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Method Article
Ici, nous décrivons un protocole pour la purification de la très active Hsp104, un AAA + hexamérique protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la désagrégation des protéines. Ce schéma exploite une construction His6-marqués pour la purification d'affinité à partir E. coli Suivie par chromatographie échangeuse d'anions, His6-tag retrait avec la protéase TEV, et chromatographie d'exclusion stérique.
Hsp104 est un hexamère AAA + 1 à partir de protéines de la levure, qui couple l'hydrolyse d'ATP à la protéine de désagrégation 2-10 (Fig. 1). Cette activité confère deux grands avantages sélectifs. Tout d'abord, la renaturation des agrégats désordonnés par Hsp104 permet la survie de la levure après diverses protéines-repliement souligne, notamment 3,5,11,12 choc thermique. Deuxièmement, le remodelage des fibrilles amyloïdes bêta par la Croix-Hsp104 permet d'exploiter la levure prions myriades (amyloïdes infectieux) comme un réservoir de bénéfique et héritable variation phénotypique 13-22. Remarquablement, Hsp104 remodèle directement oligomères preamyloid et fibrilles amyloïdes, y compris ceux comprenant des protéines prion de levure et de SUP35 URE2 23-30. Cette fonctionnalité amyloïde remodelage est une facette spécialisée de la levure Hsp104. Le E. orthologue coli, CLPB, ne parvient pas à transformer ou oligomères preamyloid fibrilles amyloïdes 26,31,32.
Orthologues Hsp104 se trouvent dans tous les règnes de la vie, sauf, perplexingly, les animaux. En effet, si les cellules animales possèdent aucun système enzymatique que la désagrégation de protéines aux couples de renaturation (plutôt que de la dégradation) demeure inconnue 33-35. Ainsi, nous et d'autres ont proposé que Hsp104 pourrait être développé comme un agent thérapeutique pour diverses maladies neurodégénératives liées au mauvais repliement de protéines spécifiques dans les oligomères preamyloid toxiques et fibrilles amyloïdes 4,7,23,36-38. Il n'y a pas de traitements qui ciblent directement les espèces agrégées associées à ces maladies. Pourtant, Hsp104 dissout oligomères toxiques et fibrilles amyloïdes composé d'alpha-synucléine, qui sont liés à la maladie de Parkinson 23 ainsi que les formes de PrP amyloïde 39. Surtout, Hsp104 réduit l'agrégation des protéines et améliore la neurodégénérescence dans des modèles rongeurs de la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington 23 38. Idéalement, pour optimiser le traitement et de minimiser les effets secondaires, Hsp104 serait conçu et potentialisé de façon sélective remodeler agrégats spécifiques au centre de la maladie en question 4,7. Cependant, la compréhension limitée structurelles et mécanistiques sur la manière dont Hsp104 désagrège un tel répertoire varié de structures agrégées et les protéines non liées frustre ces efforts 30,40-42.
Pour comprendre la structure et le mécanisme de Hsp104, il est essentiel d'étudier la protéine pure et reconstituer son activité disaggregase avec des composants minimes. Hsp104 est une protéine 102kDa avec un pI de 5,3 ~, qui hexamerizes, en présence de l'ADP ou l'ATP, ou à des concentrations élevées de protéines en l'absence de 43-46 nucléotides. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour la purification de très actif, stable Hsp104 de E. coli. L'utilisation de E. coli permet simplifiée production à grande échelle et à notre méthode peut être effectuée rapidement et de manière fiable pour de nombreuses variantes Hsp104. Notre protocole augmente Hsp104 pureté et simplifie son 6-tag retrait par rapport à un procédé de purification préalable de E. coli 47. Par ailleurs, notre protocole est plus facile et pratique de deux protocoles les plus récents 26,48.
1. Expression de Hsp104
2. La récolte des cellules et Lysis
3. Purification Hsp104
4. Hsp104 Disaggregase activité
5. Hsp104 stockage
6. Les résultats représentatifs et chiffres:
Figure 1. Hsp104 est un disaggregase bifonctionnels. Désagrégation des agrégats désordonnés (indiqué sur la gauche) nécessite la coopération du système de chaperon Hsp70 (Hsp70 et HSP40) 2. Remodèle Hsp104 commandé agrégats amyloïdes (montré à droite) sans l'aide de Hsp70 et HSP40 in vitro, mais Hsp70 et HSP40 peut améliorer Hsp104 activité contre 26,28 amyloïde. Pour les deux types de structures globales, Hsp104 couples ATP hydrolyse à la translocation du substrat à travers son canal central pour promouvoir la désagrégation. Boucles interstitielles Tyrosine portant engager et substrat de navette à travers le canal central 49-52.
Figure 2. Analyse SDS-PAGE de Ni-sépharose étape de purification par affinité. Lysat, Charge Ni, Ni FT et des échantillons ont été fractionnés éluat Ni par SDS-PAGE en utilisant un 4-20% Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie . Notez que tous les Hsp104 est capable de se lier à la Ni-sépharose. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont représentés (voie de gauche).
Figure 3. Resource Q purification de Ni-sépharose éluat. Trace bleue représente l'absorbance à 280nm et oligo-vert représente Tampon% Q + (maximum à 50%). Le premier pic, qui élue à 20% Q + contient des impuretés, des produits de dégradation et mal plié Hsp104. Le deuxième pic et les grandes contient correctement repliée et active Hsp104. Le débit était de 1mL/min. Dégradé de 20-50% Q + est de 30 minutes ou 5 volumes de colonne. En médaillon: fractions de pic sont résolus par analyse SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche).
Figure 4. Analyse SDS-PAGE de l'étape proTEV clivage de la protéase. Sa 6-Hsp104 de Resource Q de purification a été traité avec de la protéase proTEV pendant 4 heures à 30 ° C puis 16 heures à 4 ° C. Les échantillons ont été fractionnés par l'SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Notez que proTEV clivé Hsp104 migre plus rapidement. VET protéase et non clivée Hsp104 ont été épuisées avec Ni-Sépharose comme décrit dans l'étape 3.7. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche).
Figure 5. Taille-exclusion purification de Hsp104. Clivées Hsp104 a encore été purifié par une colonne de Superose 6 filtration sur gel (10/300, GE). = Débit 0.4ml/min. Le sommet entre les lignes en pointillés représente fractions regroupées. En médaillon: fractions de pic sont résolus par analyse SDS-PAGE en utilisant un 40-20% de Tris-HCl 1.0mm Critère gel (Bio-Rad) et colorées au bleu de Coomassie. Large gamme de marqueurs de poids moléculaire (Bio-Rad) sont affichés (à gauche).
Figure 6. Dosage de la réactivation luciférase. Dénaturé agrégats luciférase de luciole (50 nM) ont été incubées soit avec Hsp72 et HSP40 (1 uM) (tous deux de Assay Designs), Hsp104 (6 microns monomère) ou Hsp104, Hsp72 et HSP40 pour 90min à 25 ° C. Luciférase dénaturé n'est pleinement réactivé, en présence de deux Hsp104 et Hsp40/Hsp72. Luminescence récupéré est mesuré sur une plaque de Infini M1000 (Tecan) lecteur. Les valeurs représentent la moyenne ± SEM (n = 3).
Chronologie: Pour Hsp104 activité maximale, nous recommandons que le schéma de purification entière soit achevée aussi rapidement que possible. Cependant, le nombre d'étapes de purification rend un horaire exigeant qui ne peuvent pas toujours être pratique. Si les étapes de purification sont effectués aussi rapidement que possible, le temps de la fin de l'expression du jour au lendemain grâce à l'2-4 heures d'incubation à 30 ° C avec TEV protéase est d'environ 9-11 heures. Un lieu...
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH (5T32GM008275-22) et une bourse de l'American Heart Association prédoctoral (à EAS); une bourse de l'interface chimie-biologie du NIH (2T32GM071339-06A1) (à MED) et des subventions de la NIH (1DP2OD002177-01 et NS067354-0110), Le Ellison Medical Foundation et la Fondation Bill et Melinda Gates Foundation (JS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | |
---|---|---|---|
BL21-CodonPlus-RIL cellules compétentes | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
2xYT bouillon | USB | 75864 | |
Complète, mini, de l'EDTA-libres comprimés inhibiteur de protéase | Roche | 1836170 | |
Pepstatine A | Sigma | P4265 | |
Ni-Sépharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
Amicon Ultra-15 centrifuges unités de filtration (MWCO 30000) | Millipore | UFC903008 | |
Resource Q - colonne de 6ml | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
proTEV protéase | Promega | V6052 | |
AcTEV protéase | Invitrogen | 12575015 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
HSP40 | Assay Designs | PSP-400 | |
Hsp72 | Assay Designs | ADI-NSP-555 |
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