ניתוח Stereotaxic על הנגע Excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים עכברוש למבוגרים בלבד

Summary

אבלציה ממוקד באזור ספציפי במוח (ים) על ידי עירוי של excitotoxin באמצעות קואורדינטות stereotaxic מתואר. טכניקה זו יכולה גם להיות מותאם עבור עירוי של כימיקלים אחרים במוח חולדה.

Abstract

התנהגות פונקציות רבות, כולל יונקים מכרסמים ובני אדם, מתווכים על ידי אזורים במוח בעיקר בדידות. השיטה הנפוצה לתפקוד הבחנה של אזורים במוח השונים להתנהגות או תוצאות ניסויים אחרים היא ליישם אבלציה מקומי של הפונקציה. אצל בני אדם, אוכלוסיות חולים עם נגעים במוח מקומיים נלמדים לעתים קרובות חסרים, בתקווה לחשוף את הפונקציה הבסיסית של האזור הפגוע. במכרסמים, אפשר לגרום באופן ניסיוני נגעים של אזורי מוח ספציפיים.

הנגע יכול להתבצע במספר דרכים. נגעים אלקטרוליטי יכול לגרום לנזק מקומי, אך יפגע מגוון רחב של סוגי תאים, כמו גם סיבים חוצים מאזורי מוח אחרים שקורים להיות סמוך למקום הפגיעה. מושרה טכניקות גנטיות באמצעות תאים מסוג יזמים מסוימים עשויה גם לאפשר לאתר ספציפי מיקוד. טכניקות אלו הם מורכבים ולא תמיד מעשי בהתאם לאזור המוח היעד. Excitotהנגע oxic באמצעות ניתוח stereotaxic, לעומת זאת, היא אחת השיטות הכי אמין ומעשי של lesioning נוירונים מעוררים מבלי לפגוע בתאי גלייה מקומיים או חוצים סיבים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עירוי stereotaxic של excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), לתוך מתחם האמיגדלה basolateral. באמצעות סימנים אנטומיים, אנחנו מיישמים את הקואורדינטות stereotaxic כדי לקבוע את המיקום של אזור היעד שלנו במוח ולהפחית את מחט הזריקה במקום מעל היעד. לאחר מכן להחדיר excitotoxin שלנו לתוך המוח, וכתוצאה מכך למוות excitotoxic של נוירונים סמוכים. בעוד נושא ניסיוני הבחירה שלנו הוא עכברוש, שיטות אותם ניתן להחיל על יונקים אחרים, עם ההתאמות המתאימות ציוד קואורדינטות.

בשיטה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של אזורים במוח, כולל האמיגדלה basolateral ^1-6, שני גרעיני השקד ^{6, 7, 8} ההיפוקמפוס, אף אוזן גרוןorhinal קליפת המוח קליפת המוח הקדם חזיתית ⁹ ו ^10. זה יכול לשמש גם כדי להחדיר תרכובות ביולוגיות כגון וקטורים ויראליים ^{1, 11.} הטכניקה הבסיסית stereotaxic יכול גם להיות מותאם יותר להשתלה של משאבות האוסמוטי קבועים, מה שמאפשר חשיפה ממושכת יותר למתחם של עניין.

Protocol

הרדמה שיכוך כאבים: חצי שעה לפני הרדמה, להזריק עכברוש עם 0.05 מ"ג / ק"ג תת עורית עצירות של שיכוך כאבים. ליזום הרדמה עם נתרן מ"ג / ק"ג 30-40 intraperitoneal pentobarbital. בשלב זה, גם להזריק אטרופין כדי למנוע כשל נשימתי (0.4 מ"ג / ק"ג, תת עורית) ו meloxicam כמו משכך כאבים עוד יותר (2 מ"ג / ק"ג תת עורית). אם אחרי 5 דקות, עכברוש עדיין נייד או מגיבים קמצוץ הבוהן, לתת מנות עוקבות של נתרן pentobarbital על 5 מ"ג / ק"ג (intraperitoneal) עד חולדה אינו מגיב לכאב. לפני ביצוע החתך הראשון, מזריקים לידוקאין (5 מ"ג / ק"ג, intradermal) במקום החתך של הרדמה מקומית. שש עד שמונה שעות לאחר ההזרקה הראשוני, להזריק עכברוש עם 0.05 מ"ג / ק"ג תת עורית עצירות של שיכוך כאבים. עצירות ניתן להזריק מדי 6-8 שעות לאחר מכן במידת הצורך, אם כי זה בדרך כלל לא נחוץ.

חשוב לציין כי צורות אחרות של ג הרדמהלהפריע נגעים excitotoxic. לדוגמה, אם כי קטמין היא סוג נפוץ של הרדמה במכרסמים, זה יכול להפריע נגעים המושרה עם NMDA כי הוא אנטגוניסט לרצפטור NMDA. חשוב לבחור את שיטת ההרדמה התרמה זה לא להקטין את גודל הנגע. אם הרדמה הגז הרצוי, מכשירים stereotaxic ביותר כולל אלה המתוארים כאן יכול להכיל מתאמי מסכת גז.

הערה: חומרים מפורטים יותר בטבלה של חומרים כימיים מסוימים וציוד להלן.

1. אופן ההכנה של המשאבה ואת Stereotax

1. מלא את המזרק 10 μl המילטון עם מים סטריליים ו הר אותו נושא כלים של המשאבה לתכנות 6 המזרק. להבטיח את סופו של הבוכנה מזרק לתוך מחזיק הידק על המשאבה.
2. מלא מראש את גז עיקור PE20 צינורות עם מים סטריליים באמצעות מחט המזרק 1 מ"ל. החלק את הקצה הפתוח של הצינור על המזרק המילטון, להיות טיפולפול ולהימנע מיצירת בועות אוויר בצינור.
3. הצמד 30ga, שטוח לחתוך, 1 אינץ מחט עירוי סוף צינורות על הזרוע של המכשיר stereotaxic באמצעות מניפולטור לחבית בסגנון האלקטרודה. הכנס את מחט עירוי בין מהדק ו לחבית מחורץ. להבטיח את מהדק על לצינור המכיל בתוכו מחט מתכת כדי למנוע לשטח את צינורות והגבלת זרימת הנוזל.
4. להתאים את קצב משאבת> 5 μl / דקה ולהדליק את המשאבה. טיפת מים יופיע בקצה מחט עירוי. יש לבדוק את אורך צינור והמפרקים שלה כדי לוודא שאין נזילות.
5. לנגב את המים חרוז עם ספוגית סטרילית ולהגדיר את המשאבה לסגת. לסגת בועת אוויר 2 μl. חלקו העליון של הבועה צריך להיות גלוי צינורות.
6. לטבול את קצה מחט עירוי בתמיסה 20 מ"ג / מ"ל ​​של NMDA ב סטרילית 0.1M PBS ולסגת μl 4-5. בועת אוויר צריך להיות גלוי בין מים סטריליים והפתרון NMDAבקצה. חשוב לציין כי NMDA הוא עצבי חזק זהירות יש להשתמש בהכנת וטיפול של פתרון זה. כפפות להגנה על העין, מומלץ בכל עת.

2. הר חולדה במכשיר Stereotaxic

1. איור 1 מתאר את החלקים הבסיסיים של המכשיר stereotaxic. לאחר גילוח ראשו של עכברוש מקו העיניים את האוזניים, טען השיניים הקדמיות של עכברוש על הבר ביס, עם גוף של עכברוש מונח על כרית חימום מוגדר על בינוני. הלשון צריך לתלות מתחת לשורת ביס, עם הלסת התחתונה. אם זמין, משוב הטמפרטורה כרית חימום עדיף. ניטור טמפרטורה רקטלית היה גם להיות אידיאלי.
2. מחזיק צווארו של עכברוש עם האגודל והאצבע, לעבור את תעלת האוזן הימנית אופקית על גבי סרגל באוזן ימין. בר צריך להרגיש כאילו הוא מונח על מקום יציב, לא כמו שהוא שוקע עמוק לתוך הראש. מחזיק את צד ימין של הראש יציב, החלק באוזן שמאלהבר לתוך תעלת האוזן האופקי השמאלי של החולדה. הוא צריך להרגיש כאילו הוא מונח על מקום יציב. Pinnae צריך להיראות סימטרי אמור להופיע לשכב על הסורגים אוזניים. מתרחבים כלפי מעלה של pinnae מציין מיקום לא נכון של הסורגים אוזניים. הראש לא צריך לנענע בעקבות לחץ על הצוואר.
3. לדפוק את סרגל האף. להיות עדין. עצמות האף הם עדין בר האף לא צריך להיות חזק. בדוק את החולדה הוא עדיין מורדם לפני שתמשיך.

3. הכנת עכברוש לכירורגיה

1. באמצעות ספוגית סטרילית, בעדינות לשים כמות קטנה של משחת עיניים וטרינרית סיכה בכל אחד בעיניים של עכברוש כדי להגן עליהם מפני ייבוש פסולת.
2. Concentrically מאתר את החתך המתוכנן לקצה האזור מגולח, נגבו הקרקפת של עכברוש עם פתרון כלורהקסידין 2% בעקבות אתנול 70% שלוש פעמים. שיחים כלורהקסידין עשוי לשמש גם אם חומר חיטוי יעיל יותר הוא הרצוי.סיום ידי ניגוב עם פתרון 10% יוד povidone. הקרקפת היא מוכנה עכשיו סטרילית צריך רק לגעת עם חומרים סטריליים.
3. דון כפפות סטריליות של צעדים נוספים, כי אתה תהיה הבא להתמודד עם אתר כירורגית מוכן.
4. הנח וילון סטרילי, כך אשנוב חושף את האתר כירורגית.

4. יצירת חלון כירורגי

1. באמצעות להב # 10 אזמל, לבצע חתך (כ -2 ס"מ אורך) לאורך קו האמצע האורך של הקרקפת. החתך צריך להתחיל לקו האחורי של העיניים. עם האגודל והאצבע של היד הלא דומיננטית, החזק את הקרקפת על המתח מאונך לכיוון החתך.
2. משוך את fascia שמעל פני הגולגולת לקצוות של האתר כירורגית באמצעות סטריליים טיפים כותנה. זה ייקח קצת כוח כדי לנקות את הגולגולת כך שהוא יכול לראות.
3. השתמש ארבעה עקומים, hemostats סטריליים כדי ליצור חלון כירורגית. Fascia קלאמפ (לא העור) על EAלצד פרק ההיבטים הקדמי ואת האחורי של חתך ולאחר מכן להניח את מהדק לצד בעלי חיים, ובכך למשוך את החתך פתוח לחלוטין לחשוף את הגולגולת.

5. פילוס גולגולת יצירת חור פיילוט

1. אתר גבחת, נקודת הקדמי שבו שלוש צלחות העיקריים של הגולגולת לעמוד, כפי מתואר באיור 2. להזיז את המחט אינפוזיה כך קצה המחט נוגע רק את הגולגולת על גבחת. הערה הגבי-הגחון לתאם. איור 3 מדגים כיצד לקרוא קואורדינטות במכשיר stereotaxic Stoelting. שימו לב, בשלב זה, כפפות כבר לא סטרילית ולא צריך לגעת אתר ניתוח סטרילי ישירות. הערה: לאחר מגע מכשיר stereotaxic nonsterile, המנתח הוא כבר לא סטרילית ולא צריך לגעת האתר כירורגית או חלקי ציוד אשר יגע באתר כירורגית.
2. אתר למבדה, נקודת האחורי שבו שלוש צלחות העיקריים של הגולגולת לעמוד, כמו depicteד באיור 2. הרם את מחט עירוי מעט להזיז אותה ישר למבדה. מנמיכים את המחט עד שהיא נוגעת רק את הגולגולת על למבדה. קרא את הקואורדינטות הגבי-הגחון. אם הגולגולת היא ברמה, זה יהיה בתוך 0.1 מ"מ הקריאה גבחת. אם זה עוד יותר משל זה, להעביר את המחט (מהדרך), לשחרר את סרגל האף, או להגדיל או להקטין את הפלטפורמה בר ביס, תלוי מאיזה צד של הראש הוא גבוה מדי, ולאחר מכן מחדש את המדד.
3. להזיז את המחט אינפוזיה על גבחת ולהקליט את נקודות הציון הקדמי, האחוריים ו-המדיאלי לרוחב. לחשב שם את המחט יש עבר המבוסס על נקודות הציון של אזור במוח של עניין על פי המוח אטלס ^12. עבור BLA, הפחיתו 2.8 מ"מ מ לתאם קדמית, אחורית ו או להוסיף או לגרוע 5.1 מ"מ מ / אל לתאם המדיאלי, לרוחב, תלוי אם אתה רוצה למקד שמאלה או ימינה. להזיז את המחט אינפוזיה למצב מחושב.
4. הנדנדה לביתDLE מהדרך, מקפיד לעקוב אחר שבו הוא נמצא ואז לקדוח חור כ -2 מ"מ קוטר במיקום זה באמצעות Dremel מוטו כלי עם המקדח סטרילית שיניים המצורפת. לקדוח בזהירות כאשר תרגיל שובר את הגולגולת, הוא נוטה למשוך כלפי מטה, אולי פגיעה דורה ואת רקמת המוח מתחת. לקדד את החור כדי להגדיל אותה.
5. לספוג כל הדם עם מטלית כותנה סטרילי.

6. עירוי של עצבים

1. להתנדנד חזרה המחט למצב. מנמיכים את המחט עד שהיא נוגעת את פני השטח של המוח. רשום את הקואורדינטות הגבי-הגחון. זוהי הרמה של דורה. להחסיר את הערך המתאים להגיע לאזור המוח של עניין. עבור האמיגדלה basolateral, לחסר 6.7 מ"מ.
2. מנמיכים את מחט עירוי לרמה חושב לאט. ואז להעלות אותו בחזרה למעלה, הרבה מעל הגולגולת. השתמש חוט ניקוי המילטון מזרק לפתוח סתימה קצה מחט עירוי, נזהרים שלא לאאוי סוף חוט כי בא במגע עם מחט עירוי עם לא סטריליים כפפות.
3. הפעל את המשאבה ב> 5 μl / דקה וודא שאתה רואה טיפת נוזל לצאת מחט עירוי. אם לא, unclog עם חוט ונסה שוב.
4. מנמיכים את מחט עירוי לרמה הגב / הגחון הרצוי לאט.
5. קבע את שיעור על משאבת עירוי כדי 0.1 μl / דקה ולהתחיל עירוי. להשרות במשך 2 דקות.
6. לאחר עירוי החלה, לסמן את שני הקצוות של בועת אוויר בצינור עם טוש שחור. אם הקצוות לא זז, המחט שלך סתום. לעצור את העירוי, להעלות את המחט, unclog עם חוט, לבדוק אם יש זרימה עם קצב זרימה גבוה, שוב להוריד את המחט ולנסות שוב.
7. לאחר עירוי הושלמה, לעצור את המשאבה והמתן 5 דקות על NMDA לנטרל מן קצה המחט.
8. הרם את המחט 0.5 מ"מ, ו להחדיר שוב דקות 1. לחכות 2.5 דקות עבור NMDA לנטרל מן קצה המחט. זה עירוי נוסף הואתקליטים להבטיח את כל BLA מכוסה על ידי עירוי. אם זה הכרחי אזורי מוח אחרים חייבים לקבוע באופן ניסיוני.
9. תרים את המחט של המוח לאט להניף את היד stereotaxic מהדרך.

7. סגירת החתך

1. דון כפפות סטריליות חדשים לסגור את החתך.
2. למחות את כל הדם העודף על הגולגולת עם קצות כותנה סטריליים ולהסיר את מהדק מ fascia.
3. באמצעות מלקחיים לונדון, לדחוף את שני הצדדים של החתך יחד. הקצוות הפנימיים של העור צריך לפגוש את הקצה החיצוני של העור אין לאפשר להתכרבל לתוך החתך. תוך כדי הקשה על החתך נסגר, להחיל קליפים הפצע כדי לסגור את הבליטה היטב. ממשיכים לדחוף את העור יחד מצרך לאורך החתך. זה בדרך כלל לוקח 3-5 קליפים הפצע.
4. לאחר ביצוע כל קטעי הפצע, להשתמש במלקחיים כדי לצבוט את סיכות שוב, כדי לוודא שהם בטוחים. לא בטוח יותרהוא קליפים, חולדה פחות ימשוך אותם לפני החתך נרפא.
5. ספוגית חתך מהודקים עם פתרון 10% povidone יוד ולחזור הביתה חולדה לכלוב שלו עד צג ניידות משוחזר (בדרך כלל 1-2 שעות לאחר הרדמה, בזמן ניתוח הכולל אינדוקציה לסגירת להיות 30-45 דקות). בשלב זה, עכברוש ניתן להחזיר לחדר המושבה. לאחר שבוע, להסיר סיכות עם כלי מסיר מצרך בהרדמה isoflurane.
6. השתמש מעקר חרוז חם לעקר את פני השטח של קצה כל המכשירים לפני השימוש ב עכברוש הבא. מכשירים יש שקוע החרוזים לא יותר מ -15 שניות, או שהם עשויים להיות חם מדי לטפל. המכשירים צריכים להיות מקורר באופן מלא לפני המשמש בעל חיים אחר.

8. התאוששות

1. יתכן כי חולדות יפגינו פעילות של התקפים בימים שלאחר פגיעה. בהתאם לאזור המוח הפגועים, התנהגויות אחרות כגון צריכת מזון או Grooming עלולה להיפגע. חשוב להיות במעקב בעלי חיים על בסיס יומי כדי להבטיח שהם יישארו בריאים במהלך ההתאוששות. טיפול תומך, כגון מזון נוזלי, עתיר קלוריות, מזון, או כאבים נוספים על פי הצורך. תמותה עקב הרדמה מתרחשת באחוז נמוך של חולדות, בדרך כלל פחות מ -5%. התמותה בשל סיבות אחרות (זיהום, דימום) הוא נדיר ביותר. סימנים של מצוקה לאחר התאוששות של ההרדמה ניתן לגרום לאי הכללה של מחקרים עתידיים, אך הם נדירים ביותר. איור 4 מתאר את הירידה במשקל במהלך הימים הראשונים לאחר הניתוח כפי שהוא אמור להיות צפוי. משקל הגוף צריך להתאושש בתוך שבוע 1.

9. נציג תוצאות

שבוע או יותר לאחר עירוי NMDA, הנגע ניתן דמיינו באמצעות cresyl סגול counterstain מיקרוסקופית brightfield. המוח צריך להיות perfused עם paraformaldehyde קרח קר 4%, equilibrated ב סוכרוז 30% ב 0.1M PBS ו frozen. הם אמור להיות פרוס על 30-60 מיקרומטר, בסדרה של 1:06-1:12 ועלה על ג'לטין מצופים שקופיות הזכוכית לפני שעברו counterstain תקן סגול cresyl. הנגע צריך מתאימות "קרחת", או על שטח של סגול cresyl ירד כתם בשל מוות של תאים לאחר פגיעה. איורים 5 א 'וב' להראות הנגע נציג BLA ו-CEA. תמונה זו הושגה באמצעות וסורק עם סריקה ברזולוציה גבוהה (1200 dpi). כדי להמחיש את הנגע, זה עוזר counterstain סדרה של קטעי דרך יותר של הרקמה המקיפה את אזור היעד כך הנגע במקומה יכול להיות ממוקם.

באיור 1. ההתקנה Stereotaxic. נתון זה מראה את stereotaxic עכברוש עם החלקים הרלוונטיים המסומנים.

איור 2. גבחת ו למבדה על מק עכברושLL. איור זה מתאר את מיקומם של גבחת ו למבדה. מרכז את כל נמדדות ביחס גבחת. Lambda משמש על מנת להבטיח כי הגולגולת הוא ברמה.

איור 3. קריאה קואורדינטות stereotaxic. ציור זה מתאר קריאה stereotaxic סטנדרטי. כדי להשיג את הספרות בצד שמאל של הנקודה העשרונית, השתמש סמנים בצד ימין. ספרות שכותרתו מתאים למקום עשרות (כלומר 1 = 10, 2 = 20). סימני חשיש בין ספרות שכותרתו מתאימות יחידות בודדות (1-9). קו אפס מצביעה על מה שלם stereotax מוגדר. כאן, בקו אפס הוא בין 10 ו -11 סמנים, המציין כי הקריאה היא בין 10 ל 11. כדי לקבוע את המספרים בצד ימין של הנקודה העשרונית, השתמש סמנים בצד שמאל. סימני חשיש בצד שמאל ממוספרים 0-10, עם חשיש זה ללא התווית מייצג הבדל אחד יחידת מאלה לידו. לפי הסימנים חשיש על הקווים שמאלה בצורה הטובה ביותר עם סימני חשיש בצד ימין מציין את המקום העשרונית 1 הקריאה לתאם. כאן, סימן חשיש על המקבילה שמאל למספר 9 שורות הכי טוב עם העכבר הימני לוואי סימני חשיש אז במקום העשרוני הוא 9. הקריאה הסופית הוא 10.9 מ"מ.

באיור 4. שינוי במשקל לאחר הניתוח. גרף זה מציג את המשקל הממוצע (± SEM) של חולדות שעברו ניתוח stereotaxic (n = 17) או לא לעבור ניתוח (n = 6). יום 0 הוא היום של הניתוח. בעקבות הניתוח, המשקל של חולדות ירד במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח ולאחר מכן גדל סביב יום 5-6.

איור 5. למשל הנגע Excitotoxic.) תמונה זו מראה סגול cresyl counterstain על פרוסת העטרה 30 מיקרומטר עם "קירחבמקום "מן הנגע NMDA של האמיגדלה basolateral. החצים הלבנים מתאר את הנגע. זה ניתן להשוות את הצד הנגדי של הפרוסה המוח שאין לו הנגע. ב ') פגיעה דומה של הגרעין המרכזי באמיגדלה.

Discussion

שיטת stereotaxic המוצג כאן מאפשר הנגע excitotoxic של אזורי מוח ספציפיים באמצעות עירוי של NMDA. השיטות הבסיסיות stereotaxic ניתן להתאים להזרים מגוון של סוכני תרופתי וביולוגי באופן ספציפי באתר. זה גם יכול להיות מותאם למקד מגוון של אזורים במוח, מוגדר על ידי הקואורדינטות stereotaxic שלהם במוח א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
N-Methyl-D-חומצה אספרטית 98%	פישר סיינטיפיק	AC32919-0500
Dual מעבדה רגיל Stereotaxic w/45 מעלות. אוזניים ברים	Stoelting	51653	ספק אלטרנטיבי: קופף * הערה אזהרה: מבטיחה תאימות של אביזרים stereotaxic אם לרכוש מיצרנים מרובים
10μl SYR מיוחד (* / * / *)	המילטון	701SN
Dremel Moto-Tool	Stoelting	58600	ספק אלטרנטיבי: קופף
קרביד burs, handpiece HP, גודל 2	שיין שיניים	2284578
Stoelting 6 תוכנית מזרקמייבל משאבה	Stoelting	53140	ספק אלטרנטיבי: קופף
נירוסטה 316 וול רגיל המזרק Tubing 30 מד .0123 "עוד X 0.00625" מזהה x .003 "הכותל (מחט עירוי)	חלקים קטנים	HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 צינורות (צינורות עירוי)	VWR	63019-025
קליפים רפלקס, 9 מ"מ, לא סטרילית	קנט מדעי קורפ	INS500346	ספק אלטרנטיבי: כלי מדעי יפות
קליפ Applier רפלקס עבור קליפים 9 מ"מ	קנט מדעי קורפ	12031-09	ספק אלטרנטיבי: כלי מדעי יפות
Hemostat מעוקל הרטמן	מדע כלים עדינים	13003-10
לונדון מלקחיים	Sceince כלי פיין	11080-02
כלורהקסידין 2% הפתרון	Allivet	30159	ספק אלטרנטיבי: PetSolutions
10% יוד povidone פתרון	CVS	SKU # 739575
חם חרוז מעקר	הרווארד Apparatus	610183