הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש

Summary

קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) עשיר myofibroblasts להציג בתוך stroma הגידול, לשחק תפקיד מרכזי נהיגה התקדמות הגידול. פיתחנו מודל הגידול coimplantation xengraft עבור ניסיוני להפקת CAFs מן fibroblasts החלב האנושי. הפרוטוקול מתאר כיצד להקים myofibroblasts CAF כי תרכוש את היכולת לקדם tumourigenesis.

Abstract

קרצינומות הם רקמות מורכבות מורכבת של תאים neoplastic ו תא שאינם סרטניים המכונה "stroma". Stroma מורכב תאי מטריקס (ECM) ועוד מגוון של תאים mesenchymal, כולל fibroblasts, myofibroblasts, לתאי אנדותל, pericytes ו לויקוציטים ^1-3.

Stroma הגידול הקשורים מגיב לאותות אוטוקריני משמעותי שפורסמו על ידי תאים קרצינומה השכנות. במהלך תהליך המחלה, stroma לעתים קרובות הופך מאוכלס קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) כולל מספר גדול של myofibroblasts. תאים אלה בעבר מופק הרבה סוגים שונים של קרצינומות האדם לתרבות במבחנה שלהם. Subpopulation של CAFs הוא להבחין באמצעות רגולציה-up שלהם אקטין α-שריר חלק (α-SMA) ביטוי ^4,5. תאים אלה הם סימן ההיכר של 'fibroblasts מופעל' החולקים מאפיינים דומים עם myofibroblasts גצפו ommonly ברקמות פצועים fibrotic ^6. הנוכחות של משנה זו CAF myofibroblastic קשורה מאוד בדרגה גבוהה ו ממאירות הקשורות התחזיות עניים חולים.

מעבדות רבות, כולל שלנו, הראו כי CAFs, כאשר הוזרקו תאים סרטן לעכברים immunodeficient, המסוגלים באופן משמעותי לקידום tumourigenesis ^7-10. CAFs מוכן מחולים קרצינומה עם זאת, לעיתים קרובות עוברים הזדקנות במהלך התפשטות תרבות להגביל את השימוש בהם פשיטות ברחבי ניסויים מתמשך. כדי להתגבר על קושי זה, פיתחנו שיטה חדשנית כדי להפיק בניסוי הנציח קווי האדם החלב CAF תא (exp-CAFs) מ fibroblasts החלב האנושי, באמצעות השד coimplantation הגידול מודל xenograft.

על מנת ליצור exp-CAFs, הורים fibroblasts החלב אדם, המתקבל הרקמה מאמופלסטית ירידה, היו הראשונים immortalised עם hTERT, למקטע הקטליטית של holoenzyme telomerase, ומתוכננים להביע GFP ו גן התנגדות puromycin. תאים אלה היו coimplanted עם MCF-7 אנושי קרצינומה של תאים בשד הבעת האונקוגן ras מופעל (MCF-7-ras תאים) לתוך xenograft עכבר. לאחר תקופת דגירה in vivo, fibroblasts המוזרק בתחילה החלב אדם חולצו מן xenografts הגידול על בסיס התנגדות puromycin שלהם ^11.

ראינו כי fibroblasts תושב החלב האדם מובחן, אימוץ פנוטיפ myofibroblastic ורכש הגידול בקידום נכסים במהלך התקדמות הגידול. חשוב לציין, התאים האלה, כהגדרתו exp-CAFs, מקרוב לחקות את הפנוטיפ הגידול קידום myofibroblastic של CAFs מבודד קרצינומות השד גזור מחולים. Xenograft הנגזרות הגידול שלנו exp-CAFs ולכן לספק מודל יעיל ללמוד את הביולוגיה של CAFs ב breas אדםלא קרצינומות. הפרוטוקול המתואר יכול להיות גם המורחבת להפקת ואפיון אוכלוסיות שונות CAF נגזר סוגים אחרים של קרצינומות האדם.

Protocol

1. בידוד ראשוני fibroblasts אדם מתורבת החלב הרגיל

הפרוצדורות לבידוד ראשוני fibroblasts תרבותי אנושי החלב הרגיל מתוארים באיור. 1A.

1. הכן את החיץ תא דיסוציאציה, כפי שתואר קודם לכן ^12: בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) עם 10% עוברית עגל בסרום (FCS), פניצילין, סטרפטומיצין (200 יחידות / מ"ל), collagenase סוג אני (1 מ"ג / מ"ל) ו hyaluronidase ( 125 יחידות / מ"ל).
2. שטפו את רקמת השד גזור מן מאמופלסטית ירידה (~ 0.5 גרם) כמה פעמים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). לרכך את הרקמה לרסיסים קטנים (<1.5 מ"מ ³⁾ באמצעות סכיני גילוח סטרילית.
3. מעבירים את שברי רקמה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכילה כמות מתאימה של התא מעל דיסוציאציה חיץ (10 מ"ל לגרם 0.5 של רקמה) ו מערבולת 1 דקות במהירות המרבית.
4. תקציר שברי הרקמה בתא דיסוציאציה חיץ fאו 12-18 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה איטי. ^* הערה שלא יהיו עוד חלקים רבים של קטעי רקמה מעוכלים הנותרים בצינור.
5. דגירה הצינור 5 דקות בטמפרטורת החדר, ללא תסיסה. העברת שהתקבל סטרומה תא מועשר supernatant לתוך צינור חרוטי חדשה באמצעות pipet סרולוגיות 5 מ"ל.
6. צנטריפוגה שבר סטרומה 5 דקות ב 250 X גרם ו resuspend גלולה תא PBS. צנטריפוגה שוב 5 דקות ב 250 X גרם ו resuspend התא גלולה ב DMEM FCS בתוספת 10%. התרבות התאים DMEM FCS המכיל 10% מנה 15 ס"מ פטרי ב 37 ° C ו פחמן דו חמצני 5%.
7. הפץ את התאים עד ומחוברות. זה יהיה בדרך כלל לוקח 80-10 ימים. אחסן את התאים ב -80 ° C באמצעות מדיום הקפאה (sulfoxide דימתיל 10% ו 20% FCS DMEM). הכן 5 מבחנות קפוא כמו מניות מקורית. הפשירי one בקבוקון ולהרחיב את התאים כדי להכין 5 צלוחיות עבור המניה משני המכיל fibroblasts passaged באוכלוסייה 5הכפלות (PDS) של הניסויים הבאים. נהלים אלה למזער מבחר המשובטים ומתח תרבות שעלולה להתרחש במהלך בתרבית רקמה המורחבת. ^* שים לב P1.1-7 יכול לשמש גם לבידוד CAFs מ קרצינומות השד מתקבל על ידי כריתה ^12.

2. דור ה-GFP, שכותרתו, puromycin עמידים, fibroblasts אדם הנציח החלב הרגיל

1. כדי להנציח fibroblasts העיקרי האדם החלב הרגיל מבודד P1.7), להציג pMIG retroviral (MSCV-IRES-GFP) וקטור ^12, המבטא הן hTERT ו-GFP. התרבות תאים 4-5 ימים ולאחר מכן למיין את ה-GFP חיובי תאים באמצעות cytometry הזרימה.
2. להציג retroviral pBabe-פורו לבנות קידוד גן התנגדות puromycin לתוך ה-GFP, שכותרתו fibroblasts הונצח. התרבות התאים ימים 5-7 בנוכחות puromycin (הריכוז הסופי: 1 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לבודד את ה-GFP חיובי (GFP +), puromycin עמידים (פורו ^R ) הנציח fibroblasts החלב האנושי.
3. בשלב הבא, כדי לבחון אם אלה fibroblasts לייצר וירוסים פעילים, מה שעלול להוביל להעברת האופקי של הגנים המקודדים GFP והתנגדות puromycin, לגדול 2.5x10 ⁵ GFP + ^R פורו הנציח fibroblasts החלב האנושי בצלחת פטרי 6 ס"מ על 2 ימים.
4. אמצעי סינון מותנה אלה fibroblasts באמצעות מסנן מזרק (גודל הנקבוביות: 0.45 מיקרומטר) ולהוסיף אותו על 10T1 / 2 תאים העכבר fibroblastic עבור 12 שעות בנוכחות סולפט protamine (5 מיקרוגרם / מ"ל) אשר מגדילה את היעילות של הידבקות בנגיף. המדיום הוא שינה לאחר מכן 10% FCS-DMEM עבור 2 ימים נוספים.
5. בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. 10T1 / 2 תאים נגועים על ידי נגיף ה-GFP יהפוך GFP חיובי. התייחס גם את התאים עם puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5-7 ימים ולבחון את הצלחת אם בכלל פורו ^R 10T1 / 2 תאים מושבות בהווה טופס לאחר הטיפול puromycin.
6. שים לב האופקי גן טראןsfer ידי וירוסים פעיל המיוצר על ידי ה-GFP ההורים + ^R פורו fibroblasts החלב אדם יכול להפוך את התאים Murine שמסביב ו / או קרצינומה של תאים GFP + ^R פורו בתוך xenografts הגידול. זה עלול לעכב את תהליכי לבודד את ה-GFP מוזרק בתחילה פורו + ^R fibroblasts החלב אדם מן xenografts הגידול.

3a. Coinjection של fibroblasts החלב אנושי עם תאים סרטן השד לעכבר immunodeficient

נהלים ניסיוני להפקת exp-CAFs מומחשים איור. 1Ba.

1. מערבבים 1x10 ⁶ MCF-7-ras האדם סרטן השד 3x10 ⁶ תאים GFP פורו ^{+ R,} הנציח fibroblasts החלב האנושי שנוצר P2.2). הכינו את התאים μl 400 של המדיום תרבות עם 50% (v / v) Matrigel לכל זריקה.
2. מזריקים את התערובת לתוך תא תת עורי עכבר בעירום immunodeficient. כאשר CAFs המחולצים עצמאי אחרגידולים, שתל כל התערובת לתוך הצלעות ימין ועל שמאל של עכברים שונים.

3b. הזרקה של fibroblasts החלב אדם לעכבר immunodeficient

1. כדי ליצור fibroblasts בקרה נגד exp-CAFs, להכין 3x10 ⁶ GFP פורו ^{+ R} fibroblasts הנציח החלב האנושי שנוצר P2.2 ב 400 μl של המדיום תרבות עם 50% (v / v) הזרקה Matrigel לכל (איור 1Bb). אל תערבב fibroblasts עם קרצינומה של תאים.
2. השתל fibroblasts שהוכנו P3b.1 לתוך אתרים תת עורית של עכברים בעירום.

^* שים לב fibroblasts מחוסן יהוו את רקמת הגידול fibroblastic אבל לא מתחת לעור.

4a. Dissection של xenograft הגידול

1. Euthanise העכבר מחסה אנושי סרטן השד תת עורית xenograft 42 ימים לאחר ההשתלה (איור 1Ba). ^* הערה כי כאשר תאים קרצינומה של אחרים ו / או fibroblasts הם coimplanted, Fibroblasts ייתכן שיהיה צורך מודגרות יותר מ 42 ימים בתוך xenograft הגידול ליזום פנוטיפ myofibroblastic שלהם.
2. קציר xenograft הגידול מן האגף של העכבר על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים. לטבול את רקמת הגידול PBS.

4b. Dissection xenograft של פיברובלסטים

1. Euthanise העכבר מחסה xenograft פיברובלסטים 42 ימים לאחר ההשתלה (איור 1Bb).
2. מנתחים את xenograft פיברובלסטים תת עורית באמצעות מלקחיים ומספריים. הנח את רקמת fibroblastic לתוך PBS. ^* שים לב xenograft פיברובלסטים, שמופיע כמו רקמה שקופה זעיר, עשוי להיות קשה למצוא מתחת לעור.

5. הכנת תאים בתרבית ראשונית של xenografts

1. השתמש הקבינט סטרילי biosafety לנתח את הגידול (~ 0.5 גרם) או רקמה fibroblastic (~ 0.1 גרם). העברת רקמות נכרת על החלק העליון של תרבות 15 ס"מ דאיש עם 1 מ"ל של PBS. לרכך את הרקמות לרסיסים רקמה קטנה (<1.5 מ"מ ³⁾ באמצעות סכיני גילוח סטרילית. * שים לב כי אם xenograft פיברובלסטים שוקל פחות מ 0.1 גרם, לאסוף xenografts כמה פיברובלסטים נוספים ומערבבים אותם יחד כדי להגדיל את מספר התאים לבידוד.
2. מעבירים את שברי רקמה לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל את תא דיסוציאציה חיץ (10 מ"ל לגרם 0.5 של רקמה) ו מערבולת 1 דקות במהירות המרבית.
3. לדגור על השעיית התא למשך 3 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה איטית רציפה.

6. בידוד של puromycin עמידים התאים בתרבית

1. צנטריפוגה ההשעיה התא ניתק גם מן xenograft הגידול או פיברובלסטים במשך 5 דקות ב 250 X גרם ו resuspend התא גלולה ב PBS. צנטריפוגה שוב 5 דקות ב 250 X ז Resuspend התא גלולה וכתוצאה מכך 10% FCS-DMEM. התרבות התאים צלחת פטרי 15 ס"מ בנוכחות puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) בשעה 37 ° Cופחמן דו חמצני 5% על מנת לחסל את כל התאים קרצינומה של זיהום ו / או בתאי סטרומה Murine. הפץ את התאים עד ומחוברות (2-4 שבועות). אחסן את התאים ב -80 ° C באמצעות מדיום ההקפאה. * הערה כי כתוצאה פורו תאים ^R, המיועד 42 יום בן exp-CAF1 (איור 1Ba) או לשלוט-1 תאים פיברובלסטים (איור 1Bb), הם בני אלמוות חיובית עבור ה-GFP. מומלץ לבדוק אם תאים אלו מייצרים וירוסים פעילים באמצעות 10T1 / 2 תאים, כמתואר P2.3-6.

7 א. בידוד של exp-CAF2 התאים בתרבית

כדי להמשיך לשפר את הפנוטיפ של myofibroblastic מופעל CAFs, מערבבים את 42 יום בן exp-CAF1 תאים עם MCF-7-ras תאים להזריק אותם שוב תת עורית לעכבר בעירום לתקופות נוספות של 200 ימים. לבתר לנתק את xenograft הגידול לתוך ההשעיה החד תא והתרבות התאים צלחת פטרי 15 ס"מ עם 10% FCS-DMEM בנוכחות puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל), כפי שצוין P60.1. הפץ את התאים עד ומחוברות (8-10 ימים). אחסן את התאים ב -80 ° C באמצעות מדיום ההקפאה. כתוצאה פורו תאים נקראים ^R-242 בן יומו exp-CAF2 התאים (איור 1Ba).

7b. הפקת תאים פיברובלסטים-2 לשלוט בתרבות

כדי ליצור fibroblasts בקרה נגד exp-CAF2 התאים, להזריק 42 יום בן פיברובלסטים-1 בקרת תאים לבד בלי קרצינומה של תאים תת עורית לעכבר ובנוסף בעירום עבור 200 ימים. לבתר לנתק את הרקמה fibroblastic לתוך ההשעיה תא בודד והתרבות התאים צלחת פטרי 15 ס"מ עם 10% FCS-DMEM בנוכחות puromycin (1 מיקרוגרם / מ"ל) כפי שצוין P6.1. הפץ את התאים עד ומחוברות (3-4 שבועות). אחסן את התאים ב -80 ° C באמצעות מדיום ההקפאה. כתוצאה פורו תאים ^R נקראים פיברובלסטים-2 בקרה תאים (איור 1Bb).

8. נציג תוצאות:

בקרת פיברובלסטים-2 ו-exp CAF2 cells, אשר היה שחולצו מן xenografts הגידול בשד, צבעונית מאוד חיובית עבור סמנים mesenchymal, כולל האדם הספציפי vimentin, prolyl-4-hydroxylase, קולגן 1A, פיברונקטין, S100A4, ועל פני השטח פיברובלסטים חלבון (איור 2 א) ^11, המציין אדם המקור וטבע mesenchymal של תאים אלה. לעומת זאת, cytokeratin, סמן לתאי האפיתל, לא היה מוכתם אלה ⁺ fibroblasts GFP (איור 2 ב). ממצאים אלה מצביעים על כך ולכן המחולץ exp-CAF2 ושליטה פיברובלסטים-2 התאים שמקורם מן fibroblasts ההורים החלב אדם הציג בתחילה לתוך xenografts העכבר.

חשוב לציין, שיעור גבוה יותר של exp-CAF2 תאים מוכתם חיובית SMA-α ו גליקופרוטאין תאי מטריקס tenascin ^C-5, אשר שניהם סמנים של myofibroblasts לעומת CAF1-exp 42 יום בן ושליטה-2 תאים פיברובלסטים (איור . 2C, ד) ^11. נתונים אלו מעידים כי fibr תושב החלב האנושיoblasts בהדרגה להתפתח myofibroblasts CAF בתוך xenografts הגידול.

איור 1 Schematic ייצוג של בידוד של fibroblasts החלב האנושי. א) הרקמה מאמופלסטית הפחתת היה טחון באמצעות סכיני גילוח סטרילי (P1.2) ומועברים לתוך צינור מ"ל 15 חרוטי (P1.3). שברי הרקמה קטנות שעובדו התא דיסוציאציה חיץ (P1.4) והתכוננו תרבות במבחנה (P1.5-7). כדי להנציח fibroblasts מבודד העיקרי החלב אדם, pMIG וקטור retroviral (MSCV-IRES-GFP), המבטא הן hTERT ו-GFP, הוצג, ואת ה-GFP חיוביים וכתוצאה מכך התאים מוינו באמצעות cytometry זרימה (P2.1). וקטור retroviral pBabe-פורו קידוד גן התנגדות puromycin הוצג מכן לתוך תאים אלה. לאחר הטיפול puromycin, GFP שכותרתו (GFP ⁺⁾ puromycin עמידים (פורו ^R), immortaliאדם sed fibroblasts החלב היו מבודדים (P2.2).

BA) כדי ליצור exp-CAFs, GFP ^{+ R} פורו הנציח fibroblasts החלב האנושי היו coinjected עם MCF-7-ras בתאי סרטן שד מתחת לעור לתוך העכבר בעירום immunodeficient (P3a). Xenograft הגידול היה resected ב 42 ימים לאחר ההשתלה (P4a) ו ניתק לתוך ההשעיה בודד בתא (P5). תאים אלה בתרבית ואז בנוכחות puromycin במבחנה כדי לסלק את כל התאים קרצינומה זיהום ותאי עכבר סטרומה (P6). כתוצאה puromycin עמידים התאים היו כינה שנוצר בניסוי CAF1 (exp-CAF1) תאים. תאים אלה, resected 42 ימים לאחר ההשתלה, היו מעורבים שוב עם MCF-7-ras התאים המושתלים מתחת לעור כמו קודם (P7a) לעכבר מחשב מארח. הגידול וכתוצאה מכך הותר לגדול לתקופות נוספות של 200 ימים, ניתח אחר כך, ניתק, ותרבותיים בנוכחות puromycin. מבודדpuromycin עמידים התאים היו כינה exp-CAF2 תאים (242, בן יומו).

Bb) כדי לבודד תאים מלאה נגד exp-CAFs, GFP ^{+ R} פורו הנציח fibroblasts החלב אדם הוזרקו תת עורית ללא MCF-7-ras תאים (P3b) לעכבר בעירום כמו תרבויות טהור. הרקמה fibroblastic, ניתח 42 ימים לאחר ההשתלה (P4b), היה ניתק לתוך תא בודד השעיות (P5) ו puromycin עמידים לתאים, בשם השליטה פיברובלסטים-1 תאים, היו מבודדים כפי שתואר קודם לכן (P6). Fibroblasts אלה היו שוב מושתל מתחת לעור ללא MCF-7-ras התאים בנוסף ל 200 ימים (P7b) לעכבר בעירום. הרקמה fibroblastic היה גזור, ניתק, ותרבותיים בנוכחות puromycin. מבודד puromycin עמיד תאים פיברובלסטים היו כינה-2 בקרה תאים (242 יום בן).

איור 2 Exp-CAFs ואת fibroblasts מלאה מקורם fibroblasts ההורים החלב האנושי. (א) מנתח immunofluorescence שליטה פיברובלסטים-2 (בקרת ו) ו-exp CAF2 תאים. שני סוגי תאים כתם חיובית עבור סמנים mesenchymal (אדום), כולל האדם vimentin, prolyl-4-hydroxylase, קולגן 1A, פיברונקטין, S100A4, משטח חלבון פיברובלסטים. (ב) לעומת זאת, הפאן cytokeratin, סמן בתאי אפיתל , לא מזוהה ב-exp CAF2 תאים להביע GFP (ירוק). גרעין התא מגואלות 4'-6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) (כחול). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר (המכונה מ קוג'ימה et al. ¹¹⁾

(ג) immunofluorescence של exp-CAF2 תאים פיברובלסטים-2 בקרה תאים (שליטה ו) באמצעות נוגדנים כנגד α-SMA (אדום) או tenascin-C (TN-C) (אדום). גרעין התא מגואלות DAPI (כחול). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. (ד) 48% exp-CAF2 תאים כתם חיובית SMA-α, ואילו 14% של 42 יום בן exp-CAF1 ו -2.5% של פיברובלסטים-2 אוכלוסיות תאים לשלוט הן חיוביות עבור SMA-α. (המכונה מ קוג'ימה et al.11)

Discussion

חוסר CAF הסמנים הספציפיים ורמת ההטרוגניות נצפתה בקרב CAFs להפוך את אפיון מסוג זה תא אתגר בפני עצמו. CAFs לימוד במבחנה יש גם התעכבה בשל סיבוך נוסף כי תאים אלו מזדקנים להפסיק מתרבים כאשר בתרבית במשך תקופה ארוכה. הניסיון הקודם שלנו ישירות להנציח CAFs ראשוני באמצעות לבנות re...

Materials

חומר שם	סוג	חברה	מספר קטלוגי	הערה
DMEM		Invitrogen	61965-026
עגל עוברית בסרום		GIBCO	10270
פניצילין, סטרפטומיצין		Invitrogen	15140-122
Collagenase סוג אני		סיגמא	C0130-1G
hyaluronidase		סיגמא	H4272
Vimentin (V9) נוגדן		Novocastra מעבדות	NCL-L- VIM-V9
Tenascin C (BC-8) נוגדן				מתנה ד"ר לוצ'יאנו Zardi
α-SMA-Cy3 (1A4) נוגדן		סיגמא	C6198
Prolyl-4-hydroxylase		Dako	M0877
(5B5) נוגדן
קולגן Type1 נוגדן 1A		סיגמא	HPA011795
פאן cytokeratin נוגדן		סיגמא	C5992
פיברונקטין נוגדן		BD Biosciences	610077
S100A4/FSP-1 (פיברובלסטים, חלבון ספציפי-1) נוגדן		Dako	A5114
משטח פיברובלסטים חלבון (שיבוט 1B10) נוגדן		Abcam	ab11333
MSCV-IRES-GFP לבנות				בקשה מחברי
pBabe-פורו לבנות				לרכוש מ Addgene
Puromycin		סיגמא	P8833
DAPI		סיגמא	D9564
15 מ"ל צינור חרוטי		קורנינג	430766
עירום עכבר		Taconic	NCRNU-F	נקבה NCR בעירום
C3H/10T1/2 תאים		ATCC		CCL-226