인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

요약

암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs) 종양의 기질 내에 존재 myofibroblasts 풍부한은 종양의 진행을 운전에 중요한 역할을한다. 우리는 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary CAFs 창출을위한 coimplantation 종양의 xengraft 모델을 개발했습니다. 프로토콜 tumourigenesis을 추진하는 능력을 습득 카페인 myofibroblasts을 수립하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Carcinomas는 종양 세포의 '기질'이라고 비 암 구획 구성되어 복잡한 조직입니다. 기질은 세포외 기질 (ECM) 및 섬유아 세포, myofibroblasts, 내피 세포, pericytes과 ^1-3 leukocytes을 포함 mesenchymal 세포의 다양한 구성되어 있습니다.

종양 - 관련 기질은 인근 암종 세포에 의해 발표 상당한 paracrine 신호에 반응합니다. 질병 과정 동안 기질은 종종 myofibroblasts 다수 포함하는 암종 - 관련 섬유아 세포 (CAFs)에 의해 인구가됩니다. 이러한 세포는 이전에 자신의 체외 문화에 대한 인간의 carcinomas 다양한 종류의에서 추출되었습니다. CAFs의 subpopulation는 α - 부드러운 근육 굴지 자신의 최대 규제 (α - SMA) 표현 ^4,5 통해 구별할 수 있습니다. 이러한 세포들은 myofibroblasts C와 유사한 특성을 공유하는 '활성화 섬유아 세포'의 특징 아르ommonly 부상하고 fibrotic 조직 ⁶ 보여집니다. 이 myofibroblastic CAF 집합의 존재는 매우 고급 malignancies 관련하여 환자의 가난한 prognoses와 관련된 것입니다.

우리 자신을 포함한 많은 실험실, CAFs, immunodeficient 마우스로 암종 세포로 주입, 크게 tumourigenesis ^70-10을 추진 능력이있다 것으로 나타났습니다. 암종 환자에서 준비 CAFs 그러나, 자주 지속적인 실험을 통해 자신의 이용을 제한 extensiveness 문화에 전파하는 동안 노화를 받고있다. 이러한 어려움을 극복하기 위해, 우리는 coimplantation의 유방 종양의 이종 이식 모델을 사용하여 실험적으로 인간의 섬유아 세포에서 mammary 불후의 인간 mammary CAF 셀 라인 (EXP - CAFs) 생성 소설 기법을 개발했습니다.

감소 mammoplasty 조직에서 얻은 EXP - CAFs, 부모 mammary 인간 섬유아 세포를 생성하기 위해서는 먼저 immortali되었습니다hTERT, telomerase의 holoenzyme의 촉매 subunit와 표현 GFP 및 puromycin 저항 유전자에 설계와 함께 SED. 이러한 세포는 이종 이식 마우스에 활성 RAS의 oncogene (MCF - 7 - RAS 세포)를 표현 MCF - 7 인간 유방암 세포 암종과 coimplanted되었습니다. 생체내의 배양 기간 후, 처음 주입 인간 mammary 섬유아 세포들은 puromycin 저항 ^11에 기초하여 종양의 xenografts에서 추출한되었습니다.

우리는 myofibroblastic 표현형을 채택, 상주 인간 mammary 섬유아 세포가 차별화된 것을 관찰하고 종양의 진행 과정 동안 종양 - 홍보 속성을 인수했다. 중요한 것은,이 세포는 EXP - CAFs로 정의, 가깝게 환자에서 해부하는 유방 carcinomas으로부터 격리 CAFs의 종양 - 홍보 myofibroblastic 표현형을 모방. 우리 종양 이종 이식 - 파생 EXP - CAFs 따라서 인간 부러 뜨려에 CAFs의 생물학을 공부하는 효과적인 모델을 제공합니다t의 carcinomas. 설명 프로토콜은 또한 인간의 carcinomas의 다른 유형에서 파생된 다양한 카페의 인구를 생성 및 특성화 연장 수 있습니다.

프로토콜

1. 기본 교양 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포의 분리

기본 교양 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포를 분리를위한 실험 절차는 그림에 설명되어 있습니다. 1A.

1. 10% 소태아 혈청 (FCS), 페니실린 - 스트렙토 마이신 (200 단위 / ML), collagenase 유형 I (1 MG / ML)와 hyaluronidase (와 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM)로 이전 ¹² 설명되어있는 세포 분리 버퍼를 준비 125 단위 / ML).
2. 감소 mammoplasty (~ 0.5 g) 인산에 몇 시간은 식염수 (PBS)를 버퍼에서 해부하는 유방 조직을 씻으십시오. 멸균 면도날을 사용하여 작은 조각 (<1.5 mm ^3)로 조직을 말하다.
3. 위의 세포 분리 버퍼 (조직 0.5 g 당 10 ML)와 최대 속도에서 1 분 와동의 적절한 금액을 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 조직 조각을 전송합니다.
4. 세포 분리 버퍼 F의 조직 조각을 다이제스트또는 12-18 37 H ° C 느린 동요와 함께. 아직도 튜브에 남아 소화되지 않은 조직 조각의 여러 가지가있을 것입니다 ^* 참고.
5. 교반하지 않고 상온에서 5 분 튜브를 품어. 5 ML serological pipet을 사용하여 새 원뿔 튜브로 인한 stromal 세포 강화 뜨는을 전송합니다.
6. 250 X g에서 5 분 stromal 분수를 원심하여 PBS로 세포 펠렛을 resuspend. 250 X g에서 5 분 다시 원심 분리기와 10 % FCS와 보충 DMEM으로 세포 펠렛을 resuspend. 문화 DMEM, 37 ° C와 5 % 이산화탄소에서 15cm 페트리 접시에서 10 % FCS를 포함에있는 세포.
7. 합류 때까지 전지를 전파. 그것은 일반적으로 8~10일 소요됩니다. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체 (10 % 디메틸 sulfoxide와 DMEM에 최고 20 % FCS)를 사용. 원래 주식으로 5 냉동 튜브를 준비합니다. 한 병을 녹여 및 섬유아 세포를 포함하는 보조 주식 5 튜브를 준비하는 세포를 확장 5 인구 이내 passaged후속 실험에 대한 doublings (대조해). 이러한 절차는 확장된 조직 문화 중 발생할 수 clonal 선택 및 문화 스트레스를 최소화합니다. P1.1 - 7은 또한 유방 절제술 ¹² 얻은 유방 carcinomas에서 CAFs를 격리에 사용될 수 ^* 있습니다.

2. GFP - 라벨, puromycin 모성, 불후의 인간 섬유아 세포의 정상적인 mammary 생성

1. P1.7에 격리된 기본 인간의 정상적인 mammary 섬유아 세포)를 immortalise하려면 hTERT와 GFP를 모두 표현하는 retroviral pMIG (MSCV - IRES - GFP) 벡터 ^12, 소개합니다. 다음 문화 4~5일에 대한 세포 및 GFP - 긍정적인 유동세포계측법를 사용하여 세포를 정렬합니다.
2. GFP - 라벨 불후의 섬유아 세포에 puromycin 저항 유전자를 인코딩 구축 retroviral pBabe - puro을 소개합니다. 문화 puromycin의 존재에 5-7일 (최종 농도 1 μg / ML)의 세포가 GFP 양성 (GFP +), puromycin 모성 (puro ^R를 분리 ) 인간 mammary 섬유아 세포를 영원히.
3. 다음,이 섬유아 세포가 GFP 및 puromycin 저항을 인코딩 유전자의 수평 이동으로 이어질 성장할 수 활성화된 바이러스, 2.5x10 ⁵ GFP + puro ^R 2 일간 6cm 배양 접시에있는 인간 mammary 섬유아 세포를 영원히. 생산 여부를 검토
4. 필터 매체는 주사기 필터 (구멍 크기 : 0.45 μm의)를 사용하여 이러한 섬유아 세포에 의해 시설과 바이러스 감염의 효율성을 증가 프로타민 황산 (5 μg / ML)의 면전에서 12h에 대한 10T1 / 2 마우스 fibroblastic 세포에 그것을 추가합니다. 매체는 다음 추가 이일 10 % FCS - DMEM으로 변경됩니다.
5. 형광 현미경으로 세포를 검사합니다. GFP 바이러스에 감염된 10T1 / 2 세포가 GFP 양성하게 될 것입니다. 5~7일에 대한 puromycin (1 μg / ML) 또한 세포를 치료하고 puro ^R 10T1 / 2 세포 puromycin 치료 후 현재와 양식을 식민지하는 경우 번호판을 관찰합니다.
6. 참고 수평 유전자 트란부모 GFP + puro ^R 인간 mammary 섬유아 세포에 의해 만들어진 활성 바이러스 sfer는 종양의 xenografts 내에서 주변 murine 세포 및 / 또는 암종 세포 GFP + puro ^R을 수 있습니다. 이것은 처음 주입 GFP 종양의 xenografts에서 + puro ^R 인간 mammary 섬유아 세포를 분리의 과정을 방해 수 있습니다.

3A. immunodeficient 마우스로 유방 암종 세포와 인간 섬유아 세포의 mammary Coinjection

EXP - CAFs을 생성하기위한 실험 절차가 그림 그림입니다. 1Ba.

1. 믹스 1x10 ⁶ MCF - 7 - RAS 인간의 유방 암종 세포 및 3x10 ⁶ GFP ⁺ puro ^R, P2.2에서 생성된 불후의 인간 mammary 섬유아 세포). 50 % (V / V) 사출 당 Matrigel와 문화 매체 400 μl의 세포를 준비합니다.
2. subcutaneously immunodeficient 누드 마우스에 세포 혼합물을 주사. CAFs는 여러로부터 독립적으로 추출하는 경우종양, 여러 마우스의 좌우 측면에 각 혼합물을 이식.

3B. immunodeficient 마우스로 인간 섬유아 세포의 mammary 분사

1. EXP - CAFs에 대한 제어 섬유아 세포를 생성하려면, 50 % (V / V) Matrigel 당 분사 (그림 1Bb)와 문화 매체 400 μl에 P2.2에서 생성된 3x10 ⁶ GFP ⁺ puro ^R 불후의 인간 mammary 섬유아 세포를 준비합니다. 암종 세포와 섬유아 세포를 혼합하지 마십시오.
2. 누드 마우스의 피하 사이트에 P3b.1에서 준비한 섬유아 세포를 이식.

^* 주사 섬유아 세포는 피부 아래의 조직 fibroblastic 아니라 종양을 형성됩니다.

4A. 종양의 이종 이식의 해부

1. 때 다른 암종 세포 및 / 또는 섬유아 세포가 coimplanted되는 42일 후 주입 (그림 1Ba). ^* 참고 피하 인간의 유방암 이종 이식을 품고 마우스를 Euthanise, 섬유아 세포는 myofibroblastic 표현형를 시작 종양의 이종 이식 시간 초과 42일에 대한 incubated해야 할 수 있습니다.
2. 집게와 가위를 사용 무딘 절개로 마우스의 측면에서 종양의 이종 이식을 수확. PBS에있는 종양 조직을 빠져.

4B. fibroblast의 이종 이식의 해부

1. fibroblast의 이종 이식 42일 후 주입 (그림 1Bb)을 품고 마우스를 Euthanise.
2. 집게와 가위를 사용하여 피하 fibroblast의 이종 이식을 해부하다. PBS로 fibroblastic 조직을 넣으십시오. 작은 투명한 조직으로 표시되는 fibroblast의 이종 이식은, 피부 아래에서 찾을 수 어려울 수도 ^* 있습니다.

5. xenografts에서 기본 교양 세포의 준비

1. 종양 (~ 0.5 g) 또는 fibroblastic 조직 (~ 0.1 g) 해부하다에 대한 살균 biosafety 캐비닛을 사용합니다. 15cm D 문화의 상단에 excised 조직을 전송PBS 1 ML 함께 분에. 멸균 면도날을 사용하는 작은 조직 조각 (<1.5 mm ^3)로 조직을 말하다. * fibroblast의 이종 이식 미만 0.1 그램 무게 경우, 몇 가지 추가 fibroblast의 xenografts를 수집하고 고립에 대한 세포의 수를 늘리기 위해 그들을 함께 혼합합니다.
2. 세포 분리 버퍼 (조직 0.5 g 당 10 ML)와 최대 속도에서 1 분 와동을 포함한 15 ML 원뿔 튜브에 조직 조각을 전송합니다.
3. 37 3 H에 대한 세포 현탁액을 품어 ° C 연속 느린 동요와 함께.

6. 문화에 puromycin 방지 세포의 분리

1. 250 X g에서 5 분 또는 종양 이종 이식에서 fibroblast 중 dissociated 세포 현탁액을 원심 분리기와 PBS의 세포 펠렛을 resuspend. 250 X G.시 5 분 다시 원심 분리기 10% FCS - DMEM의 결과 세포 펠렛을 Resuspend. 37 puromycin의 존재 (1 μg / ML)에서 15cm 배양 접시에있는 문화 세포 ° C그리고 순서대로 5 % 이산화탄소는 오염 암종 세포 및 / 또는 murine stromal 세포를 제거합니다. 합류 (2~4주)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. * 참고 그 결과 puro ^{R 세포,} 지정 42 일 된 EXP - CAF1 (그림 1Ba)하거나 Control fibroblast - 1 세포 (그림 1Bb), 불사신 및 GFP 양성하고 있습니다. 그것은이 세포가 같은 P2.3 - 6에 설명된 10T1 / 2 세포를 사용하여 활성 바이러스를 생산 있는지 확인하는 것이 좋습니다.

7A. 문화의 EXP - CAF2 세포의 분리

더 CAFs의 활성 myofibroblastic 표현형을 높일 수있는, MCF - 7 - RAS 세포와 42 일 된 EXP - CAF1 세포를 섞어 200 일 추가 기간 동안 누드 마우스에 subcutaneously 그들을 다시 주입. 해부하다 및 puromycin (1 μg / ML)의 존재에서 10 % FCS - DMEM과 15cm 배양 접시에있는 단일 세포 현탁액 문화 세포에 종양의 이종 이식을 떼어 놓다, 같은 P6에 표시된0.1. 합류 (80~10일)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. 그 결과 puro ^{R 전지는} 242 일 된 EXP - CAF2 전지 (그림 1Ba)라는 이름입니다.

7B. 문화의 제어 fibroblast - 2 세포의 추출

EXP - CAF2 세포에 대한 제어 섬유아 세포를 생성하려면, 200 일 동안 추가로 누드 마우스에 subcutaneously 암종 세포없이 혼자 42 일 - 오래된 제어 fibroblast - 1 세포를 주입. 해부하다하고 P6.1에 표시된 puromycin (1 μg / ML)의 존재에서 10 % FCS - DMEM과 15cm 배양 접시에있는 단일 세포 현탁액과 문화 세포에 fibroblastic 조직을 떼어 놓다. 합류 (3-4 주)까지 세포를 전파. -80에서 세포를 저장 ° C 냉동 매체를 사용합니다. 그 결과 puro ^{R 전지는} 제어 fibroblast - 2 세포 (그림 1Bb)라는 이름입니다.

8. 대표 결과 :

제어 fibroblast - 2 및 EXP - CAF2 cel유방 종양의 xenografts에서 추출한되었습니다 있나요은, 인간의 의미, 인간의 특정 vimentin, prolyl - 4 - hydroxylase, 콜라겐 1A, fibronectin, S100A4와 fibroblast 표면 단백질 (그림 2A) ^11를 포함하여 mesenchymal 마커에 대해 강력하게 긍정적인 스테인드 원산지 및 이들 세포 mesenchymal 자연. 반대로, cytokeratin, 상피 세포의 마커는,이 GFP ⁺ 섬유아 세포 (그림 2B)에 스테인드되지 않았습니다. 이러한 연구 결과는 따라서 압축을 푼 EXP - CAF2 및 제어 fibroblast - 2 세포가 처음 마우스 xenografts에 소개 부모의 인간 mammary 섬유아 세포에서 유래했다고하는 것이 좋습니다.

중요한 것은, EXP - CAF2 세포의 높은 비율은 α - SMA 42 일 된 EXP - CAF1 및 제어 fibroblast - 2 세포 (그림에 비해 myofibroblasts의 표시 둘 중 세포외 기질 당단백질 tenascin - C ^5에 대한 긍정적인 스테인드 . 2C, D) ^11. 이러한 데이터는 해당 거주 인간 mammary fibr를 나타냅니다oblasts는 점진적으로 종양의 xenografts 내에서 카페인 myofibroblasts로 진화.

인간 섬유아 세포의 mammary 고립의 그림 1 도식 표현. A) 감소 mammoplasty 조직은 무균 면도날 (P1.2)을 사용하여 다진과 15 ML 원뿔 튜브 (P1.3)에 양도되었습니다. 작은 조직 조각은 세포 분리 버퍼 (P1.4)에 소화와 체외 (P1.5 - 7)의 문화에 대한 준비가되었습니다. , 격리 기본 인간의 mammary 섬유아 세포, hTERT와 GFP를 모두 표현하는 retroviral pMIG (MSCV - IRES - GFP) 벡터를 immortalise하기 위해 도입되었고, 그 결과 GFP 양성 세포는 유동세포계측법 (P2.1)을 사용하여 정렬되었습니다. puromycin 저항 유전자를 인코딩 retroviral pBabe - puro 벡터는 다음이 세포에 도입되었다. puromycin 처리시, GFP - 라벨 (GFP ⁺⁾ puromycin 모성 (Puro ^R), immortaliSED 인간 mammary 섬유아 세포는 (P2.2) 고립되었다.

바)을 생성하려면 EXP를 CAFs, GFP ⁺ puro ^R은 불후의 인간 mammary 섬유아 세포는 subcutaneously immunodeficient 누드 마우스 (P3a)에 MCF - 7 - RAS 유방 암종 세포와 coinjected되었습니다. 종양의 이종 이식은 이식 후 42일 (P4a)에 resected와 단일 세포 현탁액 (P5)에 dissociated되었습니다. 이러한 전지는 다음 어떤 오염 암종 세포와 마우스 stromal 세포 (P6) 제거하는 puromycin의 면전에서 체외에서 배양해되었습니다. 그 결과 puromycin 모성 전지는 실험적으로 생성 CAF1 (EXP - CAF1) 세포를 칭했다되었습니다. 42일 포스트 주입 resected 이러한 세포, MCF - 7 - RAS 세포와 다시 혼합되었고 (P7a) 이전과 호스트 마우스에 이식한 subcutaneously. 그 결과 종양은 다음 해부 dissociated 및 puromycin의 면전에서 교양 200 일간의 추가 기간 동안 성장을 허용했다. 격리puromycin 모성 전지는 EXP - CAF2 세포를 (242 일 된) 칭했다되었습니다.

EXP - CAFs에 대한 제어 세포를 분리하기 위해 BB), GFP ⁺ puro ^R 인간 mammary 섬유아 세포가 MCF - 7 - RAS 전지 (P3b)없이 순수한 문화로 누드 마우스에 주입했다 subcutaneously 불후. 해부 fibroblastic 조직은 42일 후 주입 (P4b)는, 제어 fibroblast - 1 세포라는 단일 셀 정지 (P5)과 puromycin 방지 세포로 dissociated되었습니다 앞에서 설명한대로 (P6) 고립되었다. 이 섬유아 세포는 다시 한번 이백일 (P7b)에 대한 추가 MCF - 7 - RAS 세포가없는 누드 마우스에 이식한 subcutaneously했다. fibroblastic 조직은 dissociated, 해부 및 puromycin의 면전에서 교양되었습니다. 격리된 puromycin 모성 전지는 제어 fibroblast - 2 세포를 (242 일 된) 칭했다되었습니다.

그림 2 특급 - CAFs 및 제어 섬유아 세포 부모의 인간 mammary 섬유아 세포에서 발생한. (A) 제어 fibroblast - 2 (제어 F.) 및 EXP - CAF2 세포 Immunofluorescence 분석합니다. 셀 유형 모두 prolyl - 4 - hydroxylase 인간 vimentin, 콜라겐 1A, fibronectin, S100A4와 fibroblast 표면 단백질을 포함 mesenchymal 표시 (적색)에 대한 긍정적인 얼룩. (B) 대조적으로, 범 - cytokeratin, 상피 세포의 마커 , GFP (녹색)를 표현 EXP - CAF2 세포에서 발견되지 않습니다. 세포 핵은 4' - 6 - Diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) (파란색)와 스테인드 있습니다. 스케일 바, 50 μm의 (코지마 외로부터 추천받은 ^11.)

α - SMA (적색) 또는 tenascin - C (TN - C) (적색)에 대한 항체를 사용하여 EXP - CAF2 전지 및 제어 fibroblast - 2 세포 (제어 F.)의 (C) Immunofluorescence. 세포 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드 있습니다. 스케일 바, 50 μm의. EXP - CAF2 세포 (D) 48 % 1 반면, α - SMA에 대한 긍정적인 얼룩42 일 된 EXP - CAF1 4 %와 컨트롤 fibroblast - 2 세포 인구의 2.5 %는 α - SMA 양성하고 있습니다. (코지마 동부 표준시 al.11의 추천)

토론

CAFs이 셀 유형 자체가 도전의 특성을 렌더링 사이 CAF 특정 마커와 이질 수준의 부족 관찰했다. 체외에서 공부 CAFs 또한 이러한 세포가 senesce하고 오랜 기간 동안 교양 때 proliferating 중지되는 추가 합병증에 의해 방해되었다. 직접 retroviral hTERT cDNA 구조를 사용하여 기본 CAFs을 immortalise에 대한 우리의 이전의 시도가 실패했습니다. 따라서 더 이상 이러한 세포의 특성을 홍보하는 종양을 조사하...

자료

재료 이름	유형	회사	카탈로그 번호	논평
DMEM		Invitrogen	61965-026
태아 송아지 혈청		GIBCO	10,270
페니실린 - 스트렙토 마이신		Invitrogen	15140-122
Collagenase 유형 I		시그마	C0130 - 1G
hyaluronidase		시그마	H4272
Vimentin (V9) 항체		Novocastra 연구소	NCL - L - VIM - V9
Tenascin C (BC - 8) 항체				의 선물 박사 루치아노 Zardi
α - SMA - Cy3 (1A4) 항체		시그마	C6198
Prolyl - 4 - hydroxylase		Dako	M0877
(5B5) 항체
콜라겐 type1 1A 항체		시그마	HPA011795
팬 - cytokeratin 항체		시그마	C5992
Fibronectin 항체		BD Biosciences	610,077
S100A4/FSP-1 (fibroblast - 특정 단백질 - 1) 항체		Dako	A5114
Fibroblast 표면 단백질 (클론 1B10) 항체		Abcam	ab11333
MSCV - IRES - GFP 구축				작성자 요청
pBabe - puro 구축				구매 Addgene에서
Puromycin		시그마	P8833
DAPI		시그마	D9564
15 ML 원뿔 튜브		코닝	430,766
누드 마우스		Taconic	NCRNU - F	여성 NCR 누드
C3H/10T1/2 세포		ATCC		CCL - 226