Стереотаксической хирургии эксайтотоксичного Поражение конкретных областей мозга в взрослых крыс

Резюме

Целевые удаление конкретного региона мозга (ы), вливание excitotoxin использованием стереотаксической координат описывается. Этот метод также может быть адаптирована для инфузий других химических веществ в головном мозге крыс.

Аннотация

Много поведенческих функций у млекопитающих, в том числе грызунов и человека, опосредованы главным образом дискретных областей мозга. Общий метод для взыскательных функции различных отделов мозга в поведении или других экспериментальных результатов является внедрение локализованных удаление функции. У людей, групп пациентов с локализованным поражением головного мозга часто изучаются для дефицита, в надежде выявить основные функции поврежденного участка. У грызунов, можно экспериментально вызвать поражение конкретных областях мозга.

Поражение может быть выполнена несколькими способами. Электролитические поражения может вызвать локализованный ущерб, но может привести к повреждению различных типов клеток, а также прохождения волокна из других областей мозга, которые оказались рядом с поражением сайта. Индуцибельной генетических методов с использованием камерного типа конкретных промоутеров может также дать по конкретным участкам таргетинга. Эти методы являются сложными и не всегда возможно в зависимости от области мозга цели. Excitotкислородной поражение использованием стереотаксической хирургии, напротив, является одним из самых надежных и практические методы lesioning возбуждающих нейронов, не повреждая местных глиальных клеток или прохождения волокон.

Здесь мы приводим протокол для стереотаксической вливания excitotoxin, N-метил-D-аспартата (NMDA), в базолатеральной миндалевидного комплекса. Используя анатомические показания, мы применяем стереотаксической координаты, чтобы определить расположение нашего региона мозга цели и снизить иглу в место чуть выше цели. Затем наполнить наши excitotoxin в мозг, в результате чего эксайтотоксичного смерть рядом нейронов. В то время как наш экспериментальный предмет выбора крыс, те же методы могут быть применены в других млекопитающих, с соответствующими корректировками в оборудование и координаты.

Этот метод может быть использован в различных областях мозга, в том числе базолатеральной миндалины ^1-6, других ядер миндалины ^{6, 7,} гиппокамп ^8, ЛОР-orhinal коры ⁹ и префронтальной коре ^10. Она также может быть использован, чтобы вселить биологических соединений, таких как вирусные векторы ^{1, 11.} Основные стереотаксической техники также может быть адаптирована для имплантации более постоянного осмотического насоса, что позволяет более длительное воздействие соединений, представляющих интерес.

протокол

Анестезия и обезболивание: за тридцать минут до анестезии вводят крысе с 0,05 мг / кг подкожного бупренорфина для обезболивания. Начать анестезии с 30-40 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбитала натрия. На данный момент, а также вводят атропин, чтобы предотвратить нарушение дыхания (0,4 мг / кг, подкожно) и мелоксикам, как дальше анальгетик (2 мг / кг подкожно). Если через 5 минут, крыса еще мобильный телефон или реагировать на ноги крайнем случае, дать последующие дозы фенобарбитала натрия в дозе 5 мг / кг (внутрибрюшинно), пока крысы реагируют на боль. Перед проведением первого разреза, вводят лидокаин (5 мг / кг, внутрикожные) в разрез сайт для местной анестезии. Шесть-восемь часов после первой инъекции, вводят крысе с 0,05 мг / кг подкожного бупренорфина для обезболивания. Бупренорфин может быть введен через каждые 6-8 часа после этого, если необходимо, хотя это обычно не требуется.

Важно отметить, что другие виды анестезии свмешиваться в эксайтотоксичного поражений. Например, хотя кетамин является широко распространенной формой обезболивания у грызунов, это может повлиять на поражение индуцированные NMDA, потому что NMDA-антагонист рецепторов. Важно, чтобы выбрать метод анестезии, что вызывающий не уменьшает размер повреждения. Если газовый наркоз желателен, наиболее стереотаксических устройств, включая те, описанные здесь могут разместиться адаптеры противогаз.

Примечание: Материалы описано далее в таблице специфических реагентов и оборудования ниже.

1. Подготовка насоса и Stereotax

1. Наполните шприц 10 мкл Hamilton стерильной водой и установите его в футляр из 6 программируемых шприц насос. Закрепите конец шприца в зажатом держатель на насос.
2. Заполнять газом стерилизовать PE20 труб стерильной водой с помощью иглы и шприца 1 мл. Наденьте открытый конец трубки на шприц Гамильтон, будучи уходFUL, чтобы избежать создания пузырьков воздуха в трубе.
3. Зажмите 30ga, плоский крой, 1 дюйм конце иглы инфузионной трубопровода на руку стереотаксической устройства с помощью баррель стиле электродов манипулятор. Вставьте иглы инфузионной между зажимом и рифленые баррель. Закрепите зажим за кусок трубы, содержащих металлические иглы в нем, чтобы избежать выравнивания труб и ограничение жидкости.
4. Установите насос ставку> 5 мкл / мин и включить насос. Шарик воды должно появиться на кончике иглы инфузионной. Проверить длину трубы и соединения, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
5. Вытрите воду шарик с стерильным тампоном и установить насос, чтобы отступить. Вывод 2 мкл пузырек воздуха. В верхней части пузыря должна быть видна в трубку.
6. Погрузите кончик иглы инфузионной в дозе 20 мг / мл раствора NMDA в стерильном 0,1 PBS и снимать 4-5 мкл. Пузырьков воздуха должна быть видна между стерильной водой и NMDA решениев конце. Важно отметить, что NMDA является мощным нейротоксина и осторожностью следует применять при подготовке и обработке этого решения. Перчатки и защиту для глаз рекомендуется во все времена.

2. Установите Крысы в ​​стереотаксической устройства

1. На рисунке 1 показаны основные части стереотаксической устройства. После бритья головы крысы от линии глаз до ушей, загрузка передних зубов крыс на укус бар, теле крысы покоящаяся на грелку установлен на среду. Язык должен находиться ниже уровня укуса бар, с нижней челюстью. Если возможно, температура нагрева обратная связь панель была бы предпочтительнее. Мониторинг ректальной температуры также будет идеальным.
2. Проведение шеи крысы с большим и указательным пальцами, двигать правой горизонтального канала уха на правое ухо бар. В баре должны чувствовать себя, как это покоится на твердом месте, а не как она погружается глубоко в голове. Держа правую сторону головы устойчивый, сдвиньте левое ухозапрет на левый горизонтальный слуховой крысы. Он должен чувствовать, как она покоится на твердом месте. Перья должны выглядеть симметрично и должна появиться лежать на ухе баров. Вверх сжигания перьев указывает неправильное размещение ухо баров. Голова не должна колебаться в ответ на давление на шею.
3. Выверните нос бар. Будьте нежны. Кости в нос тонкий и нос бар не должна быть жесткой. Убедитесь, что крысы все еще под наркозом, прежде чем приступить.

3. Подготовка Крысы для хирургии

1. С помощью стерильного тампона, осторожно положите небольшое количество мази ветеринарные смазочных офтальмологической в ​​каждый глаз крысы, чтобы защитить их от высыхания и мусора.
2. Концентрически от запланированного сайт разрез по краю побрился региона, протрите кожу головы крысы с 2% раствора хлоргексидина следуют 70% этанола в три раза. Хлоргексидин скраба можно также использовать, если более эффективным дезинфицирующим средством лучшего.Готово, вытирая с 10% раствором йода повидон. Подготовленный головы теперь стерильной и должна только быть затронуты стерильными материалами.
3. Дон стерильные перчатки для дальнейших шагов, потому что вы следующий дело с подготовленным хирургической сайта.
4. Поместите стерильной драпировки, чтобы оконных выставляет места операции.

4. Создание хирургической окна

1. Использование # 10 лезвие скальпеля, сделать разрез (около 2 см в длину) вдоль продольной средней линии головы. Разрез должен начать кзади от линии глаз. С большим и указательным пальцами, не доминирующей рукой, держа в напряжении головы перпендикулярно к направлению разреза.
2. Потяните фасции покрывающей поверхности черепа до краев хирургической сайта с помощью стерильной хлопковой советы. Это займет некоторое усилие, чтобы очистить череп, так что можно посмотреть.
3. Использование четырех изогнутых, стерильный hemostats создать хирургический окна. Зажим фасции (не кожа) на еч стороны передней и задней стороны разреза, а затем заложить зажимы вместе с животным, тем самым, избавляя разрез открытой и полностью подвергая черепа.

5. Выравнивание Череп и создание пилотной скважины

1. Найдите темя, передние места, где три основные пластины черепа встречаются, как показано на рисунке 2. Перемещение иглы инфузионной чтобы кончик иглы не коснется черепа в темя. Обратите внимание на спинной-вентральной координат. На рисунке 3 показано, как читать координаты на Stoelting стереотаксической устройства. Обратите внимание, что на данный момент, перчатки не стерильные и не должны касаться стерильных операции напрямую. Примечание: после прикосновения нестерильных стереотаксической устройства, хирург не стерильны и не должны касаться места операции, ни части оборудования, которое будет касаться места операции.
2. Найдите лямбда задней точке, где три основные пластины черепа встречаются, как depicteD на рисунке 2. Поднимите иглу настой немного и перейти прямо к лямбда. Опустите иглу, пока она не коснется черепа в лямбда. Читайте спинно-вентрально координат. Если череп уровне, это будет в пределах 0,1 мм чтении брегмы. Если это дальше, чем это, перемещать иглу вверх (в сторону), ослабьте нос бар, либо поднять или опустить платформу укуса бар, в зависимости от окончания голову слишком высоко, а затем повторно меры.
3. Перемещение иглы инфузионной за темя и записывать передне-задней и медиальной боковой-координаты. Вычислить, где игла должны быть перемещены на основе координат область мозга интересов в соответствии с мозгом атлас ^12. Для BLA, вычесть 2,8 мм с передне-задней координат и добавить или вычесть 5,1 мм в / из средне-боковой координаты в зависимости от того, хотите, чтобы предназначаться для левой или правой. Перемещение иглы инфузионной расчетной позиции.
4. Поверните урожденнаярасслоение в сторону, следя за тем, чтобы отслеживать, где он находится, а затем просверлить отверстие размером примерно 2 мм в диаметре, в том месте с использованием Dremel мото-инструмент стерильной зубной сверло прилагается. Просверлите тщательно, как, когда сверло прорывается через череп, он, как правило, тянут вниз, возможно, повреждения твердой мозговой оболочки и ткани головного мозга под ним. Рим отверстие, чтобы увеличить.
5. Собрать любое крови стерильным ватным тампоном.

6. Настой Нейротоксин

1. Поверните иглу в нужное положение. Опустите иглу до соприкосновения с поверхностью мозга. Запишите спинно-вентрально координат. Это тот уровень, твердой мозговой оболочки. Вычтите соответствующее значение для достижения головного мозга, представляющих интерес. Для базолатеральной миндалины, вычесть 6,7 мм.
2. Опустите иглы инфузионной к расчетному уровню медленно. Затем поднять его обратно, что значительно выше черепа. Используйте чистящую Гамильтон шприц провод, чтобы высвободить кончике иглы инфузионной, стараясь не той конце провода, который вступает в контакт с иглы инфузионной с нестерильных перчаток.
3. Запуск насоса при> 5 мкл / мин и убедитесь, что вы видите шарик жидкость выходит из иглы инфузионной. Если нет, то прочистить с проволоки и попробуйте еще раз.
4. Опустите вливания иглу желаемого спинной / вентральной уровне медленно.
5. Установить ставки по инфузионного насоса до 0,1 мкл / мин и начать вливания. Настаивать в течение 2 мин.
6. После вливания начала, отметьте двух концах пузырьков воздуха в трубы с черным маркером. Если оба конца не двигаются, иглу засорен. Остановить вливания, поднять иглу, прочистить с проводом, проверьте поток с высокой скоростью потока, вновь снизить иглу и попробуйте еще раз.
7. После завершения инфузии, остановите насос и подождите 5 минут для NMDA диффундировать от иглы.
8. Поднимите иглу 0,5 мм, и настаивать еще в течение 1 мин. Подождите, 2,5 мин на NMDA диффундировать от кончика иглы. Это дополнительное вливание онLPS обеспечить все BLA покрыта настоем. Является ли это необходимым для других регионов, мозг должен определяться экспериментально.
9. Поднимите иглу из мозга и медленно поверните стереотаксической руку в сторону.

7. Закрытие разреза

1. Дон новые стерильные перчатки, чтобы закрыть разрез.
2. Вытрите лишнюю кровь на черепе стерильной хлопковой советов и снять зажимы из фасции.
3. Используя щипцы Лондоне, нажмите обе стороны разреза вместе. Расстояние между внутренними краями кожи должны встретиться и внешнего края кожи не должны допускаться к скручиванию в разрез. При нажатии разрез закрыт, применяется раны клипов, чтобы закрыть выступ твердо. Продолжают настаивать кожи вместе и основные по длине разреза. Это обычно занимает 3-5 клипов раны.
4. После размещения всех клипов рану, использование щипцов, чтобы зажать скобы раз, убедившись, что они находятся в безопасности. Более безопасные тОн клипов, тем меньше вероятность крыса будет тянуть их, прежде чем разрез зажила.
5. Тампон сшитых разрез с 10% повидон раствор йода и вернуть крыс в клетке дома и мониторов до подвижность восстанавливается (как правило, через 1-2 часа после наркоза, общее время операции от индукции к закрытию быть 30-45 мин.) На данный момент, крыса может быть возвращен в колонию комнате. Через неделю, удалите скобы с основной инструмент для удаления под ИФ анестезии.
6. Использование горячего шарика стерилизатор для стерилизации наконечника поверхности все инструменты перед использованием на следующей крысы. Инструменты должны быть погружены в бисер не более чем на 15 секунд, или они могут стать слишком горячими, чтобы обращаться. Инструменты должны быть полностью охлаждается до использоваться на других животных.

8. Восстановление

1. Вполне возможно, что крысы обладают судорожной активности в первые дни после поражения. В зависимости от области мозга, поврежденные, другие виды поведения, такие как потребление пищи или GROoming могут быть затронуты. Важно, чтобы животные контролироваться на ежедневной основе, чтобы они оставались здоровыми во время восстановления. Поддерживающая терапия, например, жидких пищевых продуктов, калорийной пищи, или дополнительного обезболивания может потребоваться. Смертность от наркоза происходит в низкий процент крыс, как правило, менее 5%. Смертность от других причин (инфекция, кровотечение) встречается крайне редко. Любые признаки дистресса после восстановления анестезия может привести к исключению из дальнейших исследований, но крайне редко. На рисунке 4 показана потеря веса в течение первых нескольких дней после операции, как и следовало ожидать. Масса тела должна восстановиться в течение 1 недели.

9. Представитель Результаты

Одна неделя или больше после введения NMDA, поражения могут быть визуализированы помощью крезиловый-фиолетовый контрастирующая окраска и светлого микроскопии. Мозги должны быть озарен ледяной 4% параформальдегида, уравновешенную 30% сахарозы в 0,1 М PBS и frozеп. Они должны быть нарезаны на 30-60 мкм, в серии 1:6 до 1:12 и установлен на желатин покрытием предметные стекла до проведения стандартных крезиловый контрастирующая окраска фиолетовый. Поражение должно соответствовать "лысина" или области снизилась крезиловый фиолетовым пятном в связи с гибелью клеток после повреждения. Цифры 5A и B показывают, представитель поражения BLA и РЭА. Эта фотография была получена с помощью планшетного сканера с высоким разрешение сканирования (1200 точек на дюйм). Для визуализации поражений, он помогает контрастирующая окраска ряда секций, на протяжении большей части тканей, окружающих целевой области так неуместны поражения могут быть расположены.

Рисунок 1. Стереотаксической установки. Эта цифра показывает, крысы стереотаксической с соответствующими подразделениями на упаковке.

Рисунок 2. Темя и лямбда-на крысу SKULL. Эта иллюстрация изображает расположение брегмы и лямбда. Все координаты измеряются по отношению к брегмы. Lambda используется для того, чтобы череп уровне.

Рисунок 3. Чтение стереотаксических координат. На этом рисунке изображен стандартный стереотаксической чтения. Для получения цифр слева от десятичной точки, использовать маркеры с правой стороны. Помечены цифрой соответствует десяткам месте (например, 1 = 10, 2 = 20). Хэш знаки между цифрами помечены соответствуют одной единицы (1-9). Нулевой линии указывает на то, что целое stereotax установлен. Здесь нулевой линии между 10 и 11 маркеров, о том, что чтение между 10 и 11. Для определения числа справа от десятичной точки, используя маркеры в левой части. Хэш знаки слева пронумерованы от 0 до 10, при этом каждый немеченого хэш представляющих одну единицу отличие отте, рядом с ним. Какой бы из хэш-меток на левой линии до лучших с хэш знаки справа указывает на первое десятичное место чтения координат. Здесь диеза слева соответствующий номер 9 линий до лучших с правой стороны хэш знаки так десятичное место 9. Окончательном чтении составляет 10,9 мм.

Рисунок 4. Изменение веса после операции. Этот график показывает средний (± SEM) вес крыс, перенесших стереотаксической хирургии (п = 17) или не делать операцию (п = 6). День 0 в день операции. После операции вес крыс уменьшилась в течение 2-3 дней после операции, а затем увеличилась примерно 5-6 дня.

Рисунок 5. Эксайтотоксичного пример поражения.) Это изображение показывает крезиловый фиолетовый контрастирующая окраска на 30 мкм часть короны с "лысымипятно "с NMDA поражения базолатеральной миндалины. белыми стрелками выделить поражение. Это можно сравнить с противоположной стороны мозга часть которых не имеет поражений. B) аналогично поражение центрального ядра миндалины.

Обсуждение

Стереотаксического метода, представленные здесь позволяет эксайтотоксичного поражением определенных областей мозга с помощью вливания NMDA. Основные стереотаксической методы могут быть адаптированы, чтобы вселить различных фармакологических и биологических агентов в конкретных уч?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
N-метил-D-аспарагиновой кислоты 98%	Fisher Scientific	AC32919-0500
Двойной Лаборатория стандартных стереотаксических w/45 град. Ухо бары	Stoelting	51653	Альтернативные Производитель: Kopf * Предупреждение: обеспечение совместимости стереотаксической принадлежности, если покупка от разных производителей
10 мкл SYR СПЕЦИАЛЬНЫЕ (* / * / *)	Гамильтон	701SN
Dremel Мото-Tool	Stoelting	58600	Альтернативные Производитель: Kopf
Карбид бора, наконечник HP, размер 2	Шейн стоматологические	2284578
Stoelting 6 шприцевлегковоспламеняющимися насоса	Stoelting	53140	Альтернативные Производитель: Kopf
Нержавеющая сталь 316 Регулярные подкожные трубы стены 30 калибровочных 0,0123 "OD х 0,00625" ID х 0,003 "Wall (настой иглы)	Мелкие детали	HTXX-30Р-06-05
Intramedic PE 20 труб (НКТ инфузии)	VWR	63019-025
Reflex клипы, 9 мм, нестерильные	Кент научно корпорации	INS500346	Альтернативные Производитель: изобразительных средств наук
Reflex объекта применения Зажим для 9мм клипы	Кент научно корпорации	12031-09	Альтернативные Производитель: изобразительных средств наук
Изогнутые кровоостанавливающего Хартман	Изобразительных средств наук	13003-10
Лондон щипцы	Изобразительных средств Sceince	11080-02
2% раствора хлоргексидина	Allivet	30159	Альтернативные Производитель: PetSolutions
10% раствор повидон йод	CVS	SKU # 739575
Горячий шарик стерилизатор	Гарвардский аппарата	610183