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Method Article
Aquí se describe un protocolo para la purificación de gran actividad Hsp104, un AAA hexameric + proteína de la levadura, que se acopla la hidrólisis de ATP con el desglose de proteínas. Este esquema se aprovecha de una construcción de His6-etiquetados para la purificación de afinidad de E. coli Seguido por cromatografía de intercambio aniónico, His6-tag con la eliminación de la proteasa TEV, y la cromatografía de exclusión por tamaño.
Hsp104 es un hexameric AAA + proteína 1 de la levadura, que se acopla la hidrólisis del ATP a la proteína de desagregación 2-10 (Fig. 1). Esta actividad se imparte dos ventajas selectivas clave. En primer lugar, la renaturalización de los agregados desordenados por Hsp104 faculta la supervivencia de hongos después de varios mal plegamiento de proteínas, destaca, como golpe de calor 3,5,11,12. En segundo lugar, la remodelación de las fibrillas de amiloide-beta cruzada por Hsp104 permite a la levadura para explotar miles de priones (amiloides infecciosas) como un reservorio de beneficios y las variaciones hereditarias fenotípica 13-22. Sorprendentemente, Hsp104 directamente remodelaciones oligómeros preamyloid y fibrillas de amiloide, incluyendo los que forman parte de las proteínas de priones de levadura Sup35 y 23-30 Ure2. Esta funcionalidad-amiloide remodelación es una faceta especializada de la levadura Hsp104. La E. orthologue coli, CLPB, no oligómeros preamyloid remodelar o fibrillas de amiloide 26,31,32.
Ortólogos Hsp104 se encuentran en todos los reinos de la vida, excepto, sorprendentemente, los animales. En efecto, si las células animales poseen un sistema enzimático que desglose las parejas de proteínas para la renaturalización (en lugar de la degradación) sigue siendo desconocido 33-35. Por lo tanto, nosotros y otros han propuesto que Hsp104 podría ser desarrollado como un agente terapéutico para diversas enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el mal plegamiento de proteínas específicas en oligómeros preamyloid tóxicos y fibrillas de amiloide 4,7,23,36-38. No existen tratamientos que afectan directamente a las especies agregados asociados a estas enfermedades. Sin embargo, se disuelve Hsp104 oligómeros tóxicos y fibrillas de amiloide compuesto de alfa-sinucleína, que se relacionan con la enfermedad de Parkinson 23, así como las formas de PrP-amiloide 39. Es importante destacar que Hsp104 reduce la agregación de proteínas y mejora la neurodegeneración en modelos de roedores de la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Huntington 23 38. Lo ideal sería que, para optimizar el tratamiento y minimizar los efectos secundarios, Hsp104 sería diseñado y potenciado para remodelar de forma selectiva agregados específicos en el centro de la enfermedad en cuestión 4,7. Sin embargo, la limitada comprensión estructural y mecánica de cómo Hsp104 desagrega un repertorio diverso de las estructuras de agregados y proteínas no relacionadas frustra los esfuerzos 30,40-42.
Para comprender la estructura y el mecanismo de Hsp104, es esencial para el estudio de la proteína pura y reconstituir su actividad disaggregase con un mínimo de componentes. Hsp104 es una proteína con un pI 102kDa de ~ 5.3, que hexamerizes en presencia de ADP o ATP, o en las concentraciones de proteínas en ausencia de nucleótidos 43-46. Aquí se describe un protocolo optimizado para la purificación de la muy activa, estable Hsp104 de E. coli. El uso de E. coli permite simplificar en gran escala de producción y nuestro método se puede realizar de forma rápida y fiable para numerosos Hsp104 variantes. Nuestro protocolo aumenta Hsp104 pureza y simplifica 6-Su etiqueta de la eliminación en comparación con un método de purificación previa de E. coli 47. Por otra parte, el protocolo es más fácil y conveniente de dos protocolos más recientes 26,48.
1. Expresión de Hsp104
2. Lisis de células y
3. Hsp104 Purificación
4. Hsp104 Disaggregase Actividad
5. Hsp104 de almacenamiento
6. Los resultados representativos y cifras:
Figura 1. Hsp104 es un disaggregase bifuncionales. Desagregación de los agregados desordenados (que se muestra a la izquierda) se requiere la cooperación del sistema de chaperona Hsp70 (Hsp70 y Hsp40) 2. Remodelaciones Hsp104 ordenó agregados amiloides (como se muestra a la derecha) sin la ayuda de Hsp70 y Hsp40 in vitro, pero Hsp70 y Hsp40 puede mejorar Hsp104 actividad contra amiloide 26,28. Para ambos tipos de estructuras agregadas, Hsp104 parejas hidrólisis de ATP a la translocación del sustrato a través de su canal central para promover la desagregación. Tirosina-teniendo lazos de poro participar y el sustrato de transporte a través del canal central 49-52.
Figura 2. SDS-PAGE análisis de Ni-sefarosa etapa de purificación de afinidad. Lisado, carga Ni, Ni FT y las muestras Ni eluido se fraccionaron por SDS-PAGE con un 20.4% Tris-HCl 1,0 Criterio gel (Bio-Rad) y se tiñeron con Coomassie . Tenga en cuenta que no todos los Hsp104 es capaz de unirse a la Ni-sefarosa. Amplia gama de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) se muestran (carril de la izquierda).
Figura 3. Recursos de purificación Q de Ni-sefarosa eluido. Rastro azul representa la absorbancia a 280 nm rastro y el verde representa buffer% Q + (máximo del 50%). El primer pico que eluye a 20% Q + contiene impurezas, productos de degradación y mal doblada Hsp104. El segundo pico y las principales contiene plegada correctamente y activa Hsp104. Caudal fue 1ml/min. Gradiente de 20 a 50% Q + es de 30 minutos o 5 volúmenes de columna. Recuadro: fracciones de los picos son resueltas por SDS-PAGE análisis utilizando un 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterio gel (Bio-Rad) y se tiñeron con Coomassie. Amplia gama de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) se muestran (izquierda).
Figura 4. SDS-PAGE análisis de paso proTEV escisión de la proteasa. 6-Su Hsp104 de Recursos purificación Q fue tratada con proteasa proTEV durante 4 horas a 30 ° C y luego 16 horas a 4 ° C. Las muestras fueron fraccionadas por SDS-PAGE con un 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterio gel (Bio-Rad) y se tiñeron con Coomassie. Tenga en cuenta que proTEV escinde Hsp104 migra más rápidamente. VET proteasa y uncleaved Hsp104 se han agotado con Ni-Sepharose como se describe en el Paso 3.7. Amplia gama de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) se muestran (izquierda).
Figura 5. De exclusión por tamaño de purificación de Hsp104. Escinde Hsp104 fue purificado a través de un Superose 6 columna de filtración en gel (10/300, GE). Caudal = 0.4ml/min. El pico entre las líneas de trazos representa fracciones reunidas. Recuadro: fracciones de los picos son resueltas por SDS-PAGE análisis utilizando un 4-20% Tris-HCl 1,0 Criterio gel (Bio-Rad) y se tiñeron con Coomassie. Amplia gama de marcadores de peso molecular (Bio-Rad) se muestran (izquierda).
Figura 6. Ensayo de reactivación de la luciferasa. Desnaturalizado agregados luciferasa de luciérnaga (50nm) se incubaron con Hsp72 y Hsp40 (1μM) (ambos de los diseños de ensayo), Hsp104 (6μM monómero) o Hsp104, Hsp72 y Hsp40 de 90 minutos a 25 ° C. Luciferasa desnaturalizado sólo es plenamente reactivada en la presencia de ambos Hsp104 y Hsp40/Hsp72. Luminiscencia recuperado se mide en un lector de placas M1000 Infinito (Tecan). Los valores representan la media ± SEM (n = 3).
Cronología: Para la máxima actividad Hsp104 se recomienda que el esquema de purificación se complete toda la mayor rapidez posible. Sin embargo, el número de etapas de purificación hace un exigente calendario que no siempre es práctico. Si las etapas de purificación se lleva a cabo lo más rápidamente posible, el tiempo desde el final de la expresión a través de la noche a la 02.04 horas de incubación a 30 ° C con TEV proteasa es de aproximadamente 9-11 horas. Un lugar potencial para hacer una pausa e...
No hay conflictos de interés declarado.
Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (5T32GM008275-22) y la American Heart beca predoctoral Asociación (a EAS), un interfaz química-biología beca del NIH (2T32GM071339-06A1) (a MED), y subvenciones de la NIH (1DP2OD002177-01 y NS067354 0110), la Ellison Medical Foundation y la Fundación Bill y Melinda Gates (a JS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
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BL21-CodonPlus-RIL células competentes | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
2XYT caldo | USB | 75864 | |
Completo, minibar, EDTA libre de tabletas de inhibidores de la proteasa | Roche | 1836170 | |
A pepstatina | Sigma | P4265 | |
Ni-Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
Amicon Ultra-15 unidades centrífugas filtro (MWCO 30.000) | Millipore | UFC903008 | |
Recursos Q - columna 6 ml | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
proTEV de la proteasa | Promega | V6052 | |
AcTEV de la proteasa | Invitrogen | 12575015 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
Hsp40 | Diseño del ensayo | SPP-400 | |
Hsp72 | Diseño del ensayo | ADI-NSP-555 |
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