טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה בין א coli ואחריו אניון מטבע כרומטוגרפיה, His6, תג עם הסרת פרוטאז TeV, וגודל-הדרה כרומטוגרפיה.

Abstract

Hsp104 הוא hexameric AAA + חלבון ¹ של שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ATP לחלבון disaggregation ^20-10 (איור 1). פעילות זו מקנה שני יתרונות מרכזיים סלקטיבית. ראשית, renaturation של אגרגטים מופרעת על ידי Hsp104 מסמיך הישרדות שמרים לאחר חלבונים misfolding מדגיש שונים, כולל הלם חום ^3,5,11,12. שנית, שיפוץ צולבות סיבי עמילואיד ביתא על ידי Hsp104 מאפשרת שמרים לנצל פריונים עצום (amyloids זיהומיות) כמאגר של מועיל תורשתי וריאציה פנוטיפי ^13-22. למרבה הפלא, Hsp104 ישירות remodels oligomers preamyloid ו סיבי עמילואיד, כולל אלה מורכבת של חלבונים הפריון שמרים Sup35 ו Ure2 ^23-30. פונקציונליות זו עמילואיד שיפוץ הוא פן מיוחד של שמרים Hsp104. E. orthologue coli, ClpB, נכשל preamyloid oligomers לשפץ או סיבי עמילואיד ^26,31,32.

Orthologues Hsp104 נמצאים בכל ממלכות החיים חוץ, להביך, בעלי חיים. ואכן, אם תאים חיים בעלי כל המערכת האנזימטית שזוגות disaggregation חלבון renaturation (ולא השפלה) נשאר ^33-35 ידוע. לפיכך, אנו ואחרים הציעו Hsp104 עשוי להיות מפותח כסוכן הטיפולי למחלות ניווניות שונות הקשורות misfolding של חלבונים ספציפיים לתוך oligomers preamyloid רעילים סיבי עמילואיד ^{4,7,23,36-38.} אין טיפולים ישירות ליעד מינים מצטברים הקשורים למחלות אלה. עם זאת, Hsp104 מתמוסס oligomers רעילים סיבי עמילואיד מורכב אלפא synuclein, אשר מחוברים עם מחלת פרקינסון ^23, כמו גם צורות של PRP עמילואיד ^39. חשוב לציין, Hsp104 מפחית הצטברות חלבון מקילה ניוון מוחיים מכרסמים במודלים של מחלת פרקינסון ²³ ו - ³⁸ מחלת הנטינגטון. באופן אידיאלי, כדי לייעל את הטיפול ולמזער את תופעות הלוואי, Hsp104 יהיה מהונדסים potentiated סלקטיבי לשפץ אגרגטים ספציפי מרכזי המחלה שאלה ^4,7. עם זאת, הבנה מבניים מכניסטית מוגבל של כמה Hsp104 disaggregates כזה רפרטואר מגוון של מבנים מצטברים חלבונים שאינם קשורים מתסכל אלה במאמצים ^30,40-42.

כדי להבין את המבנה ואת מנגנון של Hsp104, חיוני ללמוד את חלבון טהור מחדש פעילות disaggregase שלה עם רכיבים מינימליים. Hsp104 הוא חלבון 102kDa עם לצרכן של 5.3 ~, אשר hexamerizes בנוכחות ADP או ה-ATP, או בריכוזים בחלבונים בהעדר ^43-46 נוקלאוטידים. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור טיהור של פעיל ביותר, Hsp104 יציב מ E. coli. השימוש E. coli מאפשר פשוטה בקנה מידה גדול ייצור השיטה שלנו יכולה להתבצע במהירות ובאופן אמין עבור Hsp104 וריאנטים רבים. פרוטוקול שלנו מגדילה Hsp104 טוהר מפשט הסרת _6-התג שלו לעומת שיטת טיהור הקודם מתוך ה coli ^47. יתר על כן, פרוטוקול שלנו הוא קליל ונוח יותר מאשר שני הפרוטוקולים מאוחרים יותר ^26,48.

Protocol

1. הביטוי של Hsp104

1. הפלסמיד המועסקים לטיהור ב E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, מכיל את Hsp104 לפתוח קריאת מסגרת בשליטת ועין מתנהלת של האמרגן TRC ^26. הפלסמיד מייצר Hsp104 עם תג _6-N-מסוף שלו כי ניתן להסיר על ידי מחשוף פרוטאז TeV. המרה pPROEX-HTb-Hsp104 לתוך קודון ממוטב E. coli BL21-CodonPlus-RIL תאים (Stratagene, Agilent Technologies) באמצעות הליך טיפוסי השינוי חיידקי (למשל על פי הוראות היצרן). חשוב להשתמש קודון ממוטב E. coli זן Hsp104 כי יש הטיה קודון יוצא דופן.
2. לחסן תרבות 2XYT 100 מ"ל (מתכון USB.: 16G / L קזאין peptone, 10g / L תמצית שמרים, 5g / L NaCl, pH 7.0) בתוספת 100μg/mL אמפיצילין ו 34μg/mL chloramphenicol עם transformants טריים לגדול בין לילה בשעה 37 ° C עם רעד בכל 200rpm.
3. לחסן 10ml של התרבות אל תוך הלילה 6 X 1 ליטר 2XYT עם 100μg/mL אמפיצילין ו 34μg/mL chloramphenicol ב צלוחיות 2L. תלחצו על 250rpm על 37 מעלות צלזיוס עד OD ₆₀₀ = 0.4-0.6. תפסיק לרעוד ולהפחית את הטמפרטורה ל 15 ° C. אפשר תאים לאזן unagitated עבור 30 דקות בחממה עד שהוא מגיע 15 ° C. לאחר 15 ° C הוא הגיע לגרום ביטוי החלבון על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ. קורות חיים רועד בכל 250rpm לילה (12-16 שעות).

2. תא קציר תמוגה

1. תאים קציר ידי צנטריפוגה (ב רוטור precooled) בסל"ד 4000 עבור 20min ב 4 ° C (אנו משתמשים RC Sorvall 3BP צנטריפוגות +). השלבים הבאים יש לבצע מיד כי Hsp104 פעילות מצטמצם כאשר E. תאים coli הם קפואים. יתר על כן, כל השלבים הבאים יש לבצע על הקרח או 4 ° C.
2. תא כדורי Resuspend ב prechilled (על הקרח) חיץ 10ml תמוגה (40mm HEPES KOH-pH 7.4, KCl 500mm, 20mm MgCl _2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 20mm, 5μM pepstatin, מעכב פרוטאז להשלים קוקטייל (1 EDTA ללא tablet/50mL), ו - β-2mm mercaptoethanol).
3. Lyse תאים עם homogenizer צרפתית (Emulsiflex) לחץ המשתמשת מחליף חום טבול במי קרח. לפני השימוש, להבטיח כי כל גושי התאים היו solubilized. לאחר equilibrating homogenizer עם חיץ תמוגה, שני עובר דרך הגליל עם לחץ של psi 15,000-18,000 מספיק עבור תמוגה מלא. אם העיתונות הצרפתית אינו זמין, דגירה עם ליזוזים ואחריו sonication יכול לשמש (ראה דיון). שמור מדגם קטן של תאים lysed לניתוח SDS-PAGE (1μL) (lysate באיור. 2).
4. הסר פסולת התא על ידי צנטריפוגה בסל"ד 16,000 עבור 20min ב 4 ° C (אנו משתמשים RC5C Sorvall centifuge +). שמור supernatant עבור השלב הבא ולשמור מדגם קטן (1μL) של supernatant לניתוח SDS-PAGE (Load Ni באיור. 2).

3. Hsp104 טיהור

1. מערבבים supernatant משלב 2.4 עם 12mL (2ml Ni-Sepharose חרוזים לכל 1 ליטר של תאים) של slurry 50% חיץ תמוגה Ni-Sepharose חרוזים equilibrated (GE).
2. סובב מדגם לאט במשך 3 שעות ב 4 ° C כך Ni-Sepharose נשאר תלוי באופן שווה מקציפים ממוזער. פעמים הדגירה קצר יותר הם אפשריים, אבל תהיה ירידה בתשואה. ב 4 מעלות צלזיוס בנוכחות מעכבי פרוטאז, השפלה קטנה מתרחשת, ו 3 שעות Ni-Sepharose זמן הדגירה אינה ירידה בפעילות של המוצר הסופי. איסוף Ni-Sepharose ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C ב 2000 סל"ד (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). שמור מדגם קטן של supernatant לניתוח SDS-PAGE (1μL) וזורקים את השאר (תזרים Ni דרך (FT) באיור. 2).
3. שטפו את לאחזר Ni-Sepharose עם 25 כרכים הטור של חיץ לשטוף (40mm HEPES-KOH pH 7.4, KCl 150mm, 20mm MgCl _2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 20mm, 2mm β-mercaptoethanol), 5 כרכים של עמודה לשטוף עם חיץ KCl 1M להסיר מזהמים מחויב אלקטרוסטטי כדי Hsp104, ו 25 כרכים הטור של חיץ לשטוף. איסוף Ni-Sepharose לשטוף לאחר כל על ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C ב 2000 סל"ד (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). לאחר מחזור לרחוץ כל צנטריפוגה, הסר חוצץ על ידי שאיפה.
4. כדי elute Hsp104, לערבב Ni-Sepharose עם חיץ 1mL elution (40mm HEPES KOH-pH 7.4, KCl 150mm, 20mm MgCl _2, 2.5% (w / v) גליצרול, imidazole 350mm, 2mm β-mercaptoethanol) לכל 1mL Ni-Sepharose ו לסובב על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הריכוז הגבוה imidazole משבש את החרוזים שלו _Ni-6 אינטראקציה. הסר Ni-Sepharose עם ריק 1.2 ספין עמודות מ"ל (Bio-Rad) על ידי צנטריפוגה דקות 2 ב -4 ° C בסל"ד 2000 (Eppendorf 5810R צנטריפוגות). שמור 1μL של eluate לניתוח SDS-PAGE (eluate Ni באיור. 2). עבור כל ליטר של תאים, ~ 15mg של Hsp104 מתקבל בשלב זה.
5. מאגר eluate חילופי לתוך מאגר Q (20mm טריס-HCl pH 8, 0.5mm EDTA, 5mm MgCl _2, 50mm NaCl) באמצעות MWCO 30,000 Amicon Ultra (MILlipore) 15 מ"ל יחידות concentrator צנטריפוגלי. ראשית, כדי להתרכז חלבון ~ 1.5mL מכן להוסיף 14.5mL של הצפת ש לדלל חלבון של פי 10. חזור 3 פעמים להחלפת חיץ. ה-pH מוגבר מלח נמוכה מבטיחה Hsp104 יש מטען שלילי גבוה.
6. לטהר Hsp104 באמצעות כרומטוגרפיה אניון החליפין באמצעות הצפת ש equilibrated משאבים Q טור 6mL (GE). לפני הזריקה, חלבון מסונן באמצעות חלבון נמוך מחייב Millex GP PES ממברנה 0.22μM מזרק מסנן (Millipore). אנו מעסיקים קצב זרימת 1mL/min. לשטוף חלושות חלבונים מחייב עם נפח 1 טור של הצפת ש 20% + (20 מ"מ טריס-HCl pH 8, 0.5mm EDTA, 5mm MgCl _2, 1M NaCl). Elute Hsp104 ליניארי עם שיפוע (20% -50% הצפת ש +) מעל 5 כרכים עמודה (איור 3). איסוף שברים 1ml. Hsp104 ורוב גרסאות בדרך כלל elute ב ~ NaCl 400mm (31mS/cm). שמור דוגמאות של שברים השיא (1μL) לניתוח SDS-PAGE (איור 3, הבלעה).
7. כדי להסיר שלו _6-תג, חלבון החליפין באמצעות concentrator Amicon צנטריפוגלי כמו לתאר לעיל (ראה שלב 3.5) לתוך מאגר מחשוף (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, ו 10mm MgCl _2). השתמש proTEV פרוטאז (Promega) או AcTEV פרוטאז (Invitrogen) בהתאם להוראות היצרן. עבור Hsp104, מצאנו כי יחס גבוה יותר של TeV פרוטאז: Hsp104 נדרשים עבור מחשוף מלא. אנו משתמשים יחס של יחידה 1 פרוטאז לכל 12μg Hsp104. המחשוף צריך להיות מבוצע על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות, ואחריו דגירה של 16 שעות ב 4 ° C. הריכוז הסופי Hsp104 צריך להיות בין 20-75μM מונומר. לכלות כל Hsp104 His6-tagged הנותרים פרוטאז TeV עם Ni-Sepharose (GE) על ידי הוספת Ni-Sepharose מעבר לכמות Hsp104 בתגובה מחשוף (להניח חרוזים יכולים להיקשר 15mg חלבון לכל מ"ל של שרף ארז). הסר חרוזים עם עמודות ספין ריק (Bio-Rad) על ידי centrifuging עבור 2min בסל"ד 2000 ב 4 ° C. איסוף דגימות לפני ואחרי מחשוף (1μL) לניתוח SDS-PAGE כדי להבטיח מחשוף, והסרת חלבון uncleaved (איור 4).
8. שערי למאגר גודל הרחקה (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, 10mm MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT) באמצעות MWCO 30,000 Amicon Ultra (Millipore) כפי שמתואר בשלב 3.5.
9. יתר על כן לטהר Hsp104 באמצעות כרומטוגרפיה גודל הדרה. השתמש הדרה גודל מאגר Superose equilibrated 6 או Superdex 200 עמודה (הן GE) (איור 5). לפני הזריקה, חלבון מסונן באמצעות חלבון נמוך מחייב Millex GP PES ממברנה 0.22μM מזרק מסנן (Millipore). עבור פחות מ 10 מ"ג של חלבון, בגודל 10/300 העמודות (24mL) יכול לשמש ושברים 0.5ml נאספים. לקבלת דוגמיות יותר מ 10 מ"ג, בעמודה גודל 12/60 (120mL) אמור לשמש ו 1 מ"ל שברים נאספים. עיין ההוראות של היצרן, ספיקות ואמצעי אחסון מדגם להיות טעון. לאחר הטיהור, שברים Hsp104 הם אספו כפי שמוצג באיור. 5 ו מרוכזים יחידות Amicon מרוכז צנטריפוגלי (Millipore). Hsp104 מאוחסן כמתואר להלן. בשל אובדן החומר המפריד Hsp104 מוצרים השפלה ומזהמים את התשואה הסופית של מטוהרים באורך מלא Hsp104 הוא ~ 1-3mg לליטר החל בתרבות.

4. Hsp104 פעילות Disaggregase

1. לאחר הטיהור, זהו תרגול טוב כדי להעריך Hsp104 פעילות assay disaggregation. בדרך כלל, אנחנו מעסיקים assay מחדש בלוציפראז ² (איור 6). ב assay זה, Hsp104 בשיתוף עם מערכת המלווה Hsp70 (Hsp70 ו Hsp40) disaggregates אוריאה-מפוגל אגרגטים גחלילית בלוציפראז ^2. בלוציפראז מסיסים מזרז חמצון של luciferin כדי oxyluciferin, תגובה שמשחררת אור. הארה על ידי ניטור, מחדש יחסית, ולכן disaggregation, של בלוציפראז ניתן לקבוע. Hsp104 חייב להיות מסוגל בסינרגיה לשתף פעולה עם מערכת שיתוף המלווה Hsp70. כמות הארה התאושש תלוי Hsp70 המדויק: זוג Hsp40 מנוצל. אנו שגרתי להעסיק Hsp72 ו Hsp40 (עיצובים Assay). לכל הפחות, פעיל Hsp104 צריך לייצר גידול של פי 5 מחדש של בלוציפראז בהשוואה מחדש על ידי Hsp72: Hsp40 לבד (איור 6). Hsp104 ההכנות מצליחים להגיע לרמת פעילות מבוטלים.

5. Hsp104 אחסון

1. עבור אחסון לטווח קצר, Hsp104 יכולים להישמר על 4 מעלות צלזיוס חוצץ בגודל הדרה. עם זאת, הפעילות תהיה ירידה לאחר 2-3 ימים ב -4 ° C ו בחדות אחרי שבוע 1 ב 4 ° C. עבור מבחני disaggregation אנו ממליצים Hsp104 אמור לשמש בהקדם האפשרי לאחר טיהור. באופן אידיאלי, Hsp104 יש להשתמש מיד מבחני disaggregation עמילואיד.
2. אם החלבון חייב להיות מאוחסן לטווח ארוך, Hsp104 הוא החליף למאגר אחסון (20mm HEPES KOH-pH 7.4, 140mM KCl, 10mm MgCl _2, 0.1mm EDTA, 1mm DTT, גליצרול 10% (w / v)). Aliquots 100μl הם הצמד קפואים בחנקן נוזלי המאוחסן ב -80 ° C. להקפיא להפשיר מחזורים להפחית באופן דרסטי את פעילות Hsp104יש להימנע. אנו ממליצים לאט מפשיר Hsp104 על הקרח. עמילואיד disaggregase פעילות תרד בחדות לאחר חודש 1 ב -80 ° C.

6. נציג תוצאות ומספרים:

באיור 1. Hsp104 הוא disaggregase bifunctional. Disaggregation של אגרגטים מופרעת (המוצג בצד שמאל) דורש את שיתוף הפעולה של מערכת המלווה Hsp70 (Hsp70 Hsp40 ו) ^2. Remodels Hsp104 הורה אגרגטים עמילואיד (המוצג בצד ימין) ללא סיוע של Hsp70 ו Hsp40 במבחנה, אך Hsp70 ו Hsp40 יכול לשפר Hsp104 פעילות נגד עמילואיד ^26,28. עבור שני סוגי מבנים צבורים, Hsp104 זוגות הידרוליזה ל-ATP טרנסלוקציה המצע דרך הערוץ המרכזי שלה כדי לקדם disaggregation. טירוזין נושאות לולאות נקבוביות לעסוק המצע מעבורת דרך הערוץ המרכזי ^49-52.

איור 2. SDS-PAGE ניתוח צעד Ni-sepharose טיהור זיקה. Lysate, טען ניקל, Ni FT דגימות Ni eluate היו מופרדים על ידי-SDS באמצעות 4-20% טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie . שים לב שלא כל Hsp104 הוא מסוגל לאגד את Ni-sepharose. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל לנתיב).

איור 3. משאבים טיהור Q של eluate Ni-sepharose. עקבות הכחול מייצג את ספיגת עקבות 280nm ירוק מייצג הצפת% ש + (מקסימום 50%). השיא הראשון, elutes 20% ש + מכיל זיהומים, מוצרי השפלה Hsp104 מקופל כראוי. השיא השני העיקרי מכיל Hsp104 מקופל כראוי פעיל. ספיקה היה 1ml/min. צבע 20-50% + Q הוא 30 דקות או 5 כרכים העמודה. הבלעה: שברים שיא נפתרים על ידי ניתוח SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל).

איור 4. SDS-PAGE ניתוח צעד מחשוף proTEV פרוטאז. שלו _6-Hsp104 מן טיהור Q משאבים טופלה פרוטאז proTEV במשך 4 שעות ב 30 ° C ולאחר מכן 16 שעות ב 4 ° C. דוגמאות היו מופרדים על ידי SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. שים לב proTEV ביקע Hsp104 נודד במהירות רבה יותר. TeV פרוטאז ו Hsp104 uncleaved היה מדולדל עם Ni-Sepharose כמתואר שלב 3.7. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל).

איור 5. גודל-הרחקה וטיהור של Hsp104. ביקע Hsp104 היה מטוהרים עוד דרך טור 6 ג'ל Superose סינון (10/300, GE). ספיקה = 0.4ml/min. השיא בין השורות מקווקו מייצג שברים ונקווה. הבלעה: שברים שיא נפתרים על ידי ניתוח SDS-PAGE באמצעות% 4-20 טריס-HCl 1.0mm קריטריון ג'ל (Bio-Rad) ומוכתמת Coomassie. רחב טווח משקל מולקולרי סמנים (Bio-Rad) מוצגים (משמאל).

איור 6. Assay מחדש בלוציפראז. מפוגל אגרגטים גחלילית בלוציפראז (50nm) הודגרו עם או Hsp72 ו Hsp40 (1μM) (שניהם מאוניברסיטת עיצובים Assay), Hsp104 (6μM מונומר) או Hsp104, Hsp72 ו Hsp40 עבור 90min במהירות של 25 ° C. בלוציפראז מפוגל הוא רק מחדש מלא בנוכחות שני Hsp104 ו Hsp40/Hsp72. הארה ששוחזרו נמדדת על Infinite M1000 צלחת הקורא (לטקאן). ערכים מייצגים אמצעי ± SEM (n = 3).

Discussion

ציר הזמן: עבור פעילות Hsp104 מקסימלי אנו ממליצים על ערכת טיהור כולו יושלם במהירות האפשרית. עם זאת, את מספר הצעדים טיהור הופך לוח זמנים תובעני כי לא תמיד מעשית. אם הפעולות לטיהור מתבצעות מהר ככל האפשר, את הזמן מסוף ביטוי לילה ועד 2-4 שעות של דגירה על 30 מעלות צלזיוס עם TeV פ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
BL21-CodonPlus-RIL תאים המוסמכת	Stratagene, Agilent Technologies	230255
2XYT מרק	USB	75864
השלם, מיני, EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות	רוש	1836170
Pepstatin	סיגמא	P4265
Ni-Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare	17-5318-02
Amicon Ultra-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי (MWCO 30000)	Millipore	UFC903008
משאבים ש - טור 6ml	GE Healthcare	17-1179-01
proTEV פרוטאז	Promega	V6052
AcTEV פרוטאז	Invitrogen	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare	17-5172-01
Hsp40	Assay עיצובים	SPP-400
Hsp72	Assay עיצובים	ADI-NSP-555