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요약

여기서 우리는 매우 적극적인 Hsp104, hexameric AAA + 단백질 효모, 단백질 disaggregation에 커플 ATP의 가수 분해로부터의 정화를 위해 프로토콜을 설명합니다. 이 제도는의 친화력 정화를위한 His6 - 태그 구축을 악용 E. 대장균 음이온 교환 크로마 토그래피, TEV 프로 테아제와 His6 태그 제거, 크기 - 배제 크로마 토그래피에 의해 따랐다.

초록

Hsp104는 효모에서 hexameric AAA + 단백질 1, 단백질 disaggregation 20-10로 커플 ATP의 가수 분해 (그림 1)입니다. 이 활동은 두 가지 핵심 선택적 장점을 부여. 첫째, Hsp104에 의해 무질서 집계의 renaturation는 열 충격 3,5,11,12를 포함하여 다양한 단백질 misfolding 스트레스 후 효모 생존을 최대한 활용하십시오. 둘째, Hsp104에 의해 교차 베타 아밀로이드 원섬유의 리모델링은 유익한의 저수지로 수많은 prions (전염성 amyloids)를 이용하여 13-22 phenotypic 변화를 물려 전할 수있는하는 효모 수 있습니다. 현저하게, Hsp104 직접 효모 prion 단백질 Sup35 및 Ure2 23-30로 구성 포함 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 remodels. 이 아밀로이드 - 리모델링 기능은 효모 Hsp104 전문 패싯입니다. E. 대장균의 orthologue, ClpB는 리모델링의 preamyloid의 oligomers 또는 아밀로이드 원섬유 26,31,32에 실패합니다.

Hsp104의 orthologues는 동물, perplexingly,를 제외하고 삶의 모든 왕국에서 볼 수 있습니다. 사실, 동물 세포가 어떤 효소 시스템을 가지고 있는지 여부를 renaturation (오히려 저하 이상)에 커플 단백질 disaggregation 알 수없는 33-35 유지. 따라서, 우리와 다른 Hsp104가 독성 preamyloid의 oligomers과 아밀로이드 원섬유 4,7,23,36-38에 특정 단백질의 misfolding과 관련된 다양한 neurodegenerative 질병에 대한 치료 요원으로 개발을지도 모른다고 제안했습니다. 직접 질병와 관련된 집계 종을 대상도 트리 트먼트가 없습니다. 그러나 Hsp104는 파킨슨병 23뿐만 아니라 PrP 39 아밀로이드 형태로 연결되어있는 알파 synuclein의 구성 독성 oligomers과 아밀로이드 원섬유을 녹이고. 중요한 것은 Hsp104는 단백질 집합을 줄이고 파킨슨병 23 헌팅턴의 질병 38 설치류 모델에서 neurodegeneration을 ameliorates. 이상적으로, 치료를 최적화하고 부작용을 최소화하기 위해, Hsp104 공학 및 선택 질문 4,7의 질병에 중앙 구체적인 집계를 개조하는 potentiated 것입니다. 그러나, 어떻게 Hsp104 disaggregates의 제한된 구조 및 기계론의 이해 집계 구조와 관련이없는 단백질 같은 다양한 레퍼토리이 노력에게 30,40-42을 좌절.

Hsp104의 구조와 메커니즘을 이해하기 위해서는 최소한의 구성 요소로 순수 단백질과 reconstitute의 disaggregase 활동을 연구하는 것이 필수적입니다. Hsp104는 ADP 또는 ATP의 존재 또는 염기 43-46의 부재 높은 단백질 농도에 hexamerizes ~ 5.3의 PI와 102kDa 단백질이다. 여기, 우리는 E.에서 매우 적극적인, 안정적인 Hsp104의 정화를 위해 최적화된 프로토콜을 설명 대장균. E.의 사용 대장균은 단순 대규모 생산을 허용하고 우리의 방법은 여러 Hsp104 변종에 대한 신속하고 안정적으로 수행할 수 있습니다. 우리 프로토콜 Hsp104 순도를 높이고 E.에서 이전 정화 방법에 비해 그의 6 태그 제거를 단순화 대장균 47. 또한, 우리의 프로토콜을 두 개 더 최근의 프로토콜 26,48보다 손쉬운하고 편리합니다.

프로토콜

1. Hsp104 표현

  1. 플라스미드가 E.에 정화를위한 고용 대장균, pPROEX - HTb - Hsp104은 TRC업자 26 inducible 제어 아래에있는 Hsp104 오픈 읽기 프레임이 포함되어 있습니다. 플라스미드는 TEV 테아제 절단하여 제거할 수 있습니다 N - 터미널 그의 6 태그 Hsp104을 생산하고 있습니다. 코돈 최적화 E.에 pPROEX - HTb - Hsp104 변환 전형적인 세균의 변환 절차를 사용하여 대장균은 BL21 - CodonPlus - RIL 전지 (Stratagene, 애질런트 테크놀로지) (예 : 제조 업체의 지시에 따라). 코돈 최적화 E.을 사용하는 것이 중요하다 Hsp104가 특이한 코돈 바이어스가 있기 때문에 대장균이 변형.
  2. 100mL 2XYT 문화 (USB.의 레시피 : 16g / L 카세 펩톤, 10g / L 효모 추출물, 5g / L NaCl, 산도 7.0) 예방 100μg/mL 암피실린 신선한 transformants와 34μg/mL chloramphenicol과 보충과 37 야간 성장 ° 200rpm에서 잡고 C.
  3. 6 2L flasks에 100μg/mL 암피실린 및 34μg/mL chloramphenicol과 X 1L 2XYT에 밤새 문화 10mL의 예방. 37 ° C까지 OD 600 = 0.4-0.6에서 250rpm으로 흔들어. 떨고 중지하고 15 온도를 감소 ° C. 그것이 15 ° C.에 도달할 때까지 세포 배양기에서 30 분 대한 unagitated 평형 수 있도록 허용 일단 15 ° C는 1mM의 최종 농도에 IPTG를 추가하여 단​​백질 발현을 유도에 도달입니다. (12-16시간) 숙박 250rpm에서 떨고 이력서.

2. 세포 수확 및 용해

  1. 4 20 분을 위해 4,000 rpm으로 원심 분리하여 세포를 수확 (precooled 로터에서) ° C (우리가 Sorvall RC 3BP + 원심 분리기를 사용하여). Hsp104 활동이 저하되기 때문에 후속 절차를 즉시 실시해야 할 때 E. 대장균 세포가 동결됩니다. 또한, 이후의 모든 단계가 얼음 또는 4 ° C.에서 수행되어야
  2. prechilled에 Resuspend 세포 펠렛 (얼음) 10mL에 용해 완충액 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 500mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 20mM 이미다졸, 5μM pepstatin, 전체 테아제 억제제 칵테일 (1 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 무료 tablet/50mL) 및 2mM β - 메르 캅 토 에탄올).
  3. 얼음 물 속에 잠겨 열 교환기를 사용하는 프랑스 언론 (Emulsiflex) 균 질기와 세포 Lyse. 사용하기 전에 모든 셀 대단히 짧은 시간이 solubilized되었는지 확인합니다. 용해 버퍼 균 질기를 equilibrating 후, 15,000-18,000 PSI의 압력으로 실린더를 통해이 통과 완전 용해 충분합니다. 프랑스 언론 사용할 수없는 경우, sonication 다음 라이 소 자임과 부화는 (토론 참조) 사용할 수 있습니다. SDS - PAGE 분석 (1μL) (그림 Lysate. 2) lysed 세포의 작은 샘플을 저장합니다.
  4. 4 20 분을 위해 16,000 rpm으로 원심 분리하여 세포 파편을 제거 ° C (우리가 + centifuge Sorvall RC5C를 사용). 다음 단계에 뜨는 유지하고 SDS - PAGE 분석을위한 표면에 뜨는 작은 샘플 (1μL)를 저장 (그림 니켈로드합니다. 2).

3. Hsp104 정화

  1. 용해 버퍼 equilibrated 니켈 - 세파 로스 비즈 (GE)의 50 % 슬러리의 12mL (세포의 1L 당 2mL 니켈 - 세파 로스 비즈)와 단계 2.4에서 뜨는 섞는다.
  2. 4 3 시간 동안 천천히 샘플을 회전 ° C 니켈 - 세파 로스가 균일하게 정지하고 했겠이 최소화 남아있을 것이다. 짧은 배양 시간은 가능하지만, 수확량을 감소합니다. 4 ° 프로 테아제 억제제의 존재에 C, 약간의 저하가 발생하고, 3시간 니켈 - 세파 로스 보육 시간은 최종 제품의 활동을 감소하지 않습니다. 4 2 분 원심 분리에 의해 니켈 - 세파 로스를 수집 ° C 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R). SDS - PAGE 분석 (1μL)에 뜨는 작은 샘플을 저장하고 (그림을 통해 니켈 흐름 (FT). 2) 나머지는 폐기.
  3. 세척 버퍼 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 150mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 20mM 이미다졸, 2mM β - 메르 캅 토 에탄올), 5 열 볼륨의 25 열 볼륨으로 검색 니켈 - 세파 로스 씻으십시오 Hsp104에 electrostatically 바인딩 오염 및 세척 버퍼의 25 열 볼륨을 제거 1M KCl과 버퍼를 씻는다. 4 2 분 원심 분리하여 각 씻고 나서 니켈 - 세파 로스를 수집 ° C 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R). 각각의 세척과 원심 분리 사이클 후 흡인하여 버퍼를 제거합니다.
  4. 1mL 용출 1mL 니켈 - 세파 로스마다 버퍼 (40mM HEPES - 코이 산도 7.4, 150mM KCl, 20mM MgCl 2, 2.5 % (W / V) 글리세롤, 350mM 이미다졸, 2mM β - 메르 캅 토 에탄올)과 함께 Hsp104, 믹스 니켈 - 세파 로스를 elute하기 4 ° C 20 분 동안 회전합니다. 높은 이미다졸 농도는 니켈 비드 - 그의 여섯 상호 작용을 방해. 4 2 분 원심 분리하여 빈 1.2 ML 회전 열 (생체 RAD) · 2,000 RPM (Eppendorf 원심 분리기 5810R)에서 C와 니켈 - 세파 로스를 제거합니다. (그림 니켈의 eluate합니다. 2) SDS - PAGE 분석을위한 eluate의 1μL을 저장합니다. 세포의 모든 리터 들어, Hsp104의 ~ 15mg이 단계에서 얻어진다.
  5. MWCO 30,000 Amicon 울트라 (밀을 사용하여 버퍼 Q (20mM 트리스 - HCL 산도 8, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5mM MgCl 2, 50mM NaCl)에 버퍼 교환 eluatelipore) 15mL 원심 농축기 단위. 첫째, 10 배 단백질을 희석하기 위해 버퍼의 Q 14.5mL를 추가 후 ~ 1.5mL에 단백질을 집중. 버퍼 교환 3 회 반복합니다. 증가 산도 낮은 소금 Hsp104가 높은 부정적인 요금을 보장합니다.
  6. 버퍼 Q equilibrated 자원 Q 6mL 칼럼 (GE)를 사용하여 음이온 교환 크로마 토그래피를 통해 Hsp104 정화. 주입 전에 단백질이 낮은 단백질 바인딩 Millex GP PES 분리막 0.22μM 주사기 필터 (Millipore)를 통해 필터링됩니다. 우리는 1mL/min의 유량을 사용합니다. 20 %의 버퍼 1 열 볼륨 약하게 결합 단백질 거리에 씻으 Q + (20mM 트리스 - HCL 산도 8, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5mM MgCl 2, 1M NaCl). 5 열 권 이상의 선형 그라디언트로 Elute Hsp104 (20 % -50 % 버퍼 Q +) (그림 3). 1ml 분수를 수집합니다. Hsp104 대부분의 변종은 일반적으로 ~ 400mM NaCl (31mS/cm)에 elute. SDS - PAGE 분석 (그림 3, 삽입)에 대한 최대 분수 (1μL)의 샘플을 저장합니다.
  7. Amicon 원심 농축기를 사용하여 그의 6 태그를 제거하려면, 교환 단백질은 절단 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 및 2)에 (단계 3.5 참조) 위의 설명합니다. 제조 업체의 지침에 따라 proTEV 단백 분해 효소 (Promega) 또는 AcTEV 프로 테아제 (Invitrogen)을 사용합니다. Hsp104 전체 절단에 필요한 다음과 같습니다 Hsp104 위해, 우리는 TEV 프로 테아제의 높은 비율을 것으로 나타났습니다. 우리는 12μg Hsp104 당 1 프로 테아제 단위의 비율을 사용합니다. 절단은 4, 16 시간 보육 ° C. 다음, 2-4 시간 동안 30 ° C에서 수행되어야 최종 Hsp104 농도는 20 - 75μM 모노머 사이 여야합니다. 초과 절단 반응에 Hsp104의 금액 (비즈 짐을 수지 ML 당 단백질 15mg 바인딩할 수 있습니다 가정)을 니켈 - 세파 로스를 추가하여 니켈 - 세파 로스 (GE)과 나머지 His6 - 태그 Hsp104 및 TEV 프로 테아제를 고갈. 4 2,0​​00 RPM에서 2min에 대한 centrifuging하여 빈 스핀 열 (생체 RAD)으로 구슬을 제거 ° C. 절단, 그리고 uncleaved 단백질의 제거 (그림 4) 보장하기 위해 SDS - PAGE 분석을위한 절단 (1μL) 전후의 샘플을 수집합니다.
  8. 3.5 단계에서 설명한대로 MWCO 30,000 Amicon 울트라 (Millipore)를 사용하여 크기를 제외 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1mM DTT)로 교환.
  9. 더 크기 배제 크로마 토그래피를 통해 Hsp104 정화. 크기 제외 버퍼 equilibrated Superose 6 또는 Superdex 200 열 (GE에서 모두) (그림 5)를 사용합니다. 주입 전에 단백질이 낮은 단백질 바인딩 Millex GP PES 분리막 0.22μM 주사기 필터 (Millipore)를 통해 필터링됩니다. 단백질 미만 10mg 들어, 3백분의 10 사이즈 열 (24mL)을 사용할 수 있으며 0.5ml 분수가 수집됩니다. 10mg보다 큰 샘플의 경우 60분의 12 크기 열이 (120mL)을 사용해야하고 1 ML의 분수는 회수됩니다. 흐름 속도와로드 샘플 볼륨에 대한 제조 업체의 지침을 참조하십시오. 정화 후, Hsp104의 분수가 같은 그림에 표시된 풀링됩니다. 5 Amicon 원심 농축기 장치 (Millipore)에 집중. 아래에 설명된대로 Hsp104가 저장됩니다. 전체 길이 Hsp104을 정화의 최종 수율이 문화를 시작하는 ~ 1 - 3mg 당 리터입니다 Hsp104 저하 제품 및 오염 물질을 분리 물질의 손실로 인해.

4. Hsp104 Disaggregase 활동

  1. 정화 후에, 그것은 disaggregation 분석에 Hsp104 활동을 평가하는 것이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 루시페라제 재가입 분석 2 (그림 6) 사용합니다. 이 분석에서 Hsp70 보호자 시스템 (Hsp70와 Hsp40) disaggregates 요소 - 변성 반딧불 루시페라제 합산이와 함께 Hsp104. 가용성 루시페라제는 oxyluciferin, 빛을 출시 반응 luciferin의 산화를 catalyzes. 모니터링 발광, 상대 재활 성화, 따라서 disaggregation으로 루시페라제의 결정 수 있습니다. Hsp104는 synergistically Hsp70 공동 보호자 시스템과 협력 수 있어야합니다. 복구 발광의 양은 정확한 Hsp70에 따라 달라집니다 : Hsp40 쌍이 활용. 우리는 일상적으로 Hsp72와 Hsp40을 (분석 설계) 사용합니다. 혼자 Hsp40 (그림 6) : 최소한 활성 Hsp104은 Hsp72에 의해 재활 성화에 비해 루시페라제의 재활 성화에 5 배 증가를 생산한다. 활동의이 수준에 도달하지 Hsp104 준비가 삭제됩니다.

5. Hsp104 저장

  1. 단기 저장을 위해, Hsp104는 ° C 크기 제외 버퍼 4 보관하실 수 있습니다. 그러나, 활동 ° C와 급격히 일주 후 4 4 2-3일 후 감소됩니다 ° C. disaggregation의 assays을 위해 우리는 Hsp104가 정화 후에 가능한 빨리 사용해야하는 것이 좋습니다. 이상적으로, Hsp104는 아밀로이드 disaggregation의 assays 즉시 사용해야합니다.
  2. 단백질은 장기 저장해야하는 경우 Hsp104이 저장 버퍼 (20mM HEPES - 코이 산도 7.4, 140mM KCl, 10mM MgCl 2, 0.1mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1mM DTT, 10 % 글리세롤 (W / V))로 교환합니다. 100μl aliquots는 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C.에 저장된 스냅 아르 동결 - 해동 사이클이 대폭 Hsp104 활동을 줄일 수그리고는 피해야한다. 우리는 천천히 얼음에 Hsp104을 해동하는 것이 좋습니다. 아밀로이드 - disaggregase 활동 -80 1 개월 후 급격히 감소됩니다 ° C.

6. 대표 결과 및 피규어 :

figure-protocol-6829
그림 1. Hsp104은 Bifunctional disaggregase입니다. 무질서 집계 (왼쪽 그림 참조)의 Disaggregation은 Hsp70 보호자 시스템 (Hsp70와 Hsp40) 2의 협력이 필요합니다. Hsp104의 remodels은 체외에서 Hsp70와 Hsp40의 도움없이 아밀로이드 집계를 (오른쪽 그림 참조) 주문하지만, Hsp70과 Hsp40은 아밀로이드 26,28에 대한 Hsp104 활동을 향상시킬 수 있습니다. 총체적 구조, disaggregation을 촉진하기 위해 중앙 채널을 통해 기판 ​​translocation에 Hsp104 커플 ATP 가수 분해의 두 가지 유형에 대한. 티로신 베어링 구멍 루프는 중앙 채널을 49-52로 셔틀 기판 참여합니다.

figure-protocol-7367
그림 2. 니켈 - 세파 로스 선호도 정화 단계의 SDS - PAGE 분석. Lysate, 니켈로드, 니켈 FT와 니켈의 eluate 샘플 40~20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE에 의해 fractionated되었습니다 . 모든 Hsp104가있는 NI - 세파 로스에 바인딩할 수입니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)이 (차선 왼쪽) 표시됩니다.

figure-protocol-7722
그림 3. 니켈 - 세파 로스의 eluate의 자원 Q 정화. 블루 추적은 280nm, 녹색 추적에서 흡광도를 나타냅니다는 % 버퍼 Q +를 (50 %에서 최대) 나타냅니다. 20 % elutes 첫 번째 피크, Q + 불순물, 열화 제품과 부적 절한 접힌 Hsp104가 포함되어 있습니다. 두 번째 주요 피크 제대로 접힌 적극 Hsp104가 포함되어 있습니다. 흐름 율은 1ml/min되었습니다. 20-50% Q +에서 기울기는 30 분 또는 5 열 볼륨입니다. 삽입 : 피크 분수가 4-20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE 분석하여 해결하고 있습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다.

figure-protocol-8223
그림 4. proTEV 프로 테아제 절단 단계의 SDS - PAGE 분석. 그의 6 Hsp104 자원 Q 정화의 30 4 다음 ° C와 16시간 ° C. 4 시간 동안 proTEV 프로 테아제로 처리했습니다 샘플 4~20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE에 의해 fractionated되었습니다. proTEV 죽습 Hsp104 더 신속하게 마이 그 레이션합니다. 3.7 단계에서 설명한대로 TEV 프로 테아제와 uncleaved Hsp104는 니켈 - 세파 로스와 소진되었습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다.

figure-protocol-8692
그림 5. Hsp104의 크기 - 배제 정화가. Hsp104가 더욱 Superose 6 겔 여과 칼럼 (3백분의 10, GE)를 통해 정화했다 죽습. 유속 = 0.4ml/min. 점선 라인 사이의 절정은 풀링된 분수를 나타냅니다. 삽입 : 피크 분수가 4-20% 트리스 - HCL 1.0mm 기준 젤 (생물 RAD) 및 Coomassie 자국을 사용하여 SDS - PAGE 분석하여 해결하고 있습니다. 광범위한 분자량 마커 (생체 RAD)가 (왼쪽) 표시됩니다.

figure-protocol-9062
그림 6. 루시페라제 재활 성화 분석. 변성 반딧불 루시페라제 집계 (50nM)는 25 ° C.에서 Hsp72와 Hsp40 (1μM) (분석 설계에서 모두), Hsp104 (6μM 모노머) 또는 Hsp104, Hsp72와 Hsp40에 대한 90 분 중 하나와 함께 incubated되었습니다 변성 루시페라제은 완전히 Hsp104와 Hsp40/Hsp72 모두의 면전에서 활성화됩니다. 복구된 발광은 무한 M1000 플레이트 리더 (Tecan)에서 측정됩니다. 값 의미 ± SEM (N = 3)을 나타냅니다.

토론

타임 라인 : 최대한 Hsp104 활동에 우리가 전체 정화 체계는 최대한 신속하게 완료하는 것이 좋습니다. 그러나, 정화 단계의 숫자는 항상 실용적되지 않을 수 있습니다 요구하는 일정을 만듭니다. 정화 단계가 가능한 빨리 실시하는 경우, 30에서 부화의 2-4시간까지 밤새 표현의 마지막에서 시간 ° TEV 프로 테아제와 C가 약 9~11시간입니다. 일시 정지 한 잠재적인 장소는 TEV 절단 단계를 수행합니?...

공개

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작품은 NIH (5T32GM008275 - 22)와 미국 심장 협회 predoctoral 교제 (EAS)을에서 교부금에 의해 지원되었다; 화학 - 생물학 인터페이스 NIH (2T32GM071339 - 06A1) (MED로)에서 원정, 그리고으로부터 보조금 NIH (1DP2OD002177 - 01 및 NS067354 - 0110), 엘리슨 의료 재단, 그리고 빌과 멜린다 게이츠 재단 (JS로).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
시약의 이름 회사 카탈로그 번호
BL21 - CodonPlus - RIL 관할 전지 Stratagene, 애질런트 테크놀로지 230255
2XYT 국물 USB 75,864
완료, 미니, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) - 무료 프로 테아제 억제제의 정제 호슈 1,836,170
Pepstatin 시그마 P4265
NI - 세파 로스 6 빠른 흐름 GE 헬스케어 17-5318-02
Amicon 울트라 - 15 원심 필터 유닛 (MWCO 30,000) Millipore UFC903008
자원 Q - 6ml 칼럼 GE 헬스케어 17-1179-01
proTEV 프로 테아제 Promega V6052
AcTEV 프로 테아제 Invitrogen 12575015
Superose 6 3백분의 10 GL GE 헬스케어 17-5172-01
Hsp40 분석 설계 SPP - 400
Hsp72 분석 설계 ADI - NSP - 555

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