הערכה תפקודית של תנועתיות מעיים ודלקת דופן מעי במכרסמים: ניתוח בדגם סטנדרטי של מניפולצית מעיים

Summary

ileus לאחר הניתוח (POI) הוא סיבוך של ניתוח בטן מוביל לתחלואה ואשפוז ממושך. בגלל אסטרטגיות מניעות או טיפול חסרות מחקר התעצם הוא הכרחי. לכן הקמנו מודל עכבר סטנדרטי וריאלי כדי לחקור את הפתופיזיולוגיה של POI וללמוד אפשרויות טיפוליות פוטנציאליות.

Abstract

דלקת של מערכת העיכול היא סיבה נפוצה עבור מגוון רחב של מחלות בבני אדם. מודלים מחקריים בבעלי החיים הם קריטיים בחקירה מורכבת תאיים ומולקולרי של פתולוגיה במעיים. למרות שרירית Tunica היא לעתים קרובות את האיבר של עניין במחלות דלקתיות רבות, עבודות אחרונות הוכיחו כי הידבקות muscularis (ME) היא גם איבר immunocompetent מאוד שטומן רשת צפופה של immunocytes התושבים. ^1,2 עבודות אלה בוצעו תוך טופל מודל של מניפולצית מעיים (IM) שמוביל לדלקת של קיר המעי, מוגבל בעיקר לME. מבחינה קלינית לדלקת זו גורמת לdysmotility הממושך במעיים, המכונה ileus לאחר ניתוח (POI) שהנו סיבוך שכיח ובלתי נמנע לאחר ניתוח בטן. ³ הדלקת מאופיינת בשחרור של מתווכים מעודדים דלקת כגון IL-6 ⁴ או נוירוטרנסמיטורים IL-1β או מעכבות כמו nitriג תחמוצת (NO). ⁵ לאחר מכן, מספרים עצומים של immunocytes extravasate אליי, שנשלט על ידי נויטרופילים polymorphonuclear (PMN) ומונוציטים ולבסוף לשמור על נקודת עניין. ² שנמשכים במשך ימים, שיתוק מעי זו מוביל לסיכון מוגבר לשאיפה, טרנסלוקציה חיידקים וסיבוכים זיהומיות עד לאלח דם וקריסת מערכות רבה וגורמים לניטל כלכלי גבוה. ⁶

בכתב היד הזה אנחנו מדגימים את המודל הסטנדרטי של הודעות מיידיות ולהערכת vivo של מעבר מזון במעיים (git) ומעבר מעי גס. יתר על כן אנו מדגימים שיטה להפרדה שלי מרירית Tunica אחרי ניתוח חיסוני, שהיא חיונית להבחין בין התגובות הדלקתיות בשני תאי קיר מעי immunoactive מאוד אלו. כל הניתוחים בקלות להעברה לכל דגמי מחקר אחרים, המשפיע על תפקוד מערכת עיכול.

Protocol

1. בעלי חיים

עכברי C57Bl6 / י גברים עם משקל ממוצע של 25 גרם, התקבלו מהרלן ינקלמן (Borchen, גרמניה). כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוק הפדרלי להגנה על בעלי חיים. עקרונות טיפול בבעלי חיים במעבדה היו במעקב. בעלי חיים הוחזקו על אור 12-HR / מחזור כהה ומסופקים עם המכרסם צ'או הזמין מסחרי וכרצונך מים ברז. בעלי חיים צריכים להיות שוכן לפחות 7 ימים לאחר הגעת בית הגידול שלך לפני ניסויים. שים לב שכל הניסויים ניתן להתאים בקלות לחולדות או מינים אחרים ועם שינויים קלים לתוך מודלים של בעלי חיים גדולים.

2. נוהל אופרטיבי

1. הרדמה מושרה ומתוחזק עם isoflurane (אבוט, ויסבאדן, גרמניה) בחמצן. לאחר ההופעה של בעלי חיים במקום הרדמה במצב שכיבה ובגפיים לתקן עם דבק (Leukosilk, Beiersdorf, המבורג, גרמניה).
2. לאחר גילוח וניתוחי חיטוי של דופן בטן laparotomy חציון מתבצע באורך של 2 סנטימטר. הזן את חלל הבטן דרך חתך לאורך Linea alba. מקום 2 מפשק סטריליים כדי לשמור על הבטן פתוחה. זהירות eventerate המעי הקטן בצד השמאל והנח אותו על גזת צמר גפן רטובה.
3. לפנות את תוכן המעי הדק השלם luminal עם שתי applicators כותנה לחה וסטרילית (קטועי איברים, Neunkirchen, גרמניה) על ידי גלגולו זמנית המוליך מהשוער לcecum. זהירות: הימנע מדימומים של קיר או נגעים של כלי מעי המעי הדק. החזר את הבטן לתוך חלל הצפק מבלי להתפעל למנוע איסכמיה או חסימה מכאנית ולסגור את החתך בבטן באמצעות 2 שכבה רציפה 5/0 תפרי פוליאמיד לא נספגים (Ethicon, Norderstedt, גרמניה).

3. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר ההליך למקם את החיה תחת מנורת חימום, observing אותו עד שהתאושש מההרדמה. שים את העכבר לכלוב שלו ולאפשר גישה למים ומזון. בשל המאפיין של אופיואידים למשפיעים פריסטלטית, אנו מבצעים אלחוש perioperative עם NSAIDs (לדוגמא metamizol) במי שתייה.

4. מחקרים תפקודיות 24 שעות לאחר IM

1. העיכול טרנזיט (git)
   1. עכברים לטשטש מעט עם 22.5 שעות בisoflurane חמצן לאחר IM. הזהירות hyperextend הראש של העכבר ולשלוף את הלשון עימו מלקחיים בוטים. מלא מזרק 1 מ"ל עם לפחות 100 μl fluorescein שכותרת dextran (FITC-dextran, 70,000 מגוואט, סיגמה אולדריץ, Taufkirchen, גרמניה), לחבר אותו לקטטר עורקים (Vygon, Ecouen, צרפת) ולהכניס בזהירות את הקטטר כ צינור קיבה אל הקיבה.
   2. בקצרה להזריק 100 μl FITC-dextran ולשלוף את הקטטר. לתת לחיה ערה ומחכה ל90 דקות. במהלך הזמן הזה עכברים יש גישה למזון ומים.
   3. הכן 15 מ"ל 2 צינורות ספינינג ולתייג אותם ברצף.
   4. להרדים עכברים 90 דקות לאחר gavage ולהסיר את מערכת העיכול כולה מקיבה לרקטום. הנח את המעי על משטח קלקר ולהימנע ממתיחה. מערה: זה חיוני כדי להסיר את הבטן בעדינות כדי להימנע מההסטה של-dextrane FITC נוזל לתוך הקטע הסמוך. להתחלה זה עשוי להיות מועיל כדי להשתמש בסרטונים בתחילה ובסיום של כל מגזר.
   5. למדוד אורך מלא של מעי דק ואורך מלא של מעי גס. מחלק את המעי הדק ל10 קטעים בגודל שווים על ידי הצמת אותה למשטח הקלקר עם cannulas. לחלק את המעי הגס ל3 מגזרים. אתה הכנת 15 קטעים (בטן # 1), עשרה קטעים שווים בגודל קטן מעיים (# 2-11), cecum (# 12) ושלושה קטעים 3 גסים שווה בגודלן (# 13-15).
   6. תחצה את המעי בעמדות המסומנות, לתפוס אותו עם מלקחיים ולשוטפם פעם אחת עם 1.0 המ"ל KHB להכין בעבר KHB containiצינורות ng 2.0 מ"ל ונמרץ למערבולת 20 שניות. הקיבה וcecum מונחים ישירות ולחתוך בצינורות שהוכנו מראש. מלא צינורות אלה עם 1.0 המ"ל KHB, כך שטיפת עקבות של תוכן luminal מהמספריים לחצוצרות.
   7. צנטריפוגה הבדיקות ב12000 RCF למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר בצנטריפוגה בראש הטבלה. במהלך צנטריפוגה להכין 15 1.5 צינורות מ"ל עוד ממוספרים ברצף.
   8. העבר את supernatants הברור לתוך הצינור החדש 1.5 המ"ל ולאחסן בחושך ב 4 ° C עד ניתוח (השלב ​​הבא). הבדיקות יכולות להיות מאוחסנות במשך כמה ימים בכל 4 ° C ללא אובדן משמעותי של אות FITC. לאחסון יוסיף עוד 0.09% נטריום-יזידו או חנות ב< -18 ° C.
   9. פיפטה 100 duplets μl של supernatants על לוח שחור 96-היטב (גריינר ביו אחד, Frickenhausen, גרמניה). פיפטה 2 μl 100 דגימות של KHB כריק.
   10. קראו את הצלחת בפלואורסצנטי קורא (ספייר, טקאן, Crailsheim, גרמניה) ולכמת fluorescencדואר ב494 ננומטר (בליעה) / 521 ננומטר (פליטה) גל. חיסור ערכים ריקים מדגימות.
   11. לחשב את המרכז הגיאומטרי (GC) של הפצת FITC-dextran, שהוא למעשה מרכז הכובד לחלוקת סמן, על פי הנוסחא הבאה: GC = Σ (% מאות הניאון כולל למגזר * מספר קטע) / 100

   הערה: על ידי הכפלת אחוז הקרינה של כל מגזר במספר מגזריו ממוצע משוקלל של ההתפלגות של סמן בתוך מעיו יבחן. נקודה זו מושפעת גם ההפצה ומרחק שהסמן, אך אינו נוטלת חלוקה בסיסית מסוימת. ⁷ ערך GC המחושב הציג לעתים קרובות בשילוב עם גרף הממחיש את חלוקת FITC dextran על מערכת העיכול (איור 1 א).

2. טרנזיט חוקן
   1. עכברים צריכים להיות חלש הורדמו עם isoflur2% ane בחמצן. התראה: ודא שבעל החיים יהיו ערים בתוך 40 שניות.
   2. לבחון היטב patency מעי על ידי החדרת בדיקת פיסטולה (מתכת מוט, בקוטר מ"מ 2) דרך פי הטבעת אל המעי הגס.
   3. באמצעות בדיקת פיסטולה לדחוף קדימה 3 סנטימטרי כדור זכוכית 2 מ"מ לתוך המעי הגס ולשלוף את הבדיקה באופן מיידי. הנח את העכבר בכלוב שקוף ולהתחיל למדוד הזמן לאחר בדיקת פיסטולה הייתה משוכה מתוך המעי הגס. לפקוח עין לעכבר ולעצור את הזמן, מייד אחרי כדור הזכוכית הפך מופרש.

5. ניתוח של דגימות Histochemical ME מבודד

1. מגזרי Midjejunal נחתכים מהמעי ושקוע בKHB הקר בצלחת Sylgard מלאה.
2. לפדר מוצמד לצלחת עם 0.2 מחטי חרקי מ"מ (כלים יפים מדע, היידלברג, גרמניה).
3. גזור לפתוח את המקטע לאורך גבול mesenteric ולמתוח ל ~ 120% מהאורך ולרוחבו. לסיים את הקיבוע עם חרקיםפינים באתר שני של לפדר. יש לשטוף את צלחת sylgard זהירות עם KHB הקר קרח טרי, ובכך שטיפה כל התוכן של האור.
   עכשיו יכול להפריד מכאני מרירית Tunica החל מלפדר. במהלך ההכנה להחליף מספר פעמי KHB מצוננות טריות.
4. רירית Tunica פרוד אפשר להקפיא הלם בחנקן נוזלי לניתוח נוסף או מיותרת.
5. תקן אותי את כל ההר המבודד עם אתנול 100% למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
   לשטוף השלוש פעמי ההר השלמות באמצעות KHB המצונן. הערה: fixatives האחר (כלומר פורמלין 4%, חומצה אצטית, aceton) יכול לשמש גם לאחר בדיקות התאימות שלה עם ניתוח שלאחר מכן.
6. את החצובות השלמות ME מוכן לצביעת histochemical או immunhistochemical נוספת:

1. Histochemistry: myeloperoxidase מכתים (MPO)
   PMNs הסתנן יכול לבדוק את הפרוטוקול המכתים MPO הבא.
   1. לפתור 10 מ"ג Hמגיב ינקר ייטס (Polyscience אירופה, Eppelheim, גרמניה) בKHB 10 מ"ל ולהוסיף 100 μl של 3% H ₂ O _2. הכן את הפתרון טרי מייד לפני שימוש ולא שימוש חוזר.
   2. דגירת mounts השלם למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר.
   3. יש לשטוף דגימות נרחבות עם KHB ולדגור הקר למשך 10 דקות.
   4. הר דגימות בהרכבה בינונית מימייה (Aquatek, מרק, דרמשטט, גרמניה) לאחר ייבוש עבור 2 שקופיות hr לנתח בתחת מיקרוסקופ אור.
   5. ספירת מספר התאים ב5 שדות שנבחרו באקראי ולחשב, תאים חיוביים MPO / מ"מ ^2.
2. Immunohistochemical מכתים:
   בהתאם להכתמת MPO histochemical, stainings immunohistochemical של mounts המלא יכול להתבצע. בעיקר, הפרוטוקולים שלך מבוססי immunohistochemical הצביעה של תרביות תאים או פרוסות רקמה ניתן להתאים בקלות להכתמת הר שלמה. עם זאת, ייעול ההליך אנטי ספציפיגופים חזקים הוא ממליצים.
   1. חותך דגימות ל5 5 חתיכות מ"מ x ולבצע הכתים בצינורות 2.0 מ"ל עגולים תחתונים צנטריפוגות ב ~ 150 μl - פתרון נוגדן 200 μl.
   2. קיבעון וחסימת הליך (כלומר 3% BSA ב PBS לשעה 1 בטמפרטורת חדר) יכול להתבצע ב" מנת sylgard ".
   3. ניתן לבצע את פעולות כביסה באס או במאגרים אחרים בצלחות 12-כן.
   4. העברה. את הדגימות בזהירות עם מלקחיים חדים בין צינורות מכתימים וצלחות כביסה.
   5. לאחר שהדגימות הסופיות כביסת הליך ההר במדיום גובר נגד דהייה עם תלושי כיסוי ולנתח באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

6. תרבות אורגן שלי

1. המעי הדק הוא כל resected 24 שעות לאחר IM והניח בKHB קר המכיל 200 U / המ"ל פניצילין G וסטרפטומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​(KHB + P / S).
2. חותך את הבטן לתוך 3 סנטימטר אורך ולהצמיד לכל מגזר מטה Sylgard המכיל GLAמנת ss.
3. הסר את לפדר עם מספריים עדינים ולהחליק את המעי במסרגה.
4. עדינות חתוך עם מלקחיים חדים ולהפשיט אותה מsubmucosa באמצעות מוליך כותנה לחה. רירית Tunica נשארת על המסרגה ויכולה להיות צמד הוקפא לחקירה נוספת. אותי היא אסף בKHB הקר + P / S.
5. חותך את הרצועות בודדו אותי לחתיכות קטנות של 2-4 מ"מ האורך ו דגירה אותו בקרח הקר KHB + P / S למשך חצי שעה ולשטוף את הדגימה מספר פעמים.
6. להעביר כ 50-60 מ"ג ME (ME במחצית לפחות ממעי דק אחד) בצלחת 24 גם סטרילי המכילה modified הנשר הבינוני (DMEM) 500 μl של Dulbecco.
7. לדגור על 37 ° C ו 5% CO ₂ לשעות 24 נוספות.
8. בדוק את תרביות תאים לזיהום חיידקים או פטרייתי מתחת למיקרוסקופ.
9. איסוף supernatant, ספין למטה למשך 5 דקות ובהקפאת 1000 RCF צמד בחנקן נוזלי. בינתיים תמחה לייבש muscרקמת le בממחטת נייר נקיה למשך 30 שניות ומשקל.
10. Supernatants יכול לשמש לניתוח בדיעבד של ציטוקינים שפורסמו (IL-6) על ידי ELISA או מטבוליטים אחרים (כלומר ניטריט) בsupernatant על ​​ידי ביצוע מייצר הוראות.
11. לנרמל ריכוזים מדודים למשקל של רקמת ME.

7. נציג תוצאות

1. מחקרים פונקציונליים
   הפרמטר החשוב ביותר על מנת להעריך את החומרה של POI הוא בחינת Git in vivo. האיור 1A ממחיש התפלגות טיפוסית של FITC dextran לאורך מערכת העיכול בבקרה שלא טופלה ומערכת עיכול מניפולציות עכברים 24 שעות לאחר ניתוח. "שאם פעל" חיות הראו Git נורמלי עם מרכז גיאומטרי מחושב (GC) בcecum תוך IM הביא לעיכוב משמעותי של Git במעי הצם הפרוקסימלית (האיור 1B)
   תנועתיות מעי התמקדו בבנפרד על ידי מדידה של כדור הפרשת זמן oכדור fa 2 מ"מ זכוכית. שאם פעל עכברים להראות זמן הפרשה של 48-200 שניות בזמן מיידי הוביל להפרשת זמן ממושך בין 470-775 שניות (התרשים 1C).
2. מחקרים מורפולוגיים
   כדי לתאר הדלקתי להאריך בתוך כמה פנוטיפים ME של לויקוציטים יכול להיות מנותח באמצעות histochemistry או אימונוהיסטוכימיה. באיור 2A + B נוכחות נמוכה של PMNs ב" דמה פעלה "חיות נצפו (39 ± 7 תאים / מ"מ ^2). IM של המעי הדק הוביל לחדירת PMN חזקה (660 ± 86 תאים / מ"מ ²⁾ בהשוואה לעכברים המופעלים מזויפים
3. ME תרבות איברים
   מתווכים דלקתיים רבים משוחררים מתאים הם קשים לזהות בlysates רקמות. תרבויות איברים לאפשר זיהוי של מתווכים המשוחררים בsupernatant התרבות. מתווך נציג בנקודת העניין הוא לא, שהוא כשליח עצבי מעכב עיקרי במערכת העיכול. ⁵
   NO לא ניתן היה לזהות במבוי סתום איבר MEsupernatants ture של חיות בקרה unoperated (5 ± 6 מיקרומטר / רקמות 24 שעות / מ"ג). בעכברים מזויפים פעלו (laparotomy) הבזליים אין רמות של 53 ± 36 מיקרומטר / רקמות 24 שעות / מ"ג נצפו. ME תרבויות של עכברי מניפולציות מערכת עיכול (שנקטף 24 שעות לאחר ניתוח) לייצר באופן משמעותי יותר NO (2254 ± 853 מיקרומטר / רקמות 24 שעות / מ"ג) במהלך תרבות איבר 24 שעות ME (איור 3).

האיור 1. השפעה מיידית על Git (+ B) ומעבר מעי גס (C) Git נמדדה כאחוז מלא נספג dextran fluorescein מתויג-15 במערכת עיכול מגזרים-בטן (סטים), מעי דק (SI 1-9 ), Cecum (CEC), ונקודות (Co) -90 דקות לאחר בליעה דרך פה. מעבר מעי גס נמדדה כזמן מתלישת חללית פיסטולה עד הפרשה של 2 מ"מ חרוז זכוכית. () הפצת עיכול של fluorescein isothiocyanate-דקסטראן לאחר מבצע זיוף או צ'אט. בבעלי חיים המופעלים המזויפים ביותר של הסמן ממוקם בcecum או מעי הגס הפרוקסימלי לעומת מיקום jejunal הפרוקסימלי בחי מטופלות. קווים מהקווקווים מציינים מחושב GC. (ב) חישוב GC הפגין זמן מעבר מזון במעיים ממושך לאחר IM. (ג) זמן מעבר החוקן הראה עיכוב משמעותי בעכברי IM לעומת חיות פעלו מזויפות. GC עבור 15 קטעי המעיים מוצגים כאומר (n = 5). זמני מעבר של מעי גסים הוצגו אומרים עם כל הערכים הבודדים (n = 6). *** = P <0.001, מבחן t של סטודנט.

איור 2. איתור של תאים חיוביים MPO בתוך מעי דק ME. () כל mounts הוכתמו מגיב ייטס להשתוקק לגילוי PMN החיוביות MPO 24 שעות לאחר laparotomy (מזויף) או הליך מיידי. (ב) כימות של תא החיובי MPO בתוך 5 שדות שנבחרו באקראי לכל עכבר. n = 6nimals לכל קבוצה. *** = P <0.001, מבחן t של סטודנט.

איור 3. אין ייצור בsupernatants התרבות שלי. דגימות שריר מפקדי unoperated, המתחזה פעלו ועכברי IM נלקחו 24 שעות לאחר ניתוח והתרבית ל24 שעות. עכברים שלא טופלו הראו רק ייצור בסיסי נמוך מאוד של NO. לאחר laparotomy NO שחרור מוגבר ללא מדידת הבדלים משמעותיים בין עכברים המופעלים מזויפים וקבוצת הביקורת. 24 שעות לאחר IM NO ייצור עלה באופן דרמטי בהשוואה לעכברים שלא טופלו או מופעלי אחיזת עיניים. n = 5 חיות לכל קבוצה. *** = P <0.001, הדרך ANOVA 1.

Discussion

מחקר השוואתי ניתוח רמות שונות של מסרים מיידיים (eventration המעי הדק למשך 10 דקות לעומת עדינות בדיקה של המעי הדק באמצעות שני applicators כותנה לעומת IM עם פינוי של תוכן מעי דק לcecum) גילה קשר בין המידה של מניפולציה וPOI כירורגית. בהשוואה לקבוצות האחרות IM הראה כמות הגבוהה ביותר של לויק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב / הציוד	חברה	מספר קטלוגים
Ethilon 5/0	Ethicon	1666H
applicators כותנה	מומם	71010
קטטר עורקים	Vygon	115-798
96 צלחת היטב (שחור)	גריינר ביו אחד	655096
זכוכית הכדור (2 מ"מ קוטר)	ורף	על פי דרישה
סיכות חרקים	כלי מדע פיין	26000-25
מגיב להשתוקק ייטס	Polyscience	560694
Aquatek	מרק	HC109850
DMEM	Lonza	BE12 F-604
FITC-dextran (MW 70000)	סיגמה אולדריץ	46945-500 מ"ג-F