Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

Özet

Biz kullanarak bir protokol tarif C. elegans ve RNAi besleme kütüphaneler. Biz anti-mantar doğal bağışıklığın rol genleri tanımlamak için ekranın bir örnek vermek C. elegans.

Özet

RNA etkileşimi bir bütün-genom ölçekte ve kantitatif bir bağlamda yürütülen, özellikle gen fonksiyonlarını anlamak için güçlü bir yöntemdir. C. elegans, gen fonksiyonu belirli bir gen ¹ tekabül eden bir dsRNA ifade bakterilerle solucan besleyerek basit ve etkin nakavt olabilir. RNAi klonların kütüphaneleri oluşturulması C. çoğunu kapsayan iken elegans genom ^2,3 gerçek fonksiyonel genomik çalışmalar (örneğin ^4-7) bakın yolunu açtı, en köklü zahmetli yöntemler vardır. Moy ve arkadaşları genom ekranlar ⁸ kolaylaştırmak yarı otomatik protokolleri geliştirmiştir. Yaklaşımı mikroskopik görüntüleme ve görüntü analizine dayanmaktadır.

Burada alternatif bir bakteriyel RNAi klonlar, Copas Biosort (Union Biometrica (UBI)) kullanılarak kantitatif analiz robotlu taşıma dayalı yüksek verimlilik genom ekran için protokol, ve bir tarifentegre yazılım: MBioLIMS (Modül-Bio Laboratuar Bilgi Yönetim Sistemi) veri yönetimi ve örnek izleme için yüksek verim sağlayan bir teknoloji. Metodu ekranları katı orta plaka üzerinde gerçekleştirilen izin verir. Bu, C. kişilere hitap etmeni-konak ilişkilerinin gibi bazı çalışmalar için özellikle önemlidir elegans, belirli mikroplar verimli sıvı kültüründe solucanlar enfekte etmez yana.

Bu yöntem, C ile anti-fungal doğuştan gelen bağışıklık genlerin önemi ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir elegans. Bu durumda, bir yaklaşım içinde yapısal olarak ifade edilir antimikrobiyal peptit geni nlp 29 promoter ve kırmızı bir flüoresan raportör kontrolü altında GFP ile bir enfeksiyona epidermal-indüklenebilen flüoresan raportör genini taşıyan bir transjenik suşunun kullanımına dayanır epidermis. İkincisi epidermisin işlevsel bütünlüğü için bir iç kontrol sağlarve nonspesifik transgen ⁹ susturmak. Kontrolü solucanlar mantar tarafından enfekte olduğunda, onlar yeşil floresan. RNAi enfeksiyon sonrası azalan floresans nlp 29 ifade sonuçlar için gerekli olan bir gen tarafından aşağı vurma. Şu anda, bu protokol daha 3000 RNAi klonlar az 2 ay içinde toplam genomunu eleme olasılığını açılması, haftada test edildi ve analiz edilmesini sağlar.

Protokol

Aşağıda tarif edilen protokol ardışık beş gün (Şekil 1) üzerine adımları ayrılmıştır. Belirtildiği gibi, belirli bir adım farklı günde yapılabilir. Her adım, yanı sıra malzemenin miktar gerekli süre (örn. solucanlar, bakteriler, ortam) deneyi başına muamele 96 oyuklu plakalar sayısına bağlı olacaktır.

1. Gün

1. 96-kuyucuklu plaklar NGM RNAi hazırlanması

Aşağıdaki protokol muhtelif çözeltileri için sterilizasyon teknikleri ayrıntıları içerir solucanı kültür plakaları ¹⁰ yapmak için standart bir yöntem, uyarlanmıştır.

1. 1.7 g BactoAgar, 0.29 g NaCl, 0.25 g pepton, 100 uL kolesterol (EtOH içinde 5 mg / mL): 10-12 96-kuyucuklu plaklar için deiyonize _H2O in nematodu büyüme ortamı 100 mL (NGM) hazırlanır.
2. Otoklav NGM (121 az 5 dakika ° C'de 100 ml için; 121 30 dakika 4 ° L C) yaklaşık 50 ° C (sadece serin eno gelene kadar alıp soğumasını bekleyin) tutmak için ugh. Bu NGM katılaşmaya etmemesi için yeterince sıcak kalmasını önemlidir.
3. 100 mL için ekleme: 2.5 mL fosfat tampon maddesi PH6 (1 M), 100 uL MgSO ₄ (1 M), 100 uL _CaCl2 (1 M), 400 uL IPTG (1 M), 100 uL Ampisilin (100 mg / mL), 100 uL Tetrasiklin (EtOH içinde 12.5 mg / mL).
4. 96 çukurlu bir düz alt levhanın her oyuğa NGM 75 uL dağıtın. Orta katılaşma önlemek için, hızla reçete edilmesi gerekmektedir; bunu tekrarlayan bir dağıtıcı (örneğin Repeatman, Eppendorf) kullanmak daha uygun olur. Kuyu mevcut hava kabarcıkları vardır emin olun.
5. 4 ° C de nemli bir odacık (örn. altındaki ıslak kağıt havlu ile bir Tupperware kutusu) hemen plakaları depolamak

Not: plakaları önceden bir hafta kadar hazırlanan ve 4 saklanabilir ° C; bu sonraki adımları organizasyonu daha kolay yapabilirsiniz.

2. 96-derin kuyucuklu plak LB otomatikleştirilmiş hazırlanması

1. Ampisilin 100μg/mL ve Tetrasiklin 12,5 2 ml / da maksimum kapasitesine sahip bir 96-derin kuyucuklu plakanın her kuyuya mcg / mL içeren 1.5 ml LB hazırlamak ve dağıtmak. Dağıtım bir robotik sıvı taşıma sistemi (örneğin Tecan) kullanılarak optimize edilir, ancak, aynı zamanda elle gerekirse gerçekleştirilebilir.
2. 4 ° C de her plaka ve saklamak için bir kapak ekle Her 96-kuyulu plakalı izlemek üzere, benzersiz bir etiket veya barkod bu aşamada ya da daha sonra ilave edilmelidir.

Not: plakaları önceden 2 ila 3 gün hazırlanan ve 4 saklanabilir ° C; bu sonraki adımları organizasyonu daha kolay yapabilirsiniz.

3. 96-derin kuyucuklu LB levhalar (gece kültür) olarak RNAi bakteriyel klonları Grow

1. Orijinal RNAi kütüphanesi klonlar etiketli ya da standart çubuğu-kodlanmış 96-kuyucuklu 100 ug / mL Amp sahip LB ihtiva eden plakalar ve 12.5 ug / mL 'T içinde bir 384 kuyucuklu biçiminde, birinci dağıtma klonlar olup işleme müteakip kolaylığı için,ve gliserol (% 10 nihai konsantrasyon) ile desteklenmiştir. Orijinal 384-iyi plakaları tüm kuyularda klonlar olmadığında, gibi en sık kullanılan "Ahringer" kütüphane için olduğu gibi, kızı plakalar düzenlemek için çeşitli seçenekler vardır. Klonlar kızı plakaları hiç boş kuyu vardır, böylece yeniden dağıtılabilir. Bu ekrana plakaların sayısını en aza indirir. İdeal olarak, ancak, çoğaltma sırasında, her kızı plaka üzerinde birkaç tane kuyu bu sonradan boyunca plakalı karşılaştırmaları kolaylaştırmak standart kontrol klon (pozitif ve negatif) ile doldurulabilir, böylece boş bırakılmalıdır. Bunlar, 96-kuyucuklu plaklar kız daha sonra, bir gece (ON) kültürü için tohum 96-derin kuyucuklu plaklar LB için kullanılır.

Her sıvı idare adımları iyi bir sıvı robotik işleme sistemi (örneğin Tecan) ile yapılabilir, ancak kullanılarak elle yapılabilir, örneğin, bir 96-pin çoklayıcıyı. RNAi kütüphane klonlar 96-iyi biçimde iseniz 3.5 adıma geçin.

2. 37 at 96-kuyucuklu RNAi kız inkübe ° C'de 14-15 saat boyunca karıştırma (200 rpm) ile.
3. Bakteri doğru büyüdü doğrulayın ve büyümeye vermedi klonları tanımlamak. Bunlar daha sonra analiz dışında tutulacaktır. İdeal olarak, OD _600, her sıra ile ölçülür, ancak bu basit bir inceleme ile yapılabilir.
4. ° C'de kullanımdan önce -80 azından 96-kuyucuklu plaklar RNAi kız depolamak.
5. Oda sıcaklığında RNAi klonlar içeren 96 kuyucuklu plaklar çözünmesi. Sonra plakalar ° C, kullanılıncaya kadar 4 tutulabilir.
6. 100 ug / mL Amp sahip LB 1,5 mL içeren buna uygun olarak etiketlenmiş / barkodlu 96-derin kuyucuklu LB plakanın 96 kuyucuklu ve 12.5 ug / mL Tet için bir 96-kuyulu plakalı çoğaltmak her bakteriyel klonunun 3 uL dağıtın. RNAi gibi, mevcut örnekte, bir gfp (RNAi) klon olarak etkinliği, ve negatif kontroller, kontrol etmek için bakteriyel klonlar mevcut herhangi bir boş iyi elle dahil edilebilir.
7. 96-derin kuyucuklu p Kapakyapışkan bir film (Dutscher örneğin AeraSeal hücresel kültürü filmi) ile lates. -80 De kullanılan 96-kuyulu plakalı kopyalayan ° C. yerini
8. 96-derin kuyucuklu plaklar etiketli daha sonra 37 üzerinde inkübe edilir ° C'de karıştırılarak (14-15 saat boyunca 200 rpm).

2. Gün

4. 96-kuyucuklu NGM RNAi plakaları üzerine tohumu RNAi bakteriyel klonları

Bu adımda ON kültürü takiben sabah yapılmalıdır.

1. 4 96-NGM plakaları Take ° C ve onları steril bir laminer akış kabini altında 5-15 dakika kadar ısıtın ve kurumaya bırakın. Aksi NGM sonradan çatlayabilir gibi, çok uzun kaput (maksimum 30 dakika) altında plakaları bırakmayın. Her plaka için uygun etiket / barkod ekleyin.
2. 37 ° C kültüre plakaları ON 96-derin kuyucuklu Al Herhangi bir boş kuyular (boş bir zamanda tamamen şeffaf olan) pozisyonlarını kaydedin; Bu müteakip analizler dışında tutulacaktır.
3. 96 Santrifüj-Derin kuyucuklu plakalar 4000 rpm'de 5 dk.
4. Keskin bir şekilde baş aşağı plaka dönüm ve bir kağıt havlu üzerine hızla plakanın kenarlarına kuru ile süpernatantı kapalı İpucu. Kültürlerin rekombinant bakteri olduğu için, süpernatant yerel düzenlemelere (örneğin otoklavlanmış) uygun olarak tedavi edilmesi gerekir.
5. Ideal olarak her bir plaka tam olarak aynı arıtma alır, böylece ayrı bir karıştırıcı (örn. Tecan) kullanılarak, vorteks ile artık sıvı (yaklaşık 50 uL) içindeki bakteriyel pelletini. O sonraki adım için kesin bakteriyel inokulum standardize etmek, her iyi OD ₆₀₀ ölçmek mümkündür, ama bu vazgeçilmez değildir ve biz böyle bir onay yapmazlar.
6. Bir 8 veya 12-kanal Çok-pipet kullanılarak 96-kuyucuklu NGM plakaları üzerine yeniden süspanse bakteri 5 uL transfer edin. NGM dokunmayın veya nüfuz için dikkatli olun. Bu adımda elle gerçekleştirilir, fakat böyle Liquidator96 (Rainin) gibi bir robot kullanılarak optimize edilebilir izin verenbir adımda 96 RNAi klonlar dağıtılması.
7. NGM çok kuru olma önlemek için düzenli kontrol, steril bir laminer akış kabini altında bakteri kurumasını bekleyin. Bu adım, yaklaşık 2 saat sürer.
8. Nemli odasında ON 37 ° C'de 96-RNAi-NGM inkübe edin.

5.. Solucanlar senkronize bir nüfus hazırlayın

Bu adım için, biz ilgi raportör gen (ler) (bir enfeksiyon-indüklenebilir p nlp-29 :: GFP yapı ve örneğin, bir iç kontrol olarak, kurucu bir p col-12 :: DsRed transgen inşa) taşıyan transgenik solucanlar kullanın . Çünkü zaman transgen ifade azalma gözlendiğini, biz solucanlar her 6 haftada taze toplu çözülme. Biz kültür kullanımdan önce en az 2 nesiller için solucanlar ve solucanlar tahlilinden önce açlıktan hiç emin olun. Protokolün 2 Salı günü ise, biz OP50 bakteri ile bulaşan bir 9 cm NGM plaka üzerine 30 genç erişkin solucanlar yerleştirerek Cuma günü solucanlar hazırlamak20 ° C de Salı günü (bkz. Tablo 1) üzerinde çamaşır suyu hazır olacak.

1. Standart protokol ¹⁰ takip Bleach solucanlar.
2. Yumurta L1 larvaların senkronize bir nüfusa almak için ajitasyon ile AÇIK 25 ° C'de M9 yumurtadan çıkarlar edelim.

3. Gün

6. Besleme ve RNAi için 96-iyi RNAi-NGM tabaklarda solucanlar dağıtın

Bu adımda sabah yapılmalıdır. L1-aşamalı senkronize solucan besleme ve RNAi her 96-bakteriyel klon üzerine dağıtılır.

1. 37 ° C den 96-kuyucuklu plaklar RNAi-NGM almak ve soğutmak için oda sıcaklığında bırakırlar.
2. 25 ° C arası ağartılmış solucanlar almak 2 uL başına solucan sayısını tahmin ve 2 uL başına yaklaşık 100-120 solucanları (kabaca tek bir damla) sahip M9 ile ayarlayın.
3. Elle tekrarlayan bir dağıtıcı kullanarak her iyi L1 aşamalı solucanlar 2 uL dağıtın. Solucanlar (Eğer sıvı içinde yüzme solucanlar görmelisiniz) her iyi kontrol edin.
4. Steril bir laminer akış kabini (maksimum 1 saat) altında plakaları kurumasını bekleyin. Düzenli plakaları kontrol edin; solucanlar sürünen ve yüzme edilmemelidir. Dikkatli olun, NGM çok kuru olmamalıdır, aksi takdirde çatlar.
5. Nemli bir odada 25 ° C'de plakaları yerleştirin.

7. Etkili enfeksiyon için Drechmeria coniospora sporlar Test

Bu aşama, mevcut ekran için spesifik değildir. Oldukça infektif olanları seçmek için sporlar farklı toplu test oluşur. Bu nedenle günde 4, enfeksiyon gününden önce mümkün olduğunca yakın yapılmalıdır. Bu testler (Tablo 1) için önceden yeterli L3-L4 solucanlar hazırlamak için gereklidir. D. için gerekli yöntemleri ayrıntılı coniospora kültürü başka ¹¹ tarif edilmiştir.

1. M9 küçük bir hacim içinde her mantar kültürü bir örneklem üzerinden sporlar toplayın.
2. OP50 ile tohumlanan 35 mm NGM plaka üzerinde her spor süspansiyonu bir damla yerleştirin ve kurumaya bırakın.
3. Ilgi muhabiri geni taşıyan 30-40 L3-L4 solucanları (örneğin p nlp-29 :: GFP) ekleyin.
4. 25 ° C 'de enfekte plakaları yerleştirin.
5. Ertesi gün, GFP indüksiyonu için solucanlar kontrol ve yeşil floresan parlak, en geniş ve en homojen indüksiyon veren mantar toplu seçin.

4. Gün

8. D. ile RNAi maruz kalan solucanları Infect coniospora sporlar

Bu adım 30 saat RNAi solucanlar L3-L4 sahne ulaştığınızda beslenmesinden sonra yapılır.

1. Başına iyi 4 uL dağıtmak için kullanmak sporların hacmi belirleyin.
2. Taze D. toplayın M9 tamponu ile seçilen parti coniospora sporlar. Sporlar biri 9 cm plaka için M9 8-10 mL kullanın.
3. tekrarlayan bir dağıtıcı ile her kuyuya sporların 4 uL dağıtın. Sporlar (Eğer sıvı içinde solucanlar yüzme görebilirsiniz) için her iyi kontrol edin.
4. Steril bir laminer akış kabini (~ 1 saat) altında plakaları kurumasını bekleyin. Solucanlar sürünen başlamak kadar düzenli plakaları kontrol edin. Dikkatli olun, NGM çok kuru olmamalıdır, aksi takdirde çatlar.
5. Nemli bir odasında 25 enfekte plakaları ° C yerleştirin.

5. Gün

9. Otomatik kantitatif analiz önce plakaların Gözlem ve depolama

Bu adımda enfeksiyondan sonra 18 saat sonra başlar ve günde 5 sırasında gerçekleştirilir. Worms yumurtlamak için başlayan genç erişkinlerde olması bekleniyor. Bu basamak sırasında fenotip görsel skor belirlenir: ya solucanlar normal bir durum enfeksiyona tekabül yeşil floresan veya GFP indüksiyonu yani, belirli bir zamanda değiştirilmiş olduğu susturuldu geni değişiklikler enfeksiyona tepkisi.

1. Hızla floresan mikroskop altında tabak gözlemlemek. Plakalar iyi bir genel GFP indüksiyon göstermesi durumunda daha sonra bir sonraki adıma geçin, aksi sürece solucanlar için sol gıda hala var gibi, daha iyi bir indüksiyon için öğleden sonraya kadar bekleyin.
2. Görme, her plaka puan ve belirgin bir fenotip (GFP ekspresyonu gibi) ile herhangi bir iyi not edin. Eklenmiş olabilecek herhangi bir kontrol RNAi klonları ile elde edilen sonuçların kontrol ederek, bu ilk ön analiz denemesi başarılı olup olmadığını bir göstergesidir.
3. Için, 50 mM NaCl-Triton 0.05% 100 uL ile 8 veya 12 kanallı Çok Pipet transferi solucanlar kullanarak yeni bir buna etiketli / 96-Yuvarlak tabanlı plaka barkodlu. -80, Tabaklar Freeze ° C analizi kadar.
4. Analiz gününde, oda sıcaklığında, plakalar çözünmesi ve Copas Biosort kullanılarak otomatik analizi ile devam edin. Sıralayıcı 22 dakika içinde tek bir plaka analiz eder. Plakalar olmamalıdıranalizden önce bir saat daha oda sıcaklığında bırakılır, ve yine dondurulabilir edilemez.
5. Copas Biosort elde edilen bilgiler veri kalitesi üstünkörü doğrulanması için bir Excel dosyasına kopyalanır. Copas Biosort (üç farklı dedektörler tarafından eş zamanlı optik yoğunluk (yok), aksiyel uzunluk (uçuş süresi), floresans emisyon) ile ölçülen farklı parametrelerle ham veriler daha sonra özel bir LIMS paketi (MBio LIMS, saklanır Modul- daha sonraki ayrıntılı kantitatif analiz için Bio).

10. Temsilcisi Sonuçlar

Çoğu kuyu, deney sonunda, yukarıda verilen solucan ve bakterilerin miktarda kullanarak, tüm hayvanlara yetişkinliğe geliştirdi olmalıdır ve hala tüm kuyular kalan bazı gıda olmalıdır. Bu koşullar altında, en fazla kuyu ayrıca yumurta içermelidir. Bu nedenle de Biosort verileri f elde edildiği her yetişkin yeterli sayıda olmalıdırya da en azından 50 bireysel solucanlar. RNAi etkin ise, diğer yandan, RNAi klonlar, çok sayıda görünür bir fenotip sebep olur. Örneğin, solucanlar koordine edilmemiş ya da daha çok açıktır ki, steril, veya gelişimlerini yakalanan olabilir. Bu, genellikle de 96-kuyulu plakalı başına en az bir açık bir RNAi fenotipe sahip solucanlar içerir, böylece sık ortaya. Ilgi fenotipi bir GFP raportör gen ifadesi olduğunda, bir gfp (RNAi) klon kuyu güçlü bir kontrol (Şekil 2) sağlar. Böyle boyutlu bir değişikliğe gibi diğer fenotip, kolaylıkla Biosort (Şekil 3A) ile ölçülebilir. Biz iyi gıda tükendi ne zaman solucanlar çok düşük frekans (<% 1, BS, yayınlanmamış sonuçlar) bitişik kuyu göç gözlemlenmiştir.

Genlerin farklı sınıflar işlevi aşağı vurma C. transgenlerin ifade etkileyebilir elegans. Bazıları non-spesifik transgenlerin ifadesi ¹² için gereklidir. Diğerleri, örneğindokuya özel transkripsiyon faktörleri gibi, örneğin epidermal GATA faktörü ELT-3 ^13, hücrelerin, özellikle alt gerekli olacaktır. Bu, geçerli protokol için kullanılan gerilim olmayan bir ilgili ve kurucu epidermal hücre transgen muhabiri yapı (p col-12 :: DsRed) dahil nedenlerinden biridir. Bu tür gen spesifik olarak üzerinde çalışılan genin düzenleyici proses (Şekil 3B ve C) yer ayırt edilmesini sağlar. Bu transgen tüm larva aşamalarında ifade edilir. Bir deneyde embriyolarında tespit gen ekspresyonu içeriyorsa, farklı bir denetim raportör gen gerekli olacaktır.

Bu protokolün yeniliklerden biri kendi analizini erteleme donma plakaların kullanılmasıdır. Donma plakaları ölçüde sonuçlar değiştirmeden iki hafta için kadar muhafaza edilmesini sağlar. Ölçülen floresans mutlak değerleri değiştirilebilir olmasına rağmen, bunların nispi oranları (Şekil 4) 'e benzer kalır. Ot Açıkelini, RNAi bir içsel değişken deneysel prosedür ^14'tür. Sağlam sonuçlar elde etmek ve birçok potansiyel yanlış pozitif ortadan kaldırmak için, RNAi ekranları en az bir kez, çoğaltılması gerekmektedir. Deneyler başarılı bir şekilde yürütülür ise, farklı günde bir test plakası elde edilen sonuçlar arasında makul bir korelasyon vardır olmalıdır. Özellikle güçlü bir etkiye sahip genler bunların kesin kantitatif etkisi çift plaka (Şek. 5) ile özdeş olmasa da, açık bir şekilde tanımlanabilir olmalıdır.

Şekil 1. Tipik bir deney için genel şeması.

Şekil 2. Kontrol RNAi GFP hedefleyen bir klon kullanarak. Transgenik solucanlar expressing Konstitütif ap col-12 :: DsRed muhabiri ve indüklenebilir p nlp 29 :: 96-iyi plaka katı ortam üzerinde GFP muhabiri kırmızı ve yeşil floresan eşzamanlı gözlem izin veren bir filtre seti ile mikroskop diseksiyon bir GFP ile görüntülendi. Solucanlar kontrol (üst panel) ya da 48 saat süre ile, bir GFP RNAi clone (alt paneller) maruz bırakılmıştır. Soldaki panelleri 18 saat D. ile enfeksiyondan sonra bulaşmamış solucanlar, sağ solucanlar üzerinde olanlardır coniospora. Ölçek çubuğu 1 mm'dir.

Şekil 3. Bir 96-kuyulu plakanın nicel. Copas Biosort analiz edilen her bir solucan için sayısal veri oluşturur. Solucanlar ^15, kırmızı floresans (B) ve transgenik wo TOF yeşil floresans oranı (X100) (C) boyutu karşılık; grafikler uçuş süresi için ortalama ve standart sapma (A TOF) göstermekrms yapısal olarak ifade ap col-12 :: DsRed muhabiri ve indüklenebilir p nlp 29 :: 18 saat D. ile enfeksiyondan sonra 48 saat için farklı RNAi klonları ile 96-plaka katı ortamında kültüre edilmiş GFP muhabiri, coniospora. Gibi (A), provoke büyüme bozukluklar ve / ya da p-col 12 :: DsRed ifadesi etkiler de ok ile vurgulanmış olarak belirli bir klon. (C) de ok ile öne gibi diğerleri, özel olarak, GFP tanımı etkilemez. Bu özel klonu daha önce nlp 29 ¹³ düzenlenmesi için önemli olduğu gösterilmiştir gen nsy 1 hedefliyor. Yeşil, kırmızı floresans ve TOF keyfi ancak sabit birimi ile ölçülür.

Şekil 4. Zorunluaynı deneyi canlı ve dondurulmuş numuneler ile elde edilen verilerin Arison. P nlp-29 :: GFP ve p col-12 :: DsRed transgenlerin taşıyan L4 solucanlar levhalar ya D. ile enfekte edildi coniospora veya olmasın. 18 saat sonra, her plaka kabaca 2 ayrılır; yarısı hemen analiz ve çözme ve analiz önce yarım, 24 saat için -80 ° C'de donduruldu. Ortalama TOF (solucan boyutu), EXT (optik yoğunluk) ve Yeşil ve Kırmızı floresan değerleri her bir örnek için hesaplandı. Grafik için ortalama oranını gösteren enfekte olmayan numuneler bölünmesiyle bulaşmış, dondurulmuş ve canlı örnekler için (n = 7638 ve 5096, ve 8634 ve 3850 solucanlar).

Şekil 5. Çoğaltılmış 96-kuyucuklu plaklar karşılaştırmalı analizi. Normalize floresans oranı (ortalama floresan oranı (Burada, her biri 100 iyi bölünmesiyle için * yeşil / TOF)temsilcisi 96-plaka yinelenen analizler her iyi (25 ^{th 75.} persentil) her plaka için ortalama) kesilmiş.

Malzeme

Deneysel Timeline

IPTG: ~ 1.4 mL Ampisilin: ~ 5 ml Tetrasiklin: ~ 5 ml LB: 5 L 96-kuyucuklu plaklar düz: 30 NGM için 96-yuvarlak levhalar: 30 dondurma (analiz) 96-derin kuyucuklu plakalar: 30 kültür ON kültürü film: 30 İpuçları kutusu: 30 bakteri ekim için 9 cm OP50 plakalar: ~ 17 Worms: 1 taze cyrovial çözülmüş aylık Sporlar: ~ 2 tabak 50 mM NaCl +% 0.05 Triton: ~ 300 mL

Perşembe NGM RNAi 96-levhalar (~ 1h + otoklav) hazırlayın Cuma 96-derin kuyucuklu LB levhalar (~ 4h) hazırlayın Solucanlar hazırlayın (20 30 genç erişkin solucanlar ile 14 plaka, 25 ° C + 1 tabak ° C) Pazartesi Yeni plaka üzerine 25 ° C'de plakadan solucanlar Transfer LB plakaları bakteri dağıtın (~ 7h) Saat 6'da kültür ÜZERİNE Salı Sabah NGM plakalar üzerinde bakteri Dağıt (~ 3h+ ~ 2s kurutma) 20 ° C'de plakalardan Bleach solucanlar Çarşamba 10 am (~ ~ 1h 1h + kurutma) de solucanlar dağıtın 25 plaka solucanlar Test sporlar ° C Perşembe 3 pm (~ ~ 1h 1h + kurutma) de solucanlar Infect Cuma 96-plaka + freeze (~ 2 saat) Yeni Transfer

Tablo 1. 30 plakaları ile tek döngüsü Deney Örneği.

Burada 9 gün düzenlenen 12 adım adım 1'den bir deney için 30 plaka bir döngüsü deney ve bir zaman çizelgesi için gerekli malzeme sunulmaktadır.

Nematodu büyüme ortamı (NGM), 100 mL:

0.3 g	NaCl
0.25 g	BactoPeptone
2 g	BactoAgar
100 uL	EtOH içinde 5 mg / mL Kolesterol
100 ml deiyonize su ilave edilir
121 az 5 dakika Otoklav ° C ve ekleyin, sonra soğumaya bırakın:
100 uL	1 M MgSO 4
100 uL	1 M CaCI2
2,5 mL	1 M KPO 4 pH 6.0

96-kuyulu plakalı, 100 mL RNAi tedavisi için NGM:

0.29 g	NaCl
0.25 g	BactoPeptone
1.7 g	BactoAgar
100 uL	EtOH içinde 5 mg / mL Kolesterol
De ekle iyonize su ile 100 mL
121 az 5 dakika Otoklav ° C ve ekleyin, sonra soğumaya bırakın:
100 uL	1 M MgSO 4
100 uL	1 M CaCI2
2,5 mL	1 M KPO 4 pH 6.0
400 uL	1 M IPTG
100 uL	100 mg / ml ampisilin
100 uL	12.5 mg / mL Tetrasiklin

Çamaşır suyu, 5ml:

2.5 ml _H2O
2,3 mL Bleach
0,2 mL% 50 NaOH

NaOH 50%, 100 mL:

50 g NaOH
100 ml deiyonize su ilave edilir

50 mM NaCl-Triton 0.05%, 400 mL:

4 mL NaCl 5 M
1 mL Triton% 20
400 ml deiyonize su ilave edilir

TEP ">% 20 Triton, 10 mL:

2 mL Triton X-100
8 ml deiyonize su

M9 tampon, 1L

6 g Na ₂ HPO ₄ (MW: 178)
3 g KH ₂ PO ₄ (MW: 136)
5 g NaCl
1 L saf su ekleyin
Otoklavlayın
1 ml MgSO ₄ 1 M ekle

Luria Broth (LB), 1L:

10 g BactoTryptone
20 gr Maya özü
10 g NaCl
1 L saf su ekleyin
Otoklavlayın

1 M MgSO _4, 300 mL:

73.95 g MgSO ₄
300 ml deiyonize su ilave edilir
Oda sıcaklığında, otoklav ve deposu

5 mg / mL Kolesterol, 200 mL:

1 g Kolesterol
200 mL% 100 EtOH ekleme
Sterilize filtreleme ve oda sıcaklığında saklayın

1 M _CaCI2, 500 mL:

27.75 g _CaCI2
500 ml deiyonize su ilave edilir
Sterilize filtreleme ve oda sıcaklığında saklayın

1 M KPO ₄ pH 6.0, 4 L:

517 g KH ₂ PO ₄ (MW: 136)
207 g K ₂ HPO ₄ (MW: 174)
4 L deiyonize su ekleyin

100 mg / ml ampisilin (Amp), 10 mL:

1 g ampisilin
10 ml deiyonize su ilave edilir
-20 ° C'de deposunda

1 M İzopropil β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG), 10 mL:

2.38 g IPTG
10 ml deiyonize su ilave edilir
-20 ° C'de deposunda

12.5 mg / mL tetrasiklin, 100 mL

1.25 g Tetrasiklin
100 mL% 100 EtOH ekleme

Tablo 2. Çözümler.

Tartışmalar

Geçerli protokol, büyük ölçekli RNAi tarama sağlar C. elegans Bir floresan raportör gen ekspresyon düzeyi gibi bir okuma-out kullanarak katı ortamlar üzerine. Bu, etkin, güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde, örnekler çok sayıda, kolay ve hızlı kullanım sağlayan, yüksek verimli testler kolaylaştırmak için otomatik araçlar ile optimize edilmiştir. Diğer yöntemler otomatik sıvı numune alma üzerinde bu kadar yoğun güvenmeyin ki tarif edilmiştir ⁸.

Protokolü tek anahtarı örgütsel yönü şirket ModulBio ile işbirliği içinde RNAi ekran prosedüre ticari MBioLIMS yazılım uyarlayarak örnek izleme sağlam bir yöntem gelişme olmuştur. Prosedürünün her aşamasında, plakalar artık LIMS içinde üretilen barkodlar ile tanımlanır. LIMS ayrıca her plaka her iyi klonlar kimliğini kaydeder gibi, kuyudan olası gen gidiyor basittir. Ve bunun da ötesinde, toplum veritabanı WormBase için LIMS bağlantılar, herhangi bir gen hakkında moleküler ve fonksiyonel verilere doğrudan erişim sağlar. LIMS ayrıca analiz plaka hatta kromozom ve tüm-genom düzeyinde yapılacak kolaylaştırır. Bu analizler için, veriler gibi COPAmulti daha önce açıklandığı gibi araçlar ile tamamen uyumlu bir şekilde saklanır ¹⁶.

Yöntemi kritik bir deney noktası solucanların sayısına göre gıda maddesi miktarının ayarlanmasıdır. Birçok testlerde, bu solucanlar deney sonunda açlıktan ölmeyeceği esastır ama başında çok fazla yiyecek için değil de önemlidir. Biz gıda yüksek yoğunluklu p taşıyan solucanlar kullanarak protokolde floresans indüksiyon azaldığı gözlenmiştir var Nlp-29 :: GFP muhabiri. Solucanlar (BS, yayınlanmamış sonuçlar) çok fazla bakteri kültürlenmiştir Bu bir azalma enfeksiyon verimliliği yansıtıyor olabilir. Bu dsRNA optimum düzeyde üretilen olup olmadığını belirler yana Aynı zamanda, RNAi bakteri kültürü koşulları da önemlidir. Büyük ölçekli RNAi için bazı protokoller sıvı kültürlerde tohumlama öncesinde agar plakalar üzerine RNAi klonlarının kültürü gerektirir ⁸. Biz bu adımı atlayarak sağlam gen suskunluğu aldı. Biz homojen sonuçları sağlamak için her kültürün aşırı büyüyen tercih etti. Aslında anlatılan protokolde paralel olarak 2 veya 3 ekranları yürütmek için yeterli bir malzeme sağlar. En sağlam sonuçlar elde faiz, biz de ekranları yürütülmesi, ancak iyilik solucanlar, RNAi bakteri ve mantar sporları bağımsız kültürleri kullanarak çoğaltmak.

Başka kritik adım çok nemli ne de çok kuru ne olduğunu orta kullanarak ilişkilidir. Plakalar yeterince kuru değilse, RNAi bakteri düzgün kurumaz ve solucanlar deney sırasında yüzmek olacak. Bu sorunlara neden olabilir. Örneğin, solucanlar verimli bulaşmış değildir D. coniospora Sıvı (C. Couillault, yayınlanmamış sonuçlar). Diğer taraftan, kuru plakalar, kültür ortamı artar osmolarite. Bu solucan fizyolojisi üzerinde doğrudan etkiye sahiptir ¹⁷ Gibi bazı antimikrobiyal peptit genlerin indüksiyon, dahil olmak üzere Nlp 29 ¹⁸. Solucanlar ve sporlar boşaltmak için kullanılan ses etkili ve hızlı kurumaya izin vermek önemlidir. Sıvı fazla 10 uL taze plakalara ilave edilir ise, kuyu kurutmak için birçok saat alabilir. Bu plakalara solucanlar eklemek için robotik cerrahi yöntemler kullanmak zor olduğu anlamına gelebilir. Örneğin, her bir solucan sıvı yaklaşık 1 uL in Biosort ile dağıtılır. Bu da bize tortuları çözüm solucanlar eğilimi aşmak için verir gibi şu anda elle solucanlar dağıtmak.

Biz daha önce bir 96-plaka 36 dakika içinde analiz izin olduğunu Biosort bir ayarlama rapor ¹⁹. Makinenin üreticisi UBI şimdi daha analizi zamanda azaltmak için Biosort bir modifikasyonu sunmaktadır. "FastReFlex" ile, örnekleri doğrudan kabarcık-tuzak filtre atlayarak, analiz için akış hücresi üzerinden yönlendirilir. Veri toplama için süresinde önemli bir azalma ile sonuçlanır; bir bütün plakası günlük tedavi edilmesi için 20 plakaları yaklaşık 22 dakika içinde izin analiz edilebilir. Plakalar dondurulabilir olmasaydı Bununla birlikte, birinci ve sonuncu olanlar arasında bir 8 saat arayla olacaktı. Sadece 18 saat süren enfeksiyonu ile deney nispeten kısa süreli, göz önüne alındığında, bu plakaları arasında kabul edilemez bir değişken tanıtmak olacaktır. Dondurma plakalar Bu sorunu gidermek analizden önce yapar, ancak, 2 kişi rahatlıkla 50 plaka bir hafta kadar işleyebilir geçerli protokol ve standart sıvı işleme robotlar gibi aynı zamanda yüksek verimlilik analizi bağlamında gerekli değil sadece. Şu anda, rutin ekran 30 plaka bir hafta, bir bütün-genom ekran veriyorden az 2 ay sonra yapılacak.

Bir ilginç özelliği de sıvı kültürü yapılamayan deneyler sağlayan, katı agar kullandığı bir gerçektir. Solucan fizyolojisi kültür koşullarına bağlı olarak değişkenlik ^20,21, Katı ortam üzerinde deneyler ayrıca olağan sıvı tabanlı ekranlar tamamlayabilir gerçekleştirmek için güçlü olmak. Belirli bir fenotip (örn. hareketi) için analiz 96-kuyucuklu bir katı orta plaka ile doğrudan gerçekleştirilebilir. Geçerli ekran için, ancak, Biosort gibi katı orta plakalardan örnek olamaz, solucanlar ilk dondurmadan önce sıvı aktarılır. Diğer taraftan, Copas Biosort birçok farklı fenotip ölçümü ile uyumlu bir çok parametreli sayısal analizi izin verir. Bu herhangi bir ekran için değil, tüm ölçülen parametreler birincil okuma-out olacağı muhtemeldir. Bununla birlikte, bu ölçümler çeşitli nedenlerden için yararlı olabilir. Bunlar tek bir tahlil doğru ran olup olmadığını belirlemek için olanak sağlar. Örneğin, her birinde iyi solucan sayısı ve büyüklüğü kontrol edebilirsiniz. Bir RNAi klon büyüme veya üreme engellemelisiniz Sadece nerede var beklenen değerlerden bir sapma olmalıdır. Den az 20 solucanların veya / ve% 30 daha küçük hayvanlara (TOF) ile Wells, bir standardına görelerinin büyümesi üzerindeki etkisi ile kontrol ( Örneğin gfp (RNAi)) Daha sonraki analizlerde dışında bırakılabilir. Onların gelişimi ileri düzeydedir sonra bu klonların fonksiyonu solucanlar RNAi bakterilere maruz kalan neyin alternatif bir protokol kullanılarak ele alınabilir ¹⁵. Farklı parametreler de sadece yeşil floresan ama kırmızı değil etkileyecek olanlar isabetleri sınırlayıcı, örneğin aday gen (hit) seçimi, rafine etmek için kullanılabilir. Hit seçmek için seçilen hassas bir yöntem ekranın türüne ve tam olarak okuma-out bağlıdır. Bir sayısal genom ekranı üretilen verinin karmaşıklığı göz önüne alındığında, bir istatistikçi ile birlikte gerekli olabilir.

Biz tarif protokol kolayca testlerin diğer türleri adapte edilebilir. Örneğin, enfeksiyon adımında D. coniospora Katı ortam üzerine enfekte etme yeteneğine sahip herhangi bir diğer patojen tarafından değiştirilebilir. Biz sıvı kültüründe Serratia enfeksiyon için önemli virülans faktörleri birçok katı ortamda (E. Pradel, kişisel iletişim) üzerinde enfeksiyon sırasında bir rolü olmadığını fark ettiğiniz gibi bu potansiyel olarak yararlıdır. Protokol aynı zamanda kimyasal bileşiklerin testleri ile tam uyumlu ^22-24 Veya bakteri, farklı kitaplıklarını kullanma biyoaktivitesi olan bileşikler teşhis ²⁵, Bu yüzden genel bir yardımcı bulmalısınız C. elegans Araştırma topluluğu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BactoAgar	BD Diagnostic Systems	214010
Ampisilin	Sigma-Aldrich	A9518
BactoPeptone	BD Diagnostic Systems	211677
CaCI2	Herhangi bir tedarikçi
AeraSeal yapışkan film	Dutscher	760214
İzopropil β-D-Thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Scientific	AB-0481
K 2 HPO 4	Herhangi bir tedarikçi
KH 2 PO 4	Herhangi bir tedarikçi
MgSO 4	Herhangi bir tedarikçi
NaCl	Herhangi bir tedarikçi
Na 2 HPO 4	Herhangi bir tedarikçi
NaOH	Herhangi bir tedarikçi
96 derin kuyu plaka	Thermo Scientific	AB-0932
96 sıra düz plaka	FALCON	353072
96 yuvarlak plakanın	FALCON	353077
Tetrasiklin	Sigma-Aldrich	T8032
Triton X-100	Herhangi bir tedarikçi
Tecan robot	Tecan
Liquidator96 TM	Rainin
Copas Biosort	Birlik Biometrica
LIMS	Modul-Bio