Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Özet

Stereotaksik koordinatları kullanarak excitotoxin infüzyonu ile belirli beyin bölgesinin Hedefli ablasyonu (ler) tarif edilir. Bu teknik aynı zamanda sıçan beyin içine diğer kimyasalların infüzyon için adapte edilebilir.

Özet

Kemirgenler ve insan da dahil memelilerin, birçok davranışsal işlevleri farklı beyin bölgeleri tarafından esas olarak aracılık eder. Davranış veya diğer deney sonuçları için çeşitli beyin bölgelerinin seçici fonksiyonu için ortak bir yöntem işlevi yerelleştirilmiş bir ablasyon uygulamaktır. İnsanlarda, lokalize beyin lezyonları olan hasta popülasyonları genellikle hasarlı bölgenin temel işlev ortaya umuduyla, açıkları için incelenmiştir. Kemirgenler, bir deneysel spesifik beyin bölgelerinde lezyonlar uyarabilir.

Lezyon çeşitli yollardan gerçekleştirilebilir. Elektrolitik lezyonlar lokalize hasara neden olabilir ancak bir hücre tiplerinin çeşitliliği yanı sıra lezyon alanının yakınında olmak olur diğer beyin bölgelerinden geçme lifleri zarar verecektir. Hücre tipine özgü arttırıcılar genetik teknikler de siteye özel hedefleme sağlayabilir İndüklenebilir. Bu teknikler hedef beyin alanına bağlı olarak karmaşık ve her zaman pratik değildir. Excitotstereotaksik cerrahi kullanarak oksik lezyon aksine, yerel glial hücrelere zarar veya liflerini geçme olmadan eksitatör nöronlar lezyon en güvenilir ve pratik yöntemlerden biridir.

Burada, excitotoxin, bazolateral amigdala kompleksi içine N-metil-D-aspartat (NMDA), stereotaksik infüzyon için bir protokol mevcut. Anatomik işaretler kullanarak, bizim hedef beyin bölgesi konumunu belirlemek ve sadece hedefin üzerinde yerde bir enjeksiyon iğnesi düşürmek için stereotaksik koordinatları geçerlidir. Daha sonra yakındaki nöronların eksitotoksik ölümle sonuçlanan, beyin içine bizim excitotoxin süzülür. Tercih edilen deneysel bizim konusu bir sıçan olmasına rağmen, aynı yöntem ve cihaz koordinatlarında uygun ayarlamalar ile, diğer memeliler için uygulanabilir.

Bu yöntem, bazolateral amigdala ^1-6, diğer amigdala çekirdekler ^{6, 7, 8} hipokampus, ent dahil olmak üzere, beyin bölgelerinde çeşitli kullanılabilmektedirorhinal korteks ⁹ ve prefrontal korteks ^10. Ayrıca, bu tür viral vektörler ^{1, 11} gibi biyolojik bileşikler aşılamak için kullanılabilir. Temel stereotaksik teknik de ilgi ait bir bileşik için daha uzun süreli maruz izin veren, daha kalıcı bir ozmotik pompa implantasyon için adapte edilmiş olabilir.

Protokol

Anestezi ve analjezi: öncesi anestezi Otuz dakika, analjezi için 0.05 mg / kg subkutan buprenorfin ile sıçan enjekte. 30-40 mg / kg intraperitoneal sodyum pentobarbital ile anestezi başlatın. Bu noktada, aynı zamanda (2 mg / kg deri altı) başka analjezik olarak solunum yetmezliği (0.4 mg / kg, deri altı) ve meloksikam önlemek için atropin enjekte edilir. 5 dakika sonra, sıçan hala mobil veya ayak tutam yanıt ise sıçan ağrı yanıt alınamayan mg / kg (periton) kadar, 5, sodyum pentobarbital sonraki dozlar vermek. Ilk kesi yapmadan önce, lokal anestezi için insizyon yerinde lidokain (5 mg / kg, intradermal) enjekte edilir. Altı ila sekiz saat ilk enjeksiyondan sonra, analjezi için 0.05 mg / kg subkutan buprenorfin ile sıçan enjekte. Gerekirse bu genellikle gerekli değildir ancak Buprenorfin, bundan sonra her 6-8 saatte bir enjekte edilebilir.

Bu not etmek önemli olduğunu anestezi c diğer formlarıBir eksitotoksik lezyonlar müdahale. Ketamin kemirgenlerde anestezi yaygın olarak kullanılan bir formu olmasına rağmen bir NMDA reseptör antagonisti olduğu için örneğin, bu NMDA ile indüklenen lezyonları ile karışabilir. Bu lezyon boyutunu azaltmaz uyaran anestezi yöntemi seçmek önemlidir. Gaz anestezi isteniyorsa, burada açıklanan dahil en stereotaksik cihazları gaz maskesi adaptörleri ağırlayacak.

Not: Malzeme spesifik reaktifler ve aşağıda ekipmanın Tablo de tarif edilmektedir.

1. Pompa ve Stereotax hazırlanması

1. Steril su ile 10 ul Hamilton enjektörü ile doldurun ve 6 şırınga programlanabilir pompa caddy içine monte edin. Pompa kenetlenmiş tutucu içine şırınga pistonu sonunda sabitlemek.
2. Önceden doldurunuz bir iğne ve 1 ml şırınga kullanarak steril su ile PE20 tüp gaz sterilize. Bakımı olarak, Hamilton şırınga ile ilgili tüp açık ucuna kaydıraraktüp içinde hava kabarcıkları oluşmayacak şekilde ful.
3. Bir varil tarzı elektrot manipülatör kullanılarak bir stereotaksik cihazın kolu üzerine hortumun 30ga, düz kesim, 1 inç infüzyon iğnesi sonuna mandal. Kelepçe ve yivli namlu arasındaki infüzyon iğnesi takın. Tüp düzleşme ve sıvı akışını kısıtlayan önlemek için içindeki metal iğne içeren boru parçası üzerinde kelepçe sabitleyin.
4. > 5 ul / dak pompa hızı ayarlayın ve pompa açın. Su bir boncuk infüzyon iğnesi ucunda görünmelidir. Sızıntı olmadığından emin olmak için boru ve eklem uzunluğu kontrol edin.
5. Steril bir bez ile boncuk su uzak silin ve çekme pompası ayarlayın. 2 ul hava kabarcığı geri çekin. Balonun üst boru görünür olmalıdır.
6. Steril 0.1M PBS içinde NMDA bir 20 mg / ml çözelti içinde infüzyon iğne ucu tutulur ve 4-5 ul çekilmesi. Bir hava kabarcığı steril su ve NMDA çözüm arasında görünür olmalıdırucu. Bu NMDA güçlü bir nörotoksin ve dikkatli bu çözümün hazırlanması ve taşıma esnasında kullanılması gerektiğini dikkate almak önemlidir. Eldiven ve göz koruması her zaman tavsiye edilir.

2. Steryotaksik bir cihazla Sıçan monte

1. Şekil 1 steryotaksik bir cihazla bir bazik parça tasvir etmektedir. Kulakları, gözleri hattından sıçan başını tıraş sonra, sıçan vücudu orta ayarlanmış bir ısıtma yastığı üzerine oturtulmuş, snack bar üzerinde farenin ön dişler yükleyin. Dil alt çene ile, ısırık çubuğunun altında asmak gerekir. Varsa, bir sıcaklık geri ısıtma pedi tercih olacaktır. Rektal ısı takibi de ideal olacaktır.
2. Başparmak ve işaret parmağı ile sıçan boynuna Holding, sağ kulak çubuğu üzerine sağ yatay kulak taşıyın. Bu sağlam bir yer üzerine yerleşmiştir gibi bar hissetmeniz gerekir, o kadar kafa içine battı gibi değil. Kafasının sağ tarafına tutarak kararlı, sol kulak kaydırınfarenin sol yatay kulak yoluna bar. Bu sağlam bir yer üzerine yerleşmiştir gibi hissetmeniz gerekir. Pinnae simetrik görünmelidir ve kulak çubukları düz yalan görünmelidir. Yukarı doğru pinnae ve ışıl ışıl kulak çubukları uygunsuz yerleştirilmesi gösterir. Kafa boynu basınç yanıt olarak yalpalamasına olmamalıdır.
3. Burun çubuğu aşağı çevirin. Nazik olun. Burun kemikleri hassas ve burun çubuğu sıkı olması gerekmez. Rat geçmeden önce halen anestezi olup olmadığını kontrol edin.

3. Cerrahi Rat hazırlanması

1. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak, hafifçe kurutma ve enkaz onları korumak sıçan gözlerinin her birine veteriner oftalmik yağlama merhem küçük bir miktar koyun.
2. Konsantrik traş bölgenin kenarına planlanan insizyon sitesinden,% 2 klorheksidin solüsyonu ile farenin derisi silin% 70 etanol üç kez izledi. Daha etkili bir dezenfeksiyon isteniyorsa Klorheksidin fırçalama da kullanılabilir.% 10 povidon iyot çözeltisi ile silerek bitirin. Hazırlanan saçlı deri artık steril ve steril malzemeler ile temas edilmelidir.
3. Ileri adımlar için Don steril eldiven bir sonraki hazırlanmış cerrahi bölge ile ilgileneceğiz çünkü.
4. Fenestrasyon cerrahi bölge ortaya böylece steril bir örtü koyun.

4. Cerrahi Pencere Oluşturma

1. Bir # 10 neşter bıçak kullanarak, kafa derisinin uzunlamasına orta hat boyunca bir kesi (uzunluğu yaklaşık 2 cm) olun. Kesi göz hattına posterior başlamalıdır. Başparmak ve non-dominant elin işaret parmağı ile, kesi yönüne gerginlik dik saçlı deri tutun.
2. Steril pamuk ipuçlarını kullanarak cerrahi alan kenarlarına kafatası yüzeyini kaplayan fasya çekin. Onu görülebilir böylece kafatasına temizlemek için biraz güç alacaktır.
3. Cerrahi bir pencere oluşturmak için dört eğri, steril hemostat kullanın. Ea üzerine Kelepçe fasya (NOT cilt)sonra ch insizyon anterior ve posterior yönlerini yan ve böylece açık kesi çekerek ve tam kafatası açığa hayvan yanında kelepçeler yatıyordu.

5.. Skull mastarlanıp Pilot Delik oluşturma

1. Bregma, Şekil 2'de gösterildiği gibi kafatasının üç ana tabak, karşılamak ön noktasını bulun. Iğne ucu sadece bregma at kafatası dokunur böylece infüzyon iğnesi taşıyın. Dorsal-ventral koordinat. Şekil 3 Stoelting stereotaksik cihaza koordinatları nasıl okunacağını gösterir unutmayın. Not, bu noktada, eldiven artık steril ve doğrudan steril cerrahi alan temas etmemelidir. Not: steril olmayan stereotaksik cihaza dokunduktan sonra, cerrah artık steril ve cerrahi alan ne de cerrahi alan dokunacak cihaz parçaları temas etmemelidir.
2. Depicte olarak lambda, kafatasının üç ana tabak karşılamak posterior noktası bulunŞekil 2, d. Biraz infüzyon iğnesi kaldırın ve düz geri lambda taşıyın. Sadece lambda at kafatası dokunana kadar iğne indirin. Dorsal-ventral koordinat okuyun. Kafatası seviyesi ise, bregma okuma 0,1 mm içinde olacaktır. Daha da kapalı bu fazla ise, (çıkış yolu) iğne yukarı taşımak, yeniden tedbir sonra burun çubuğu gevşetin ya snack bar platformu yükseltmek ya da düşürmek, hangi kafa sonu çok yüksek olduğuna bağlı olarak, ve.
3. Bregma üzerine infüzyon iğnesi taşı ve ön-arka ve medial-lateral koordinatları kaydedin. Iğne bir beyin atlası ¹² göre ilgi beyin bölgesinin koordinatlarına göre hareket edilmelidir nerede hesaplayın. BLA için, ön-arka koordinat 2.8 mm çıkarma ve ya ekleyebilir ya da sağ veya sol hedeflemek isteyip istemediğinize bağlı olarak medial-lateral koordinat / den 5.1 mm çıkarın. Hesaplanan konumuna infüzyon iğnesi taşıyın.
4. Nee salıncaklarbu yer nerede izlemek ve sonra bağlı steril bir diş matkap ile Dremel moto-aracını kullanarak bu konumda çapında bir delik yaklaşık 2 mm çapında özen, yolumdan DLE. Matkap kafatası yoluyla kırıldığında dikkatle Matkap, muhtemelen dura ve altındaki beyin dokusunda hasar aşağı çekme eğiliminde olacaktır. Büyütmek için delik delmek.
5. Steril bir pamuklu çubuk ile herhangi bir kan emerler.

6. Nörotoksinin İnfüzyon

1. Iğne geri konumuna Swing. O beyin yüzeyine temas edene kadar iğne indirin. Dorsal-ventral koordinat kaydedin. Bu dura seviyesidir. Ilgi beyin bölgesi ulaşmak için uygun Değ.Çıkar. Bazolateral amigdala, 6.7 mm çıkarın.
2. Yavaş hesaplanan seviyesine infüzyon iğne düşük olur. Sonra sıra kafatası üzerinde, o kadar geri kaldırın. Dikkatli olmayan t olmak, infüzyon iğne ucu unclog bir Hamilton enjektörü temizlik tel kullanınnon-steril eldiven ile infüzyon iğnesi ile temas tel sonunda ah.
3. > 5 ul / dak pompa çalıştırmak ve infüzyon iğnesi çıkan sıvı bir boncuk görmek emin olun. Değilse, tel ile unclog ve tekrar deneyin.
4. Yavaş yavaş istenilen ventral / dorsal seviyesine infüzyon iğnesi indirin.
5. 0.1 ul / dk infüzyon pompası hızını ayarlayın ve infüzyon başlar. 2 dakika demlenmeye.
6. Infüzyon başladıktan sonra, siyah bir kalem ile tüpün içinde hava kabarcığı iki ucu işaretleyin. Iki ucu hareket etmiyorsanız, sizin iğne tıkalı. Infüzyon Dur, tel ile unclog, iğneyi, yeniden düşük iğne, yüksek bir debi ile akış kontrol edin ve tekrar deneyin.
7. Infüzyon tamamlandıktan sonra, pompayı durdurun ve iğne ucu uzak yayılmaya NMDA için 5 dakika bekleyin.
8. Iğne 0,5 mm kaldırın ve 1 dakika için tekrar süzülür. Iğne ucu uzak yayılmaya NMDA için 2,5 dakika bekleyin. Bu ekstra infüzyon olps BLA tüm infüzyon kapsamında olduğundan emin olun. Bu, diğer beyin bölgeleri için gerekli olup olmadığını deneysel olarak belirlenmiştir gerekir.
9. Yavaş yavaş beynin iğne dışarı kaldırın ve yol stereotaksik kolu dışarı salıncak.

7. Kesi Kapanış

1. Don yeni steril eldiven insizyon kapatmak için.
2. Steril pamuk uçlu kafatası üzerinde herhangi bir aşırı kan dindiriniz ve şerit gelen kelepçeleri sökün.
3. Londra forseps kullanarak birlikte insizyon iki tarafı itin. Cildin iç kenarları yerine getirmeli ve cildin dış kenarı kesi içine kıvrılmasına izin verilmemelidir. Kesi basarak kapalı iken, sıkıca çıkıntı kapatmak için yara klipleri geçerlidir. Insizyon uzunluğu boyunca birlikte deri ve elyaf itmeye devam edin. Bu genellikle 3-5 yara klipleri alır.
4. Tüm yara klipleri yerleştirdikten sonra, Güvenli olduklarından emin olun, yine zımba sıkıştırmamaya forseps kullanabilir. Daha güvenli to klipler kesi iyileştikten önce, daha az muhtemel bir sıçan onları çeker.
5. Swab% 10 povidon iyot çözeltisi ve mobilite (genellikle 1-2 saat sonra anestezi, indüksiyon 30-45 dakika olmak kapatılması için toplam ameliyat süresi) geri gelene kadar onun ev kafes ve monitöre sıçan dönmek ile zımbalanmış kesi. Bu noktada, sıçan koloni odasında döndürülebilir. Bir hafta sonra, izofluran anestezisi altında bir zımba teli sökücü aracı ile zımba kaldırın.
6. Sonraki sıçan kullanımdan önce bütün aletlerin uç yüzeyleri sterilize etmek için sıcak bir boncuk sterilizatör kullanın. Araçlar artık daha 15 saniye boncuk dalmış olmalıdır, ya da işlemek için çok sıcak olabilir. Başka bir hayvan üzerinde kullanılan önce Aletleri tamamen soğutulması gerekmektedir.

8. Kurtarma

1. Bu fareler lezyon takip eden günlerde nöbet aktivitesi gösteren olasıdır. Beyin bölgeye gıda tüketimi veya Gro gibi hasarlı, diğer davranışlar bağlıoming etkilenebilir. Bu hayvanların kurtarma sırasında sağlıklı kalmasını sağlamak için bir günlük olarak takip edilmesi önemlidir. Gibi sıvı gıda, yüksek kalorili gıda veya ek analjezi olarak destekleyici tedavi gerekebilir. Anesteziye bağlı ölüm% 5 genellikle daha az sıçanlarda, bir düşük oranda görülür. Diğer nedenlere bağlı mortalite (enfeksiyon, kanama) son derece nadirdir. Anestezi iyileşme sonrası stres belirtilerini Gelecekteki çalışmaların dışlanması için neden, ama son derece nadirdir. O beklenmelidir Şekil 4 ameliyat sonrası ilk birkaç gün içinde kilo kaybı gösteriyor olabilir. Vücut ağırlığı 1 hafta içinde toparlanma gerekir.

9. Temsilcisi Sonuçlar

Bir hafta veya daha fazla NMDA infüzyondan sonra, lezyon bir cresyl-mor counterstain ve aydınlık mikroskopi kullanılarak görüntülenebilmekte. Brains 0.1M PBS ve froz% 30 sukroz dengelenmiş buz% 4 paraformaldehit ile perfüze edilmelidirtr. Daha sonra 1:06-01:12 bir dizi, 30-60 mikron dilimlenmiş ve standart bir cresyl menekşe counterstain geçmeden önce, jelatin kaplı cam üzerine monte edilmelidir. Lezyon bir "kel bir nokta" ya da lezyonun ardından hücre ölümü nedeniyle leke düşmüştür cresyl mor bir alana karşılık gelmelidir. Şekil 5A ve B BLA ve CEA temsilcisi lezyon göstermektedir. Bu görüntü, yüksek çözünürlüklü tarama (1200 dpi) ile yatay bir tarayıcı kullanılarak elde edilmiştir. Lezyon canlandırmak için bir yersiz lezyon bulunan böylece hedef alan çevreleyen dokuya çok yoluyla bir seri bölüme counterstain yardımcı olur.

Şekil 1.. Stereotaksik kurulum. Bu rakam etiketli ilgili kısımları ile sıçan stereotaksik gösterir.

Şekil 2. Sıçan sku üzerine bregma ve lambdall. Bu resimde bregma ve lambda yerleri gösteriyor. Bütün koordinatlar bregma göre ölçülür. Lambda kafatası düzeyde olmasını sağlamak için kullanılır.

Şekil 3. Stereotaksik koordinatları okuma. Bu çizim standart bir stereotaksik okuma resmediyor. Ondalık solundaki rakam elde etmek için, sağ tarafta işaretleri kullanabilirsiniz. Etiketli haneli onlarca yerde (= 10, 2 = 20 yani 1) karşılık gelir. Etiketli rakamları arasında karma işaretleri tek ünite (1-9) karşılık gelir. Sıfır çizgisi stereotax ayarlanır ne tamsayı de gösterir. Burada, sıfır hattı okuma 10 ile 11 arasında olduğunu gösteren, 10 ve 11 belirteçler arasındadır. Ondalık basamak sağında numaraları belirlemek için, sol tarafta işaretleri kullanabilirsiniz. Soldaki karma işaretlerinden bir birim farkı temsil eden her etiketsiz karma ile, 0 ile 10 numaralandırılırbu o gelecek. Sağdaki karma işaretleri ile en iyi yukarı sol hatlarında karma işaretleri hangisi koordinat okuma ilk ondalık basamak gösterir. İşte, sayı sağ tarafında karma işaretleri ile en iyi en fazla 9 hatları için sol karşılık üzerinde karma işareti ondalık 9 yani. Son okumada 10,9 mm'dir.

Şekil 4. Ameliyattan sonra kilo değişikliği. Bu grafik stereotaksik cerrahi uygulanan ratlar (n = 17) ortalama (± SEM) ağırlığı gösterir veya (n = 6) ameliyat yoktu. Gün 0 ameliyat günüdür. Ameliyatından sonra, sıçan ağırlığı cerrahiden sonra 2-3 gün süreyle azalmış ve daha sonra günde yaklaşık 5-6 artmıştır.

Şekil 5. Eksitotoksik lezyon örneği. A) Bu görüntü bir cresyl menekşe "kel ile 30 mikron koronal dilim counterstain gösterirbazolateral amigdala NMDA lezyondan nokta ". beyaz oklar lezyon özetlemektedir. Hiçbir lezyon merkezi çekirdeğin amigdala. B) benzer bir lezyon olan beyin dilim karşı tarafa göre olabilir.

Tartışmalar

Burada sunulan stereotaksik yöntemle NMDA infüzyon ile spesifik beyin alanlarının eksitotoksik lezyon sağlar. Temel stereotaksik yöntemler bir yere-özgü bir şekilde farmakolojik ve biyolojik ajanları çok çeşitli aşılamak için adapte edilebilir. Aynı zamanda, bir beyin Atlas ¹² kendi koordinat tarafından tanımlanan stereotaksik beyin bölgesi, çeşitli hedeflemek için adapte edilebilir. Fareler gibi diğer türler uyum küçük hayvan için yapılmış benzeri ekipman ile yapılabilir. Mev...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
N-Metil-D-aspartik asit% 98	Fisher Scientific	AC32919-0500
Çift Lab Standart Stereotaksik w/45 deg. Kulak Çubukları	Stoelting	51653	Alternatif tedarikçi: Kopf uyarı * not: birden çok tedarikçiden satın eğer stereotaksik aksesuar uyumu temin
10μl SYR ÖZEL (* / * / *)	Hamilton	701SN
Dremel Moto-Aracı	Stoelting	58600	Alternatif tedarikçi: Kopf
Karbid aletleri, Handpiece HP, boyutu 2	Schein Diş	2284578
6 Şırınga Programı Stoeltingsinyalini okuyun Pompa	Stoelting	53140	Alternatif tedarikçi: Kopf
Paslanmaz Çelik 316 Hipodermik Düzenli Duvar Boru 30 Gauge 0,0123 "OD x 0,00625" ID x .003 "Duvar (infüzyon iğnesi)	Küçük Parçalar	HTXX-30R-06-05
Intramedic PE 20 boruları (infüzyon boru)	VWR	63019-025
Refleks Klipler, 9mm, steril olmayan	Kent Bilimsel Corp	INS500346	Alternatif tedarikçi: Güzel Bilim Araçları
9mm klipler için Refleks Klip tabancasına	Kent Bilimsel Corp	12031-09	Alternatif tedarikçi: Güzel Bilim Araçları
Kavisli Hartman hemostat	Güzel Bilim Araçları	13003-10
Londra forseps	Güzel Sceince Araçları	11080-02
% 2 klorheksidin solüsyonu	Allivet	30159	Alternatif tedarikçi: PetSolutions
% 10 povidon iyot çözeltisi	CVS	SKU # 739575
Sıcak boncuk sterilizatör	Harvard Apparatus	610183