответствии с таблицей 3 и этикетке пробирки для ПЦР / полосы / пластина с сочетание грунтовки и номера образцов, которые будут использоваться.
4. Алиготе 18μl из Mastermix каждому меченого ПЦР-пробирку или хорошо. Изменение перчатки.
5. Протрите отдельной биологической безопасности кабинета и пипетки с 70% этанола, чтобы помочь очистить и дезинфицировать области работы и инструментов, то с учетом рабочей зоне и пипетки к ультрафиолетовому излучению в течение 15 минут, чтобы сшивки ДНК любого загрязнения. Изменение перчатки.
6. В чистых био-безопасной шкаф, добавить 2μl ДНК шаблон Mastermix в каждой ПЦР трубки / пластины также приобрести общим объемом 20 мкл (рис. 2б). Использование аэрозоля советы профилактики пипетки для всех жидких материалов.
7. Центрифуга пробирки для ПЦР / полосы / пластин кратко перемешать содержимое.
8. Место пробирок с образцами / полосы / пластины в амплификаторе и запустить программу ПЦР.
9. Когда программа будет готова, удалять продукты из амплификаторе и хранить при температуре 4 ° С до электрофореза.

4. Гель-электрофорез продуктов ПЦР

* Этот протокол был стандартом для многих лет и является дополнительным шагом, который может быть использован, если подтверждение продуктов ПЦР желательно перед отправкой их на FLA.

1. В отдельный пост-ПЦР рабочей области, готовят 2% агарозном геле. Используйте 2,0 г агарозы powder/100ml 1 раз TBE (Трис / Борат / ЭДТА) буферного раствора в колбу. Нагрейте смесь в течение 1,5-2 минут в микроволновой печи. Swirl содержание, отопление еще раз, если необходимо растворить агарозы. Прохладный немного и залить гель в форму с помощью расчески с достаточно скважин для образцов.
2. Удаление продуктов ПЦР в возрасте от 4 ° С, а центрифуги в течение приблизительно 30 секунд.
3. Смешайте 2-5 мкл продукта ПЦР с 0.5-1 мкл из 5 или 6 раз буфером гель нагрузки (Буфер можно получить в различных компаниях, или может быть замешан в лаборатории. Рецепты доступны в Интернете.)
4. Нагрузка скважин гель с 6μl образец / загрузки буфера смеси. Добавить молекулярной лестнице одной скважины (желательно 20 б.п. лестнице).
5. Выполнить геля при 100 в течение примерно 90 минут.
6. Замочите геля в растворе бромистого этидия в течение 15-30 минут, затем в сверхчистой дистиллированной воды для равного количества времени.
7. Изображение гель в то время как УФ-светом применяется. Там должна быть полоса для каждого из 4-5 сегментов ДНК в комбинации (рис. 3).
8. Утилизировать геля в соответствии с опасными политики учреждения материалов. Бромистый этидий решение может быть использована несколько раз, прежде чем надлежащей утилизации.

5. Подготовка проб для анализа фрагментов длиной (FLA)

1. В чистую пробирку Эппендорф, подготовить мастер смеси, содержащей 12μl Привет-Ди решение формамида из свежей аликвоты и 0.3μl из GeneScan -500 ЛИЗ стандартных размеров (оба из Applied Biosystems) для каждого образца для тестирования. (Привет-Ди формамида химически денатурирует ДНК до капиллярного электрофореза, что исключает необходимость для отопления.) Использование 96-луночного оптические пластины реакции качество, аликвоту 12.3μl формамида-ЛИЗ смеси в каждую лунку используется для образцов и установите пластину в сторону.
2. Сделать пластины карту для своего архива, показывающее, какая ДНК образца в каждую лунку (рис. 4а).
3. Использование труб / полосы или 96-луночного планшета, добавляют 1 мкл продукта ПЦР (из Части 3), чтобы 59μl ПЦР качества воды создании 1:60 разбавление продукта ПЦР. Растворы могут быть скорректированы на основе сигнала от данных FLA или яркость геля полосы. Даже низкие концентрации ДНК можетбыть достаточным (1:120 или 1:180).
4. Добавить 1 мкл из разбавленного продукта ПЦР для правильного хорошо в пластину, содержащую формамид-ЛИЗ смеси.
5. Скорость и эффективность может быть значительно повышена, если ПЦР было также сделано в 96-луночного планшета. Можно просто выстраиваются три таких пластин в следующей последовательности: 1 пластина с продуктами ПЦР, плиты 2 с стерильной воды для разведения продуктов ПЦР, и пластины 3 с формамида и размеры лестницы для анализа фрагментов длиной. Многоканальной пипетки позволяет быстрый процесс подготовки FLA.

Примеры анализа с помощью генетического анализатора

6. Калибровка Генетический анализатор для обнаружения применяются flurophores согласно инструкции производителя. Обязательно используйте краситель набор, который включает в себя Лиз.
7. Пополнение водой промыть контейнеры и добавить новые Запуск буфера с ЭДТА (1x) (Applied Biosystems) в буфер камеры.
8. Добавить предварительно щели кремния перегородки на тарелку и поместите пластину в проведении разработан лоток. Пресс 'лоток' кнопку на Генетический анализатор принести автосамплером вперед. Место лоток на автосамплером и закрыть дверь Генетический анализатор.
9. Создать или импортировать электронную таблицу для анализа. ИМПОРТИРОВАННАЯ файлы имеют расширение. Рг, расширение и находятся в разделенных табуляцией формате. Файлы могут быть изменены в Excel (Microsoft) или аналогичных программ.
10. Образцы вводятся в капиллярную (50-см длины, POP-7 полимера) путем применения инъекций напряжением 1,6 кВ в течение 15 сек Капиллярного электрофореза работает на напряжении 15 кВ при температуре 60 ° С в течение 1800 секунд. Весь процесс занимает около 45 минут.
11. После запуска завершена, данные для каждого анализируемого образца, преобразуются в файлы с расширением. FSA и помещен в папку пластины файл (рис. 4б). Каждый файл данных составляет около 100 Кб по размеру и могут быть сохранены на флэш-накопителе или молнии и по электронной почте. Данные файлы могут быть просмотрены с помощью соответствующего программного обеспечения, таких как GeneMapper ABI или Пик сканера.

6. Анализ результатов длины фрагмента

1. Анализ данных из флуоресцентного капиллярного электрофореза требует специального программного обеспечения. Если такая программа не доступна, перейдите на сайт Applied Biosystems и скачать Пик сканера. Программное обеспечение бесплатно и работает достаточно хорошо. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
2. Открытый Пик сканера и 'Start New Project "с последующим" Добавить файлы ". Нагрузка выбрана. FSA данных файлов в программе, включая положительные и отрицательные контроли.
3. Выбрать (выделить) и "проанализировать" все загруженные файлы. Убедитесь, что каждый образец имеет значение "Размер Стандарт: GS500 (-250) и анализ Метод:. Калибровка Default-рр-Пресс" Проанализировать ".
4. Проверьте размер в пар оснований каждый цветной пик производства фрагментов ДНК в образцах.
5. Запись каждого пикового значения размера в пар оснований и сравнить ее с положительным пиком контроля.
6. Пики положительные контрольные образцы должны быть не хуже с числом пар оснований и соответствующего числа тандемных повторов, перечисленных в таблицах 4-7.
7. Определите, сколько коротких сегментов повторить тандеме присутствуют в каждом образце аллеля по сравнению с положительным контролем. Мы используем NHDP63 которая была последовательность для числа копий VNTR в каждом локусе рассматривается ^4.
8. Введите записанных данных в электронную таблицу для сравнительного и / или математическим анализом. VNTR "отпечатки пальцев" или гаплотипов, это строки из аллелей в определенные локусы, которые характерны для М. лепры напряжения.

7. Представитель Результаты

Гель-электрофорез продуктов ПЦР, мы надеемся, производят полосы для каждого локуса в грунтовку комбинации (рис. 3). На рисунке 3, Есть 2 секции для геля: верхняя секция имеет Комбинация 1 ПЦР образцов и нижней части Комбинация 2 образцов. Каждый раздел содержит 20 пар оснований молекулярной лестнице, а затем продуктов ПЦР получены из 8 образцов пациента. Комбинация 1 также имеет отрицательный контроль и, наконец, положительный контроль (NHDP63 деформации). (Управления для комбинации 2 находились на различных геля.) Отметим, что большинство образцов четко отображать 5 полос, 1 для каждого локуса в комбинации. В некоторых случаях, полосы могут быть слишком близко друг к другу появляются в виде отдельных локусов в результате чего внешний вид только четыре полосы.

Ожидаемый размер ампликона приведены в таблице 1. Наша лаборатория использует NHDP63 штамма M. лепры в качестве положительного контроля. Два типа повторять сегменты были изучены: микросателлитных локусов (с 1-5 повторов база) и минисателлитных локусов (с сегментами более 5 пар оснований повторяться несколько раз). ⁵

Интерпретация данных файлов из капиллярного электрофореза опирается на два стандарта: внутренний фрагмент ДНК размеров стандарт, называемый GeneScan-500LIZ (ABI) и внешней положительной контрольной пробы усиленного бактериальной ДНК.

FLA хроматограмм, просматривать с помощью программного обеспечения сканера Пик, можно увидеть на рисунках 5а, 5б и 6.

Пик Сканер позволяет получать данные о ампликона размера (оси Х в пар оснований) и силы сигнала (у-оси). (Рис. 5, б) Дополнительные данные о площади пика, и т.д., также доступны, хотя размеры и максимальные значения высоты являются наиболее важными. Пики менее 100 единиц в высоту, как правило, считается слишком слабым сигнала, который будет надежной.

Рисунок 6 сравнивает положительного контроля (NHDP63) и двух образцов пациентов, показывая изменение числа тандемных повторов в локусе (GTA) 9. В положительном контроле, последовательность (GTA) повторяется 10 раз. VNTR NHDP63 и ампликона размера были проверены путем секвенирования генов. Пациент 4 в PCR ампликона на 3 б.п. меньше, чем положительного контроля указывает Есть только 9 единиц повторяю, в то время как пациент имеет 6 ампликона, что на 3 б.п. больше NHDP63 выявление 11 повторов (GTA). Пациент 2 имели низкий бактериальный индекс (BI), практически без ДНК ПЦР репликации, поэтому сигнал не FLA.

Трудности в интерпретации данных FLA иногда происходит в результате «заикания». Во время реакции ПЦР, ДНК-полимераза может привести фрагменты, которые один или более повторений длиннее или короче, чем исходный аллеля. Они, как правило признан пиками меньшей высоты окружающих основной пик. Они будут "на лестнице", то есть правильное число пар оснований повторять сегменте больше или меньше, чем основной пик. В результате семья пиков же цвета. Рисунок 7 показывает, что это с локусом (ТП) 10.

Еще одна трудность, иногда встречаются с FLA предполагает '+' или '-хвосты ", в которой ДНК-полимераза добавляет единой базы [обычно аденин (А)] до конца 3' скопировали сегмента ДНК. Это проявляется в FLA, как пик справа от основного или заикаться пик, 1 пара оснований больше, чем соседний пик, как показано на рисунке 8. Не следует путать с основной или заикаться пика. Основного пика и его хвост считаются одним видом. Хвост не изменяет числа VNTR повторяется. (Некоторые комплекты ДНК-полимеразы предназначены специально для поощрения-хвосты, чтобы уменьшить этот эффект смешанные. Содействие полной-хвосты имеет тенденцию производить один пик, а не пару пиков.)

Выделения ДНК и ПЦР-продукты содержат как М. лепры и ДНК человека, однако, за исключением (ТП) 18, грунтовки достаточно конкретны, что они только усиливают бактериальной ДНК, и нет никаких или почти никаких человеческих амплификации ДНК. (ТП) 18 часто производит пика в 242 пар оснований, то есть с ДНК человека и не видел в броненосца пассировали образцы ДНК (рис. 9).

Срок хранения грунтовки, как правило, хорошие, если они хранятся при температуре -20 ° С, удаляется только для немедленного использования, а затем хранить при температуре 4 ° С до потребления. Грунтовка должна быть стабильной при температуре 4 ° С в течение 1-2 недель. Хотя решения грунтовки комбинаций для ПЦР немного времени, рекомендуется, что только сочетание грунтовки достаточно для немедленного использования, быть готовым. Грунтовка комбинаций, кажется, несколько ухудшить при хранении в течение длительных периодов времени.

Т. должны быть аликвоты от больших запасов, и аликвоты могут храниться либо замороженные или при комнатной температуре. Большие аликвоты 200-400μl хороши для разведения сухой или концентрированной грунтовкой запасов (рис. 2а). Меньшие порции на 10-50 мкл полезны для дополнения объемы грунта комбинации 3 и 4. TE является недорогим и аликвоты следует выбросить после использования.

Комплекты Мультиплекс фермент достаточно дороги и должны хранить в замороженном состоянии (-20 ° С) до использования. После подготовки ПЦР, неиспользованные решения мультиплекса должны быть немедленно возвращены в 4 ° С. Малый Мультиплекс Qiagen PCR Комплект поставляется с 3 трубы мультиплекс смеси, каждый из которых содержит 0.85ml (850μl) раствора; хватает примерно на 65-70 PCR.

Вообще, лучше всего, чтобы избежать повторных, основные изменения температуры для материалов, используемых в этом виде лабораторных работ, включая образцы ДНК, грунтовки и решения мультиплекса комплект. Все материалы должны храниться при температуре от -20 ° C до необходимости, и затем хранить при температуре 4 ° С до потребления. Длительное хранение ДНК должна быть при температуре -80 ° C.

Все материалы, содержащие провел ткани, грунтовки и / или ДНК необходимо обрабатывать в автоклаве и утилизировать, когда больше не какую-либо пользу. Все образцы лечениес этидий бромид или формамид должны рассматриваться как опасные отходы и утилизировать в соответствии с опасной политикой учреждения материалов.

Таблица 1: ампликона размеров для штамма NHDP63

Таблица 2: Велоспорт Параметры для VNTR ПЦР

Таблица 3: Подготовка ПЦР

Таблица 4: Аллель призывает Комбинация 1

Таблица 5: Аллель призывает Комбинация 2

Таблица 6: Аллель призывает Комбинация 3

Таблица 7: Аллель призывает Комбинация 4

Рисунок 1: VNTR-FLA Технологическая схема

Рисунок 2. (А) подготовка Комбинация 1 Верхний Грунтовки (Eppendorf кинескопа любезно www.clker.com ). (Б) ПЦР Setup (на 8 ПЦР) (Eppendorf кинескопа любезно www.clker.com)

Рисунок 3. Агарозном геле комбинаций 1 и 2 VNTR ДНК ПЦР-продукт

Рисунок 4. . () FLA пластины карты (б) FLA данных файлов: *. FSA

Рисунок 5. () FLA Хроматограмма Положительный контроль (NHDP63) для Комбинация 1 локусов VNTR. (Б) Пик Данные сканирования для размера ампликона и изобилие (GTA) 9

Рисунок 6. Сравнение образцов ПЦР для ПК (NHDP63) для локус (GTA) 9

Рисунок 7. Основное и Stutter Пикс для (ТП) 10

Рисунок 8: + (хвост) Пикс Рядом с Главным или Stutter Пикс.

Рисунок 9: (ТП) 18 Главная Пик, Stutter Пикс и правам Пик ДНК

Рисунок 10:. () Штамм Дифференциация Микобактерии лепры на основе данных VNTR (B) Штамм Дифференциация М. лепры на основе отпечатков пальцев ДНК MLVA

Обсуждение

Коллекция образцов кожи от больных лепрой требует квалифицированных врачей и техников, работающих при кожных клиник. Сотрудники лаборатории обработки этих образцов должны проявлять большую осторожность, чтобы носить халаты, перчатки и защитные очки и работать в биологической безопасности при работе кабинета инфицированных образцов тканей человека или броненосца. Дезинфекция поверхностей и инструментов, также имеет важное значение. Работа в чистую, стерильную био-безопасной шкаф имеет важное значение для предотвращения загрязнения образцов ДНК.

Экстракции ДНК стала сравнительно легко благодаря развитию добычи комплекты от таких компаний, как Qiagen. Направления необходимо соблюдать. Все образцы должны быть холодно, когда он не используется. Избегайте повторных, резкими перепадами температуры для образцов.

ДНК, праймеры, используемые в этой работе можно заказать из разных компаний, которые были названы в списке литературы ссылки в конце этой статьи. Следует проявлять осторожность, чтобы работать с грунтовки в ДНК свободной среде, с тем чтобы избежать загрязнения. Грунтовки приходят в виде сухого порошка и должны быть смешаны с ТЕ-и разбавляют до 100 мкм концентрация, затем разделяется на меньших количествах (рис. 2а). Рабочие растворы праймеров далее разбавляют до 10 мкм концентрациях. Опять же, не использовать образцы ДНК в районах / вытяжки, где грунтовки используются и подготовлены.

ПЦР-продукты также должны быть не холодно, когда он не используется.

3% агарозном геле подготовка даст лучшего разделения ДНК группе, но занимает больше времени для запуска. Для чисто качественные цели, 2%, как правило, достаточно. Этидия бромид раствор, используемый для окрашивания ДНК в агарозном гелях высокой активностью genotoxin, что поступает в организм через кожу. Ручка этого решения и гели окрашивали ее с помощью особой тщательностью и всегда быть уверенным в перчатках. Тщательно мойте руки после работы с любой образцы ДНК или этидия материалов метила. Утилизировать этидия решение окрашивания метила, вымыть и гели в соответствии с ведомственным руководящим принципам. Гели обычно не требуется, этот шаг может быть устранена раз FLA методы были созданы. Пора и реагента затрат.

Формамида решения, использованные при подготовке проб для FLA также является высокотоксичным веществом и должны использоваться с большой осторожностью. Мойте руки после использования. Утилизировать его следующие организационные принципы.

Чтение результатов FLA использованием Пик программное обеспечение сканера может оказаться непростой задачей. Базовый набор аллелей звонков (число тандемных повторов) была разработана в ХСС (Таблицы 4-7). (Следует отметить, что Таблицы 4-7, возможно, не все включено. Как и другие штаммы Микобактерии лепры изучаются аллелей с копией населением за пределами диапазона перечисленных могут быть найдены.) Одна конкретная задача включает в себя «заикаться» пиков. Это семьи пиков, особенно СПО, что только привлечь 2-3 пар оснований повторяется, например, (ТП) 10. Иногда правильно выбрать пик читать трудно (рис. 7). На этом рисунке, пик положительного контроля при 190 б.п. является основной пик. Пики ниже в высоту, 2, 4 или даже 6 пар оснований больше или меньше, чем основной пик называют "пики заикаться. -Хвосты также может привести к путанице. -Хвосты описано ранее в тексте и на рисунке 8. Наконец, если продукты ПЦР весьма распространены в образцах, пики могут появляться с двойным шип. В этом случае, читайте центре пик формы. (См. рисунок 6, Пациент 6.)

Управление данными может быть трудной задачей для этого вида работ. Важно записать всю необходимую информацию для всех экспериментов, таких как: дата задачи или процедуры, оператора, полоса / пластины карты, FLA заказов, условия ПЦР и рецепты, даты гели и фотографии, температура хранения, разведения ДНК-матрицы, FLA электронный файл мест хранения и т.д. Хорошая организация и управление данными может сэкономить часы времени, затрачиваемого ищете конкретную часть информации в будущем.

Лабораторные работы, описанные здесь продолжается уже на протяжении нескольких лет в Университете штата Колорадо и в других местах по всему миру. Большая картина того, что все собранные данные средства и как она может быть будущего использования начинает появляться. Цифры 10А и 10В продемонстрировать, как эти ДНК, отпечатки пальцев могут быть использованы для выделения различных М. лепры штаммов между странами (10A), или даже между семьями (10В). В семье и общине связанные случаи были показаны нести М. лепры подобных или идентичных типов VNTR напряжения. Надеюсь, что это может быть возможным, чтобы получить дальнейшее понимание режим (ы) передачи проказы, так что система раннего обнаружения сетей передачи могут быть разработаны для тех людей, мест в опасности, и что лечебной терапии препарат может начаться до постоянного неврологического и дерматологического причинен ущерб.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
DNeasy крови и тканей Kit	Qiagen	69504
Мультиплекс ПЦР Kit	Qiagen	206143
ДНК праймеры	Различный
Агарозном геле	Различный
5 или 6 раз буфера Гель Загрузка	New England Biolabs	B7021S	Рецепты доступны сделать свой собственный *
Бромистый этидий решение	Различный		Развести из рассмотрения.
Привет-Ди формамид решения	Applied Biosystems	4311320
Гена сканирования -500 LIZ	Applied Biosystems	4322682

Оборудование	Комментарии
2 Холодильники	4 ° C: 1 для образцов ДНК, 1 для грунтовки и Мультиплекс реагентов
1 микроволновой печи	Или подходящий способ для отопления агарозы и воды, чтобы сделать гели
1 автоклаве	Или скороварки для стерилизации материалов
ПЦР машины	Термоциклер
2 комплекта пипетки	0.5-10 мкл, 10-100 мкл, 20-200 мкл, 1000 мкл 1 комплект для грунтовки, 1 набор для ДНК
Подводные поле гель-электрофореза	С формами и расчески для подготовки гелей.
Электрофорез питания мощностью	С кабелями для подключения к геля окне
Тепло блок	Для Эппендорф труб
Центрифуга	Для Эппендорф труб / полосы
Капиллярной системы электрофореза (генетические анализатор)	Или доступ к учреждению, которые могут выполнять этот анализ
Пластики	Одноразовые наконечники аэрозоля, Эппендорф труб, 8-и полос, 96-луночных планшетах, некоторые из оптического качества
Компьютер с подключением к интернету