כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

Summary

אנו מתארים באמצעות פרוטוקול ג elegans וספריות RNAi האכלה המאפשר מדידה אוטומטית של מספר פרמטרים כגון גודל, הקרינה ואת האטימות של תולעים בודדים באוכלוסייה. אנחנו נותנים דוגמה אחת של המסך כדי לזהות גנים המעורבים חסינות אנטי פטרייתי מולדת ב ג elegans.

Abstract

התערבות RNA היא שיטה רבת עוצמה כדי להבין תפקוד הגן, במיוחד כאשר נערך בקנה מידה כל הגנום, ובהקשר כמותית. ב C. elegans, תפקוד הגן ניתן הפילו בפשטות וביעילות על ידי האכלה עם תולעים חיידקים המבטאים dsRNA המתאים גן ספציפי ^1. תוך יצירת ספריות של שיבוטים RNAi מכסה את רוב ג elegans הגנום ^2,3 פתחה את הדרך האמיתיים מחקרים גנומית פונקציונלית (ראה למשל ^4-7), רוב השיטות מבוססות הן מייגע. מוי ועמיתיו פיתחו חצי אוטומטיות פרוטוקולים המאפשרים הגנום כולו מסכים ^8. הגישה מתבססת על הדמיה מיקרוסקופית וניתוח התמונה.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול חלופי המסך הגנום כולו תפוקה גבוהה, המבוססת על טיפול הרובוטית של חיידקי RNAi שיבוטים, ניתוח כמותי באמצעות Biosort COPAS (האיחוד Biometrica (UBI)), ותוכנה משולבת: MBioLIMS (ניהול מעבדה מערכת מידע מ Modul-Bio) טכנולוגיה המספקת תפוקה מוגברת על ניהול נתונים ומעקב אחר המדגם. השיטה מאפשרת מסכי להתנהל על צלחות בינוניים מוצקים. הדבר חשוב במיוחד עבור כמה מחקרים, כגון אלו בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות פונה ב C. elegans, מאז חיידקים מסוימים לא יעיל להדביק תולעים בתרבות נוזל.

אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בשיטה כדי לכמת את החשיבות של גנים חסינות אנטי פטרייתי מולד ב C. elegans. במקרה זה, הגישה מתבססת על שימוש זן מהונדס נושאת גן אפידרמיס זיהום מושרה כתב ניאון, עם GFP בשליטת היזם של מיקרוביאלית פפטיד גן NLP 29 ו לכתב ניאון אדום בא לידי ביטוי ב constitutively האפידרמיס. זה האחרון מספק בקרה פנימית על שלמות תפקודית של האפידרמיסו transgene ספציפי להשתיק ^9. כאשר התולעים בקרה נגועים על ידי הפטרייה הם לזרוח בירוק. דריסה על ידי RNAi גן נדרש-NLP 29 תוצאות הביטוי של הקרינה פחתה לאחר ההדבקה. נכון לעכשיו, פרוטוקול זה מאפשר יותר מ -3,000 שיבוטים RNAi להיבדק וניתח בשבוע, לפתוח את האפשרות של הקרנת הגנום כולו בתוך פחות מ 2 חודשים.

Protocol

פרוטוקול כמתואר להלן מחולק צעדים על חמישה ימים רצופים (איור 1). כאמור, צעדים מסוימים ניתן לעשות זאת בימים שונים. משך הזמן של כל שלב, וכן את כמות החומר הנדרש (למשל תולעים, חיידקים, מדיה) יהיה תלוי במספר 96 צלחות גם טיפול בכל ניסוי.

יום 1

1. הכנה של 96-NGM גם צלחות RNAi

פרוטוקול הבאה מותאמת השיטה הרגילה ליצירת תרבות צלחות תולעת ^10, הכולל פרטים על שיטות עיקור של הפתרונות השונים.

1. במשך 10-12 צלחות 96 טוב, להכין 100 מ"ל של מדיה צמיחה נמטודות (NGM) ב deionized H ₂ O: 1.7 גרם BactoAgar, 0.29 גרם NaCl, 0.25 גרם Peptone, 100 כולסטרול μL (5 מ"ג / מ"ל ב EtOH).
2. החיטוי NGM (5 דק 'ב 121 מעלות צלזיוס במשך 100 מ"ל, 30 דקות ב 121 מעלות ל 4) ומקררים עד שהוא בסביבות 50 מעלות צלזיוס (Eno מגניב פשוטאיכס להחזיק). חשוב NGM נשאר חם מספיק כדי לא לחזק.
3. הוסף ל 100 מ"ל: 2.5 מ"ל פוספט חיץ pH6 (1 דקה), 100 MgSO μL ₄ (1 דקה), 100 μL CaCl ₂ (1 דקה), 400 IPTG μL (1 דקה), 100 ampicillin μL (100 מ"ג / מ"ל), 100 טטרציקלין μL (12.5 מ"ג / מ"ל ​​ב EtOH).
4. הפץ 75 μL של NGM היטב כל אחד צלחת שטוחה התחתון 96-היטב. כדי למנוע התמצקות של המדיום, הוא צריך להימכר בקצב מהיר, זה נוח להשתמש מתקן חוזרות (למשל Repeatman, Eppendorf). ודא שאין בועות אוויר הנמצאים הבארות.
5. אחסנו את הצלחות באופן מיידי בתא לח (למשל קופסת טאפרוור עם מגבות נייר רטובות בתחתית) בשעה 4 ° C.

הערה: הצלחות ניתן להכין עד שבוע מראש ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה יכול להפוך את הארגון של השלבים הבאים קל יותר.

2. הכנה אוטומטית של הצלחות 96-DeepWell ליברות

הכן ולהפיץ 1.5 LB מ"ל המכיל ampicillin 100μg/mL ו טטרציקלין 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​היטב כל צלחת 96-DeepWell אשר בעל קיבולת מקסימלית של 2 מ"ל / כן. התפלגות מותאמת באמצעות מערכת רובוטית טיפול הנוזל (למשל נץקאן) אך ניתן גם לבצע באופן ידני אם צריך.
1. הוספת כיסוי לצלחת כל החנות ב 4 ° C. על מנת לעקוב אחר כל צלחת 96-ובכן, תווית ברקוד ייחודי או יש להוסיף, בשלב זה או לאחר מכן.

הערה: אפשר להכין לוחות 2 עד 3 ימים מראש ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה יכול להפוך את הארגון של השלבים הבאים קל יותר.

3. לגדל את החיידקים המשובטים RNAi הצלחות 96-DeepWell ליברות (תרבות בין לילה)

1. על מנת להקל בדיעבד של הטיפול, כאשר המקוריים RNAi שיבוטים הספרייה הם בפורמט 384 היטב, להפיץ מחדש 1 את שיבוטים אל שכותרתו או בר מקודד תקן 96-גם צלחות המכילות LB עם מגבר מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​Tet השלימו עם גליצרול (הריכוז הסופי 10%). כאשר לוחיות 384 גם המקוריים לא צריך שיבוטים של כל בארות, כמו במקרה של ספריית הנפוץ ביותר "Ahringer", ישנן מספר אפשרויות לארגן את הצלחות ובת. שיבוטים ניתן להפיץ מחדש, כך שאין בארות ריקים צלחות ובת. הדבר מצמצם את מספר צלחות על המסך. באופן אידיאלי, עם זאת, במהלך שכפול, בארות כמה על כל צלחת הבת יש להשאיר ריק, כך אלה יכולים לאחר מכן להיות מלא שיבוטים שליטה סטנדרטיים (חיוביות ושליליות) המקלים על צלחת, השוואות. 96-אלה גם צלחות הבת משמשים לזרע 96-DeepWell צלחות ליברות לתרבות (ב) בן לילה.

כל הצעדים טיפול הנוזל נעשים בצורה הטובה ביותר עם מערכת טיפול רובוטית נוזלי (למשל טקאן), אבל ניתן לבצע באופן ידני באמצעות, למשל, משכפל 96 פינים. אם הספריה שיבוטים RNAi כבר בפורמט 96-גם עבור לשלב 3.5.

דגירה של 96-RNAi גם צלחות הבת על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (200 סל"ד) במשך 14-15 שעות.

ודא כי החיידק גדל בצורה נכונה לזהות שיבוטים כי לא גדל. אלה ייכללו ניתוח מאוחר יותר. באופן אידיאלי, OD ₆₀₀ נמדדת גם זה, אבל זה יכול להיעשות על ידי בדיקה פשוטה.

אחסן את 96-RNAi גם צלחות הבת ב -80 ° C לפני השימוש.

להפשיר את הצלחות 96-המכילים גם שיבוטים RNAi בטמפרטורת החדר. הצלחות אז יכול להיות כל הזמן ב 4 ° C עד השימוש.

הפץ 3 μL של שיבוט כל חיידקי מהצלחת 96-גם לשכפל את 96 בארות של צלחת 96-DeepWell שכותרתו בהתאם / המינימרקטים LB המכיל 1.5 מ"ל של LB עם מגבר מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 100 12.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​ט. שיבוטים חיידקים כדי לשלוט ביעילות RNAi, כגון שיבוט GFP (RNAi) בדוגמה הנוכחית, בקרות שליליות, ניתן לשלב גם באופן ידני בכל ריק זמין.

כיסוי 96-DeepWell עמ 'lates עם סרט דבק (למשל הסרט AeraSeal התרבות התאית מ Dutscher). להחליף את צלחת 96-לשכפל גם בשימוש ב -80 ° C.

את 96-DeepWell צלחות שכותרתו מודגרת ואילך על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה (200 סל"ד במשך 14-15 שעות).

יום 2

4. זרע את שיבוטים RNAi חיידקים על גבי 96-NGM גם צלחות RNAi

צעד זה צריך להיעשות בבוקר לאחר התרבות ON.

1. קח את הצלחות 96-NGM היטב 4 ° C ולתת להם להתחמם להתייבש במשך 5-15 דקות מתחת לארון למינרית סטרילית לזרום. אל תשאיר את הצלחות זמן רב מדי מתחת למכסה המנוע (מקסימום 30 דקות), כי אחרת NGM יכול לאחר מכן לפצח. הוסף תווית ברקוד מתאים / אל כל צלחת.
2. אחזר 96-DeepWell על צלחות תרבית של 37 ° C. הקלט את עמדותיהם של כל בארות ריק (גם ריק הוא שקוף לחלוטין); אלה ייכללו ניתוחים שלאחר מכן.
3. בצנטריפוגה 96-DeepWell צלחות 5 דקות בסל"ד 4000.
4. עצה את supernatant על ידי סיבוב צלחת חד הפוך להתייבש בשולי הצלחת במהירות על מגבת נייר. כמו תרבויות הם של חיידקים רקומביננטי, supernatant צריך להיות מטופל על פי התקנות המקומיות (למשל autoclaved).
5. Resuspend גלולה החיידק בנוזל שיורי (כ 50 μL) על ידי vortexing, באופן אידיאלי באמצעות תועמלן ייעודי (למשל טקאן), כך כל צלחת מקבל בדיוק את אותו הטיפול. ניתן למדוד את OD ₆₀₀ של כל אחד גם לתקנן דווקא הבידוד חיידקי לשלב הבא, אבל זה לא הכרחי, ואנחנו לא לבצע בדיקה כזו.
6. העברת 5 μL של חיידקים resuspended על גבי 96-NGM גם הצלחות באמצעות 8 או 12 ערוצים רב פיפטה. היזהר שלא לגעת או לחדור NGM. שלב זה מתבצע באופן ידני, אך יכול להיות מותאם באמצעות רובוט כגון Liquidator96 (Rainin) המאפשרחלוקת 96 RNAi שיבוטים בצעד אחד.
7. בואו החיידקים יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית, לבדוק באופן קבוע, כדי למנוע NGM להיות יבש מדי. צעד זה אמור לקחת בערך 2 שעות.
8. דגירה של 96-RNAi-NGM גם צלחות ב 37 ° C על בתא לח.

5. הכן את האוכלוסייה מסונכרן של תולעים

לצעד זה, אנו משתמשים תולעים הטרנסגניים שנשאו את הגן הכתב (ים) של עניין (למשל, זיהום מושרה עמ 'NLP-29 :: GFP לבנות, כמו שליטה פנימי, עמ' המכונן col-12 :: transgene dsRed לבנות) . בגלל הירידה הנצפית הביטוי transgene עם הזמן, אנו להפשיר קבוצות חדשות של תולעים כל 6 שבועות. אנחנו תרבות תולעים לפחות 2 דורות לפני השימוש, ולוודא כי התולעים לא גוועים ברעב לפני assay. אם היום 2 לפרוטוקול הוא יום שלישי, אנו מכינים תולעים ביום שישי על ידי הצבת 30 תולעים בוגרות צעירות על צלחת 9 ס"מ NGM להפיץ OP50 עם חיידקיםב 20 מעלות צלזיוס, הם יהיו מוכנים אקונומיקה ביום שלישי (ראה לוח 1).

1. אקונומיקה תולעים בעקבות פרוטוקול סטנדרטי ^10.
2. בואו הביצים בוקעות ב M9 של 25 מעלות צלזיוס עם תסיסה לקבל האוכלוסייה מסונכרן של הזחלים L1.

יום 3

6. להפיץ את התולעים על 96-RNAi-NGM גם צלחות עבור האכלה RNAi

צעד זה צריך להיעשות בבוקר. תולעים L1 בשלב מסונכרנים מופצים על שיבוט כל 96-גם חיידקי על האכלה RNAi.

1. לאחזר את 96-RNAi-NGM גם צלחות מ 37 ° C ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר להתקרר.
2. לאחזר את התולעים מולבן מ 25 ° C. להעריך את מספר התולעים לכל μL 2 ולהתאים עם M9 להיות סביב 100-120 תולעים לכל μL 2 (בערך טיפה אחת).
3. להפיץ באופן ידני 2 μL של L1 בשלב תולעים בכל אחד גם באמצעות מתקן חוזר על עצמו. בדוק כל טוב תולעים (אתה צריך לראות תולעים שחייה בנוזל).
4. בואו הצלחות יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית (1 שעה לכל היותר). בדוק את הצלחות באופן קבוע, התולעים צריך לזחול ולא שחייה. תיזהר, NGM אסור לייבש יותר מדי, אחרת זה יהיה לפצח.
5. מניחים את הצלחות של 25 מעלות צלזיוס בתא לח.

7. לבדוק את coniospora נבגים Drechmeria לזיהום יעיל

שלב זה הוא ספציפי עבור המסך הנוכחי. הוא מורכב בבדיקת קבוצות שונות של נבגים לבחור אלה זיהומיות ברמה גבוהה. לכן זה צריך להיעשות קרוב ככל האפשר לפני 4 יום, יום של זיהום. יש צורך להכין מספיק L3-L4 תולעים מראש על בדיקות אלה (טבלה 1). השיטות מפורטים הדרושים ד תרבות coniospora תוארו במקומות אחרים ^11.

1. לאסוף נבגים ממדגם של כל תרבות פטרייתי בנפח קטן של M9.
2. מניחים ירידה של השעיית כל נבג על צלחת NGM 35 מ"מ עם זרע OP50, ולתת לו להתייבש.
3. הוסף 30-40 L3-L4 תולעים נושאת את הגן הכתב עניין (למשל עמ 'NLP-29 :: GFP).
4. מניחים את הצלחות נגועים במהירות של 25 ° C על.
5. למחרת, לבדוק את התולעים לזירוז GFP ובחר קבוצה של פטריות אשר מעניקה הבהיר, אינדוקציה הרחבה הומוגנית רוב הקרינה ירוק.

יום 4

8. להדביק החשוף RNAi בתולעים עם ד ' coniospora נבגים

שלב זה מתבצע 30 שעות לאחר האכילה, כאשר RNAi תולעים הגיעו לשלב L3-L4.

1. לקבוע את עוצמת הקול של נבגים להשתמש לחלק 4 μL בכל טוב.
2. איסוף ד רעננה coniospora נבגים מתוך האצווה הנבחרת עם חיץ M9. השתמש 8-10 מ"ל של M9 לצלחת 9 1 ס"מ של נבגים.
3. הפצת 4 μL של נבגים היטב כל אחד עם מתקן חוזר על עצמו. בדוק כל טוב נבגים (אתה יכול לראות את השחייה תולעים בנוזל).
4. בואו הצלחות יבש תחת הממשלה הזרימה למינרית סטרילית (~ 1 שעה). בדוק את הצלחות באופן קבוע עד התולעים להתחיל לזחול. תיזהר, NGM אסור לייבש יותר מדי, אחרת זה יהיה לפצח.
5. מניחים את הצלחות נגועים במהירות של 25 מעלות צלזיוס בתא לח.

יום 5

9. תצפית ואחסון של הצלחות לפני ניתוח כמותי אוטומטי

שלב זה מתחיל 18 שעות לאחר ההדבקה והיא מבוצעת במהלך היום 5. תולעים צפויים להיות צעירים מתחילים להטיל ביצים. במהלך שלב זה הפנוטיפ הוא הבקיע חזותית: תולעים משני לזרוח ירוק אשר תואמים את זיהום מצב נורמלי לאחר, או אינדוקציה של ה-GFP משתנה היטב נתון שפירושו כי הגן משתנה מושתקים בתגובה לזיהום.

1. במהירות לבחון את הצלחות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לנתח. אם הצלחות להראות אינדוקציה טוב GFP כללי ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא, אחרת לחכות עד אחר הצהריים לזירוז טוב יותר, כל עוד יש עדיין אוכל נותר התולעים.
2. ראייה להבקיע בכל צלחת ושים לב כל טוב עם פנוטיפ המסומן (למשל, לא ביטוי של GFP). על ידי בדיקת התוצאות שהתקבלו עם כל שיבוטים RNAi השליטה, אשר ייתכן שנוספו, זה ניתוח ראשוני 1 נותן אינדיקציה האם הניסוי הצליח.
3. באמצעות 8 או 12 ערוצים להעברת רב פיפטה את התולעים עם μL של 100% NaCl 50 0.05 מ"מ טריטון, אל החדש שכותרתו בהתאם / המינימרקטים 96-היטב מסביב תחתית הצלחת. להקפיא את צלחות ב -80 ° C עד הניתוח.
4. ביום של הניתוח, להפשיר את הצלחות בטמפרטורת החדר ולהמשיך ניתוח אוטומטי באמצעות Biosort COPAS. סדרן מנתח צלחת אחת ב -22 דקות. צלחות לא צריך להיותעזבו בטמפרטורת החדר למשך יותר משעה לפני הניתוח, והם לא ניתן להקפיא שנית.
5. המידע המתקבל Biosort COPAS מתועתקים לקובץ Excel לצורך אימות שטחית של איכות נתונים. הנתונים הגולמיים עם פרמטרים שונים הנמדדים על ידי Biosort COPAS (צפיפות אופטית (הכחדה), אורך צירית (בזמן הטיסה), פליטת הקרינה, בו זמנית על ידי שלושה גלאים שונים) מאוחסנים מכן בחבילה LIMS ייעודי (MBio LIMS, Modul- ביוגרפיה) עבור הבאים ניתוחים כמותיים מפורטים.

10. נציג תוצאות

באמצעות כמויות של תולעים וחיידקים שניתנו לעיל, בסוף הניסוי, ברוב הבארות, בעלי החיים צריכים פיתחו לבגרות ויש עדיין צריך להיות קצת אוכל להשאיר את כל הבארות. בתנאים אלה, רוב הבארות צריכה להכיל גם ביצים. לא צריך להיות מספר מספיק של מבוגרים בכל טוב, כך Biosort הנתונים מתקבל Fאו לפחות 50 תולעים בודדים. מצד שני, אם RNAi יעיל, מספר רב של שיבוטים RNAi יעורר פנוטיפ גלוי. לדוגמה, תולעים יכול להיות חסר קואורדינציה, או יותר ברור, סטרילית, או נעצרו בהתפתחותם. זה אמור להתרחש בתדירות גבוהה, כך בדרך כלל לפחות אחד טוב לכל צלחת 96-מכיל גם תולעים עם פנוטיפ RNAi מאליו. כאשר הפנוטיפ של עניין הוא הביטוי של גן ה-GFP הכתב, בארות עם שיבוט GFP (RNAi) מכיל פקד איתן (איור 2). פנוטיפים אחרים, כגון שינוי גודל ניתן למדוד בקלות עם Biosort (איור 3 א). הבחנו כי תולעים יכול להגר בארות סמוכות בתדר נמוך מאוד (<1%, BS, תוצאות שלא פורסמו), כאשר את האוכל גם היה נגמר.

להרוס את הפונקציה של סוגים שונים של גנים יכולים להשפיע על ביטוי transgenes ב C. elegans. חלקם לא במיוחד נדרש ביטוי transgenes ^12. אחרים, כגוןכמו רקמות ספציפיות גורמי תעתוק, למשל גורם Gata אפידרמיס ELT-3 ^13, יידרשו בשנת תת מסוימים של תאים. זו אחת הסיבות להכללת שאינם קשורים המכונן אפידרמיס תא transgene כתב לבנות (עמ 'col-12 :: dsRed) ב זן המשמש הפרוטוקול הנוכחי. זה מאפשר גנים כאלה כדי להבחין בין המעורבים במיוחד בתהליך גן הרגולציה תחת מחקר (איור 3 ב & C). Transgene זה בא לידי ביטוי במהלך כל שלבי הזחל. אם assay כרוך ביטוי גנים גילוי עוברי גן אחר כתב השליטה יהיה צורך.

אחד החידושים של פרוטוקול זה הוא השימוש צלחות הקפאת לדחות את הניתוח שלהם. ההקפאה מאפשרת צלחות לאחסן עד שבועיים ללא שינוי משמעותי בתוצאות. אף על פי ערכים מוחלטים של הקרינה נמדדת ניתן לשנות, יחסי היחסי נשאר דומה (איור 4). ב OTידה, RNAi הוא ¹⁴ משתנה באופן מהותי בהליך ניסיוני. כדי להשיג תוצאות חזקות ולחסל את תוצאות חיוביות שגויות רבות אפשריות, מסכי RNAi צריך להיות משוכפל, לפחות פעם אחת. אם הניסויים נערכים בהצלחה, צריך להיות קשר הגיוני בין התוצאות של צלחת 1 נבדק בימים שונים. במיוחד, את הגנים שיש להם השפעה חזקה צריך להיות מזוהה באופן ברור, גם אם השפעה כמותית מדויקת שלהם אינו זהה בין לוחות כפולים (איור 5).

באיור 1. תוכנית כוללת עבור ניסוי טיפוסי.

איור 2. בקרה RNAi באמצעות שיבוט מיקוד ביטוי ה-GFP. מהונדס תולעים expressing constitutively AP col-12 :: כתב dsRed ו NLP מושרה עמ '29 :: כתב ה-GFP על מצע מוצק בצלחת 96-דמיינו גם באמצעות ה-GFP לנתח את מיקרוסקופ עם מערכת פילטר המאפשר תצפית בו זמנית של הקרינה אדום וירוק. תולעים נחשפו לשלוט (לוחות העליונות) או RNAi GFP שיבוט (לוחות למטה) על 48 שעות. לוחות בצד שמאל הם תולעים נגוע, אלה על תולעים הנכונים 18 שעות לאחר ההדבקה עם ד ' coniospora. סרגל קנה המידה הוא 1 מ"מ.

איור 3. ניתוח כמותי של צלחת 96-היטב. Biosort COPAS מייצר נתונים מספריים עבור תולעת ניתוח כל אחד. הגרפים מראים את סטיית תקן ממוצע זמן הטיסה (TOF,) אשר מתאים לגודל של תולעים ^15, אדום פלואורסצנטי (ב ') ויחס (100 x) של פלואורסצנטי ירוק TOF (C) של מהונדס ווRMS להביע constitutively AP col-12 :: כתב dsRed ו NLP מושרה עמ '29 :: כתב GFP שהיו בתרבית על מצע מוצק בצלחת 96-היטב עם אחר RNAi שיבוטים של 48 שעות, 18 שעות לאחר ההדבקה עם ד' coniospora. שיבוטים מסוימים, כגון 1 מסומן בחץ ב (א), מעוררים צמיחה פגמים ו / או להשפיע על הביטוי של P-12 col :: dsRed. אחרים, במיוחד משפיעים על ביטוי של GFP, כמו מודגשת על ידי חץ ב (ג). זה שיבוט בפרט מטרות nsy גן 1, הראו בעבר להיות חשוב בוויסות של NLP 29 ^13. ירוק, אדום פלואורסצנטי ו TOF נמדדים ביחידות שרירותיות, אלא קבוע.

באיור 4. Compאריסון נתונים המתקבלים עם דגימות חי וקפוא מניסוי אחד. צלחות L4 תולעים הנושאים עמ 'NLP-29 :: GFP ו-P-12 col :: transgenes dsRed נדבקו גם עם ד' coniospora או לא. לאחר 18h, כל צלחת חולקה בערך 2: 1/2 נותח מיד קפוא וחצי 24 שעות ב -80 מעלות צלזיוס, לפני הפשרת וניתוח. ערכי הממוצע TOF (בגודל של תולעים), EXT (צפיפות אופטית) וגם ירוק ואדום הקרינה חושבו עבור מדגם זה. הגרף מראה את היחס בין הממוצע של נגוע חלקי שאינם נגועים דגימות, על דגימות קפואות ולחיות (n = 7638 ו 5096, ו 8634 ו 3850 תולעים, בהתאמה).

איור 5. ניתוח השוואתי של 96-גם צלחות כפולים. יחס הקרינה מנורמל (יחס הקרינה הממוצעת (כאן, 100 * ירוק / TOF) עבור כל אחד מחולק היטב על ידיגזוז (25 עד ^ה 75 לאחוזון ^ה) אומר על כל צלחת) עבור כל אחד מן הניתוחים גם כפולות של נציג 96-גם צלחת.

חומר

ניסיוני ציר הזמן

IPTG: ~ 1.4 מ"ל Ampicillin: ~ 5 מ"ל Tetracyclin: ~ 5 מ"ל LB: 5 L 96-גם צלחות שטוחות: 30 NGM 96-גם צלחות עגולות: 30 הקפאה (ניתוח) 96-DeepWell לוחות: 30 על תרבות הסרט התרבות: 30 תיבת טיפים: 30 לזריעה חיידקים 9 ס"מ OP50 צלחות: ~ 17 תולעים: 1 מופשר טרי cyrovial בחודש נבגי: ~ 2 צלחות NaCl 50mm + טריטון 0.05%: ~ 300 מ"ל

יום חמישי הכן RNAi NGM צלחות 96-היטב (~ 1h + החיטוי) יום שישי הכינו את 96-DeepWell צלחות ליברות (~ 4H) הכן תולעים (14 צלחות עם 30 תולעים בוגרות צעירות ב 20 ° C + 1 הצלחת של 25 ° C) יום שני העברת תולעים מן הצלחת במהירות של 25 ° C לצלחת חדש להפיץ חיידקים על צלחות ליברות (~ 7h) על תרבות בשעה 6 יום שלישי להפיץ חיידקים על צלחות NGM בבוקר (~ 3H+ ~~~HEAD=NNS 2H ייבוש) תולעים אקונומיקה מצלחות ב 20 ° C יום רביעי להפיץ תולעים בשעה 10 בבוקר (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h ייבוש) הבדיקה נבגים עם תולעים מן הצלחת במהירות של 25 מעלות צלזיוס יום חמישי להדביק תולעים בשעה 3 (~ 1h + ~~~HEAD=NNS 1h ייבוש) יום שישי העברת בניו 96-גם צלחות + הקפאה (~ 2h)

טבלה 1. דוגמה של ניסוי 1 מחזור עם 30 צלחות.

כאן מוצג החומר הדרוש לניסוי 1 מחזור של 30 צלחות ולוח זמנים עבור הניסוי משלב 1 לשלב 12 מאורגן על 9 ימים.

צמיחה נמטודות מדיה (NGM), 100 מ"ל:

0.3 גרם	NaCl
0.25 גר '	BactoPeptone
2 גרם	BactoAgar
100 μL	5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול EtOH
מוסיפים מים deionized ל -100 מ"ל
החיטוי במשך 5 דקות ב 121 מעלות ולתת מגניב, ולאחר מכן להוסיף:
100 μL	1 M MgSO 4
100 μL	1 M CaCl 2
2.5 מ"ל	1 ז KPO 4-pH 6.0

NGM לטיפול RNAi בצלחת 96-ובכן, 100 מ"ל:

0.29 גר '	NaCl
0.25 גר '	BactoPeptone
1.7 גרם	BactoAgar
100 μL	5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול EtOH
הוסף דה מיוננים מים 100 מ"ל
החיטוי במשך 5 דקות ב 121 מעלות ולתת מגניב, ולאחר מכן להוסיף:
100 μL	1 M MgSO 4
100 μL	1 M CaCl 2
2.5 מ"ל	1 ז KPO 4-pH 6.0
400 μL	1 M IPTG
100 μL	100 מ"ג / מ"ל ​​ampicillin
100 μL	12.5 מ"ג / מ"ל ​​טטרציקלין

פתרון Bleach, 5 מ"ל:

2.5 מ"ל H ₂ O
2.3 מ"ל אקונומיקה
0.2 מ"ל NaOH 50%

NaOH 50%, 100 מ"ל:

50 גרם NaOH
מוסיפים מים deionized ל -100 מ"ל

NaCl-50mm טריטון 0.05%, 400 מ"ל:

4 מ"ל NaCl 5 M
1 מ"ל טריטון 20%
מוסיפים מים כדי deionized 400 מ"ל

TEP "> טריטון 20%, 10 מ"ל:

2 מ"ל טריטון X-100
8 מ"ל מים deionized

M9 חיץ, 1 ליטר

6 גרם Na ₂ HPO ₄ (MW: 178)
3 גרם KH ₂ PO ₄ (MW: 136)
5 גרם NaCl
מוסיפים מים כדי deionized L 1
דוד לחץ
הוסף 1 מ"ל MgSO ₄ 1 M

מרק לוריא (LB), 1 ליטר:

10 גרם BactoTryptone
20 גרם תמצית שמרים
10 גרם NaCl
מוסיפים מים כדי deionized L 1
דוד לחץ

1 M MgSO _4, 300 מ"ל:

73.95 גרם MgSO ₄
מוסיפים מים כדי deionized 300 מ"ל
החיטוי וחנות בטמפרטורת החדר

5 מ"ג / מ"ל ​​כולסטרול, 200 מ"ל:

1 גרם כולסטרול
הוסף EtOH 100% עד 200 מ"ל
סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר

1 M CaCl _2, 500 מ"ל:

27.75 גר 'CaCl ₂
מוסיפים מים deionized 500 מ"ל
סנן לעקר ולאחסן בטמפרטורת החדר

1 M KPO ₄ pH 6.0, 4 L:

517 גרם KH ₂ PO ₄ (MW: 136)
207 גר 'K ₂ HPO ₄ (MW: 174)
מוסיפים מים כדי deionized L 4

100 מ"ג / מ"ל ​​ampicillin (AMP), 10 מ"ל:

1 גרם ampicillin
מוסיפים מים כדי deionized מ"ל 10
חנות ב -20 ° C

1 M איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 מ"ל:

2.38 גר 'IPTG
מוסיפים מים כדי deionized מ"ל 10
חנות ב -20 ° C

12.5 מ"ג / מ"ל ​​טטרציקלין, 100 מ"ל

1.25 גר 'טטרציקלין
הוסף EtOH 100% עד 100 מ"ל

טבלה 2. פתרונות.

Discussion

בפרוטוקול הנוכחי מאפשר בקנה מידה גדול ההקרנה RNAi ב ג elegans על התקשורת מוצקים, באמצעות רמת הביטוי של הגן כתב ניאון כמו לקריאה החוצה. זה כבר מותאם עם כלים אוטומטיים כדי להקל על מבחני תפוקה גבוהה, ומאפשר טיפול קל ומהיר של מספר גדול של דגימות, באופן יעיל, אמין לשחזור. שיטות אחרות תוארו שאינם מסתמכים במידה כה רבה על טיפול אוטומטי מדגם נוזלי ⁸.

היבט אחד הארגוני המפתח בפרוטוקול היה פיתוח של שיטת החזקה של מעקב אחר מדגם של התאמת תוכנה מסחרית MBioLIMS להליך מסך RNAi בשיתוף עם ModulBio החברה. בכל שלב של ההליך, צלחות מזוהים כעת ע"י ברקודים שנוצר בתוך LIMS. כמו LIMS גם מתעדת את זהותם של שיבוטים של כל אחד גם על כל צלחת, הולך מבאר לגן המשוערת היא פשוטה. ומעבר זה, את הקישורים LIMS ל WormBase באתר הקהילה, המאפשר גישה ישירה לנתונים מולקולרית ופונקציונלית על הגן נתון. LIMS גם מאפשר ניתוח להתנהל על הצלחת או אפילו ברמה כרומוזום ו-הגנום כולו. עבור ניתוחים אלה, הנתונים מאוחסנים באופן התואם לחלוטין את הכלים שתוארו קודם לכן, כגון COPAmulti ¹⁶.

נקודה אחת ניסיוני קריטי השיטה היא התאמת כמות המזון ביחס למספר של תולעים. מבחני רבות, חיוני כי תולעים לא למות מרעב בסוף הניסוי, אך חשוב גם לא להיות יותר מדי אוכל בהתחלה. ראינו כי צפיפות גבוהה של מזון פוחתת הקרינה אינדוקציה בפרוטוקול באמצעות תולעים הנושאים עמ ' NLP-29 :: כתב ה-GFP. זה עשוי לשקף את היעילות זיהום פחתה כאשר תולעים זה בתרבית חיידקים יותר מדי (BS, תוצאות שלא פורסמו). יחד עם זאת, התנאים והתרבות של חיידקים RNAi הוא גם חשוב, כי זה קובע אם dsRNA מופק ברמה אופטימלית. כמה פרוטוקולים בקנה מידה גדול RNAi דורשים תרבות של RNAi שיבוטים על צלחות אגר לפני זריעת תרבויות נוזלי ⁸. קיבלנו להשתקת גנים חזקים השמטת שלב זה. בחרנו לגידול העודף של כל תרבות על מנת להבטיח תוצאות הומוגניות. פרוטוקול תיאר למעשה מספק חומר מספיק כדי לנהל את 2 או 3 מסכים במקביל. למען השגת תוצאות חזקות ביותר, אנחנו בעד, לעומת זאת, מנהלת מסכי בשני עותקים באמצעות תרבויות עצמאיות של תולעים, חיידקים RNAi ו נבגי פטריות.

שלב קריטי נוסף קשור באמצעות מדיום שאינו לח מדי ולא יבש מדי. אם הצלחות לא יבשים מספיק, חיידקים RNAi לא להתייבש כראוי תולעים ישחו במהלך assay. זה יכול לגרום לבעיות. לדוגמה, תולעים לא נגועים בצורה יעילה על ידי ד coniospora בנוזל (כ Couillault, תוצאות שלא פורסמו). מצד שני, צלחות יבשות, osmolarity של עליות בינוני תרבות. זה יש השפעות ישירות על הפיזיולוגיה תולעת ¹⁷, כולל אינדוקציה של כמה גנים פפטיד מיקרוביאלית, כגון NLP 29 ¹⁸. נפח בשימוש לוותר תולעים נבגי הוא קריטי כדי לאפשר ייבוש יעיל ומהיר. אם יותר מ 10 μL של נוזל נוסף צלחות טריים, בארות את יכולה לקחת הרבה שעות לייבוש. זה יכול להיות שקשה להשתמש בשיטות רובוטיות כדי להוסיף תולעים ללוחות. לדוגמה, תולעת זו היא לוותר על Biosort ב μL סביב 1 של נוזל. בשלב זה אנו להפיץ את התולעים באופן ידני כמו גם מאפשר לנו להתגבר על הנטייה של תולעים פתרון משקעים.

אנחנו קודם לכן דיווחו התאמת Biosort שאיפשר 96-1 גם הצלחת להיות מנותח ב -36 דקות ¹⁹. יצרנית UBI מכונת מציעה כעת שינוי של Biosort כדי להקטין עוד יותר את זמן הניתוח. עם "FastReFlex", דגימות מנותבים ישירות דרך התא זרימה לניתוח, תוך עקיפת המסנן בועות המלכודת. התוצאה היא הפחתה משמעותית של זמן עבור רכישת נתונים, צלחת שלמה יכול להיות מנותח 22 דקות המאפשר כ -20 צלחות להיות מטופלים ליום. אם הצלחות לא הוקפאו, לעומת זאת, לא היה מרווח 8 שעות בין הראשונים והאחרונים. לאור משך הזמן הקצר יחסית של הניסוי, עם זיהום שנמשך רק 18 שעות, זה היה להציג את המשתנה מקובל על צלחות. לא רק צלחות הקפאת לפני ניתוח לפתור את הבעיה, אבל זה חיוני גם בהקשר של תפוקה גבוהה כמו ניתוחים, עם פרוטוקול הנוכחית סטנדרטיים נוזלי טיפול רובוטים, 2 אנשים יכולים בקלות לעבד עד 50 צלחות בשבוע. נכון לעכשיו, יש מסך שגרתי 30 צלחות בשבוע, מה שמאפשר המסך הגנום כולולהתנהל פעם אחת פחות מ 2 חודשים.

אחת התכונות המעניינות של פרוטוקול זה היא העובדה כי היא משתמשת אגר מוצק, מה שמאפשר מבחני שלא ניתן לבצע התרבות נוזלי. כמו תולעת הפיזיולוגיה משתנה בהתאם לתנאים תרבות ^20,21, להיות מסוגל לבצע מבחני על מצע מוצק יכול גם להשלים הרגילים נוזל מבוססי מסכי. עבור פנוטיפים מסוימים (תנועה למשל), הניתוח יכול להתבצע ישירות עם 96-גם מוצקים צלחות בינוניות. על המסך הנוכחי, עם זאת, כפי Biosort לא יכול לטעום מהצלחות בינוניים מוצקים, תולעים מועברים 1 לנוזל לפני ההקפאה. מצד שני, Biosort COPAS מאפשר ניתוח כמותי multiparametric תואמת המדידה של פנוטיפים שונים. סביר להניח כי עבור מסך נתון לא כל הפרמטרים הנמדדים יהיה העיקרית לקריאה החוצה. עם זאת, מדידות אלה יכול להיות שימושי עבור כמה סיבות. הם מאפשרים 1 כדי לקבוע אם assay רץ כראוי. לדוגמה, אפשר לבדוק את המספר ואת הגודל של התולעים היטב כל אחד מהם. רק כאשר שיבוט RNAi צריך לחסום את הצמיחה או רבייה צריך להיות סטייה מהערכים הצפויים. וולס עם פחות מ -20 תולעים ו / או בעלי חיים קטנים יותר (30% TOF) לעומת סטןגודארד שליטה ללא השפעה על הצמיחה ( למשל GFP (RNAi)) ניתן לשלול מן הניתוחים הבאים. פונקציה של שיבוטים אלו ניתן לטפל באמצעות פרוטוקול חלופי שבו תולעים נחשפים לחיידקים RNAi אחרי ההתפתחות שלהם היא מתקדמת היטב ¹⁵. הפרמטרים השונים יכול לשמש גם כדי לחדד את הגן המועמד (HIT) הבחירה, למשל, הגבלת להיטים רק לאלה המשפיעים פלואורסצנטי ירוק, אבל לא אדום. השיטה המדויקת נבחר לבחירת להיטים יהיה תלוי בסוג המסך המדויק לקריאה החוצה. נוכח המורכבות של הנתונים המופקים מן המסך הגנום כולו כמותית, בשיתוף עם סטטיסטיקאי ייתכן שיהיה צורך.

פרוטוקול אנו מתארים ניתן להתאים בקלות סוגים אחרים של מבחני. לדוגמה, בשלב הזיהום ד coniospora יכול להיות מוחלף על ידי פתוגן אחר מסוגל להדביק על התקשורת מוצקים. זה שימושי באופן פוטנציאלי שכן מצאנו כי רבים מהגורמים החשובים ארסיות על זיהום marcescens Serratia בתרבות נוזל לא משחק תפקיד במהלך ההדבקה על מצע מוצק (א 'Pradel, תקשורת אישית). הפרוטוקול הוא גם תואם באופן מלא עם בדיקות של תרכובות כימיקלים ^22-24, או לזהות תרכובות עם bioactivity שימוש בספריות שונות של חיידקים ²⁵, אז צריך למצוא את השירות כללי ג elegans קהילת המחקר.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
BactoAgar	BD ניתוח מערכות	214010
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
BactoPeptone	BD ניתוח מערכות	211677
CaCl 2	כל הספק
דבק AeraSeal הסרט	Dutscher	760214
איזופרופיל β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Scientific	AB-0481
K 2 HPO 4	כל הספק
KH 2 PO 4	כל הספק
MgSO 4	כל הספק
NaCl	כל הספק
Na 2 HPO 4	כל הספק
NaOH	כל הספק
96 צלחת באר עמוקה	Thermo Scientific	AB-0932
96 גם צלחת שטוחה	FALCON	353072
96 צלחת עגולה גם	FALCON	353077
טטרציקלין	Sigma-Aldrich	T8032
טריטון X-100	כל הספק
נץקאן רובוט	נץקאן
Liquidator96 TM	RAININ
COPAS Biosort	האיחוד Biometrica
LIMS	Modul-Bio