D'évaluation fonctionnelle de la motilité intestinale et inflammation de la paroi intestinale chez les rongeurs: analyses dans un modèle standardisé de la manipulation intestinale

Résumé

Iléus postopératoire (POI) est une complication de la chirurgie abdominale conduisant à une morbidité accrue et un séjour prolongé à l'hôpital. Parce que les stratégies prophylactiques ou thérapeutiques font défaut intensification de la recherche est nécessaire. Par conséquent, nous avons établi un modèle de souris standard et possible d'étudier la physiopathologie de POI et d'étudier les options possibles thérapeutiques.

Résumé

L'inflammation du tube digestif est un motif fréquent pour une variété de maladies humaines. Modèles de recherche animale sont essentielles dans l'étude du complexe cellulaire et moléculaire de la pathologie intestinale. Bien que la muqueuse est souvent l'organe d'intérêt dans de nombreuses maladies inflammatoires, des travaux récents ont montré que la musculeuse externe (ME) est également un organe hautement immunocompétent qui abrite un réseau dense de immunocytes résidents. ^1,2 Ces travaux ont été effectués au sein de l'standardisé modèle de manipulation intestinale (GI) qui mène à l'inflammation de la paroi intestinale, essentiellement limitée à la ME. Sur le plan clinique, cette inflammation entraîne troubles de la motilité intestinale prolongée, connu sous le nom iléus postopératoire (POI), qui est une complication fréquente et inévitable après une chirurgie abdominale. ³ L'inflammation est caractérisée par la libération de médiateurs pro-inflammatoires telles que l'IL-6 ⁴ ou d'IL-1β neurotransmetteurs inhibiteurs ou comme nitric azote (NO). ^{5 Par la} suite, un nombre considérable de immunocytes s'extravaser dans le ME, dominé par les polynucléaires neutrophiles (PMN) et les monocytes et enfin maintenir POI ^2. durable pendant des jours, cette paralysie intestinale conduit à un risque accru d'aspiration, la translocation bactérienne infectieuses et les complications allant jusqu'à la septicémie et une défaillance organique multiple et provoque une forte charge économique ^6.

Dans ce manuscrit, nous démontrons le modèle standard de la messagerie instantanée et évaluation in vivo de transit gastro-intestinal (TGI) et de transit colique. En outre, nous démontrons une méthode pour la séparation de la ME de la muqueuse suivie d'une analyse immunologique, ce qui est essentiel de faire la distinction entre les réponses inflammatoires dans ces deux compartiments très immunoactifs paroi intestinale. Toutes les analyses sont facilement transférables à toutes les autres modèles de recherche, affectant la fonction gastro-intestinale.

Protocole

1. Animaux

Mâles C57BL6 / J souris avec un poids moyen de 25 g ont été obtenus auprès de Harlan Winkelmann (Borchen, Allemagne). Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la loi fédérale sur la protection des animaux. Les principes des soins des animaux de laboratoire ont été suivies. Les animaux ont été maintenus sur une lumière de 12 h cycle jour / nuit et muni rongeurs disponible dans le commerce chow et à volonté du robinet de l'eau ad. Les animaux doivent être logés au moins 7 jours après l'arrivée dans votre animalerie avant les expériences. Notez que toutes les expériences peuvent être facilement adaptés à des rats ou d'autres espèces et avec de légères modifications dans les modèles animaux de grande taille.

2. Procédure opératoire

1. L'anesthésie est induite et maintenue avec de l'isoflurane (Abbott, Wiesbaden, Allemagne) en oxygène. Après l'apparition des animaux de lieux d'anesthésie en position couchée et extrémités fixes avec du ruban adhésif (Leukosilk, Beiersdorf, Hambourg, Allemagne).
2. Après la désinfection, rasage et chirurgicale de la paroi abdominale, une laparotomie médiane est réalisée sur une longueur de 2 centimètres. Entrez la cavité abdominale par une incision le long de la ligne blanche. Placer les deux écarteurs stériles pour maintenir l'abdomen ouvert. Soigneusement eventerate l'intestin grêle vers la gauche et le placer sur une gaze de coton humide.
3. Évacuer tout le contenu luminal l'intestin grêle avec deux applicateurs en coton humide et stérile (MaiMed, Neunkirchen, Allemagne) en appuyant simultanément rouler l'applicateur du pylore le caecum. ATTENTION: Éviter les hémorragies de la paroi de l'intestin grêle ou de lésions des vaisseaux intestinaux. Remettre le tube digestif dans la caverne péritonéale sans tordre pour éviter une ischémie ou une obstruction mécanique et fermer l'incision abdominale à l'aide d'une couche de deux fixes 5/0 en polyamide non résorbables (Ethicon, Norderstedt, Allemagne).

3. Soins postopératoires

1. Après la procédure de placer l'animal sous une lampe chauffante, observing jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie. Placez la souris de retour dans sa cage et permettre l'accès à l'eau et de la nourriture. En raison de la propriété d'opioïdes pour influer sur le péristaltisme, nous effectuons une analgésie périopératoire des AINS (par exemple métamizol) dans l'eau potable.

4. Des études fonctionnelles 24 heures après l'IM

1. Transit gastro-intestinal (TGI)
   1. Anesthésier les souris légèrement avec de l'isoflurane dans de l'oxygène 22,5 heures après l'IM. Soigneusement hyperextension de la tête de la souris et tirez la langue avec une pince à bouts ronds. Remplir une seringue de 1 ml avec au moins 100 pi marqué à la fluorescéine dextrane (FITC-dextran, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Allemagne), connectez-le à un cathéter artériel (Vygon, Ecouen, France) et introduire le cathéter en tant que sonde gastrique dans l'estomac.
   2. En bref, injecter 100 ml de FITC-dextran et retirer le cathéter. Laissez l'animal éveillé et attendre 90 min. Pendant ce temps, les souris ont accès à la nourriture ou de l'eau.
   3. Préparer quinze tubes de 2 ml de filature et de les étiqueter de façon consécutive.
   4. Euthanasier les souris 90 minutes après gavage et retirez l'ensemble du tractus gastro-intestinal de l'estomac au rectum. Placez l'intestin sur un bloc de polystyrène et d'éviter les étirements. CAVE: Il est essentiel de retirer l'intestin en douceur pour éviter un décalage de liquide FITC-dextran dans le segment voisin. Pour le début, il pourrait être utile d'utiliser des clips au début et à la fin de chaque segment.
   5. Mesurer la longueur totale de l'intestin grêle et du côlon pleine longueur. Diviser l'intestin grêle en 10 segments égaux de taille en le coinçant au pad polystyrène avec des canules. Diviser le côlon en 3 segments. Vous avez préparé 15 segments (estomac n ° 1), dix segments de taille égale intestin grêle (# 2-11), caecum (# 12) et trois 3 segments de taille égale coliques (# 13-15).
   6. Transect l'intestin aux positions marquées, le saisir avec une pince et les rincer une fois avec 1,0 ml KHB dans le préalablement préparé containi KHBng 2,0 ml tubes et vortexer vigoureusement pendant 20 secondes. L'estomac et du caecum sont placés directement et couper dans les tubes préparés. Remplir ces tubes avec 1,0 ml KHB, ainsi traces de rinçage contenu luminal de la ciseaux dans les tubes.
   7. Centrifuger les sondes à 12.000 rcf pendant 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de table. Pendant la centrifugation, préparer 15 autres numérotés consécutivement tubes de 1,5 ml.
   8. Transférer les surnageants clairs dans le nouveau tube de 1,5 ml et conserver à l'obscurité à 4 ° C jusqu'à l'analyse (étape suivante). Les sondes peuvent être stockées pendant plusieurs jours à 4 ° C sans perte significative du signal FITC. Pour un stockage prolongé ajouter 0,09% Natrium-azide ou stocker à <-18 ° C.
   9. Pipeter 100 duolets ul des surnageants sur un noir plaque de 96 puits (Greiner Bio One, Frickenhausen, Allemagne). Pipette deux 100 échantillons pi de KHB comme vierge.
   10. Lire la plaque dans un lecteur de fluorescence (Safire, Tecan, Crailsheim, Allemagne) et de quantifier l'fluorescence à 494 nm (absorption) / 521 nm (émission) de longueur d'onde. Soustraire les valeurs à blanc des échantillons.
   11. Calculer le centre géométrique (GC) de FITC-dextran de distribution, qui est en fait le centre de gravité de la distribution des marqueurs, par la formule suivante: GC = Σ (% du signal de fluorescence totale par segment numéro de segment *) / 100

   Remarque: en multipliant le pourcentage de fluorescence de chaque segment avec son numéro de segment d'une moyenne pondérée de la distribution de marqueur à l'intérieur de l'intestin est évaluée. Ce point est influencée à la fois par la distribution et la distance parcourue par le marqueur, mais n'assume aucune distribution spécifique sous-jacente. ⁷ La valeur calculée GC est souvent présenté en combinaison avec un graphique montrant la répartition de FITC dextran sur le tractus gastro-intestinal (figure 1A).

2. Transit colique
   1. Les souris doivent être faiblement anesthésiés avec isoflurane 2% en oxygène. ATTENTION: Assurez-vous que l'animal va se réveiller à moins de 40 sec.
   2. Examinez attentivement la perméabilité colique par l'insertion d'une sonde de fistule (tige métallique, 2 mm de diamètre) par l'anus dans le côlon.
   3. Utilisation de la sonde fistule faire avancer une boule en verre de 2 mm 3 cm dans le colon et retirer la sonde immédiatement. Placez la souris dans une cage transparente et commencer à mesurer le temps au bout de la sonde fistule a été retiré du côlon. Gardez un oeil à la souris et arrêter le temps juste après la boule de verre est devenu excrété.

5. Analyse histochimique des spécimens isolés ME

1. Midjejunal segments sont découpés dans l'intestin et immergé dans KHB froid dans un plat rempli d'Sylgard.
2. Mésentère est épinglée sur le plat avec 0,2 mm d'insectes aiguilles (Outils Fine Science, Heidelberg, Allemagne).
3. Couper le segment long de sa frontière mésentérique et étirer à environ 120% de sa longueur et de la largeur. Finaliser la fixation des insectesbroches sur le site en face du mésentère. Rincer la capsule Sylgard soigneusement avec KHB glacée fraîche, ce qui chasse tout le contenu luminal.
   ME peut désormais séparé mécaniquement de la tunique muqueuse de départ du mésentère. Lors de la préparation remplacer fraîches réfrigérées KHB plusieurs fois.
4. Muqueuse séparé peut être un choc congelés dans l'azote liquide pour une analyse plus approfondie ou mis au rebut.
5. Fixer le montage isolé ME toute l'éthanol à 100% pendant 10 min à température ambiante.
   Lavez l'ensemble de montage à trois reprises avec KHB réfrigérés. Remarque: d'autres fixateurs (soit 4% de formaldéhyde, l'acide acétique, l'acétone) peut également être utilisé après avoir testé sa compatibilité avec l'analyse subséquente.
6. Les supports ME entières sont prêtes pour la coloration histochimique ou immunhistochemical plus loin:

1. Histochimie: myéloperoxydase (MPO) coloration
   PMN infiltrés peuvent être examinés par le protocole de coloration MPO suivante.
   1. Résoudre 10 mg Hanker Yates réactif (Polyscience Europe, Eppelheim, Allemagne) dans 10 ml KHB et ajouter 100 ul de 3% de H ₂ O _2. Préparer la solution fraîchement immédiatement avant l'utilisation et ne pas réutiliser.
   2. Incuber montures entières pendant 10 min à température ambiante.
   3. Rincer abondamment avec KHB spécimens froid et incuber pendant 10 min.
   4. Montez échantillons dans le milieu de montage aqueux (Aquatek, Merck, Darmstadt, Allemagne) Après séchage pendant 2 h à analyser diapositives sous un microscope optique.
   5. Compter le nombre de cellules dans 5 domaines choisis au hasard et calculer comme MPO cellules positives / mm ^2.
2. Coloration immunohistochimique:
   En conséquence de la coloration histochimique MPO, colorations immunohistochimiques des montures entières peuvent être effectuées. Principalement, vos protocoles établis coloration immunohistochimique de cultures cellulaires ou des tranches de tissu peut être facilement adapté à une coloration de montage ensemble. Cependant, l'optimisation de la procédure anti spécifiquecorps est fortement recommandé.
   1. Couper en morceaux les échantillons x 5 mm 5 et effectuer de coloration dans 2,0 ml rond tubes à centrifuger fond dans ~ 150 pl - 200 ul de solution d'anticorps.
   2. Fixation et blocage procédure (soit 3% de BSA dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante) peut être réalisée dans le «plat Sylgard".
   3. Les étapes de lavage dans du PBS ou d'autres tampons peuvent être effectuées dans des plaques 12 puits.
   4. Transférer les spécimens. Soigneusement avec une pince nettes entre les tubes et les plaques de coloration à laver.
   5. Après les spécimens lavage final dans la procédure de montage anti-décoloration milieu de montage avec lamelles et d'analyser au microscope à fluorescence.

6. Culture organe de ME

1. Tout l'intestin grêle est réséqué 24 heures après l'IM et placé dans KHB froide contenant 200 U / ml de pénicilline G et 100 pg / ml de streptomycine (KHB + P / S).
2. Couper le tube digestif en 3 cm de longueur et épingler chaque segment vers le bas pour un Sylgard contenant glaPlat art.
3. Retirez le mésentère avec des ciseaux fins et glisser l'intestin sur une aiguille à tricoter.
4. Doucement inciser le ME avec une pince forte et enlevez de la sous-muqueuse à l'aide d'un applicateur en coton humide. La tunique muqueuse reste sur l'aiguille à tricoter et peut être congelé pression pour complément d'enquête. La ME est collectée dans le froid KHB + P / S.
5. Couper les bandes isolées ME en petits morceaux de 2 à 4 mm de longueur et de la mettre à incuber dans la glace froide KHB + P / S pour une demi-heure et rincer le spécimen à plusieurs reprises.
6. Transférer environ 50-60 mg ME (au moins la moitié ME d'un intestin grêle) dans une solution stérile de 24 puits contenant 500 ul plaque de Dulbecco Eagle modifié (DMEM).
7. Incuber à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 24 heures Conditions supplémentaires.
8. Inspecter les cultures de cellules de contamination bactérienne ou fongique sous un microscope.
9. Recueillir le surnageant, ralentit pendant 5 min à 1000 rcf et refroidissement rapide dans l'azote liquide. Pendant ce temps de sécher le muscle tissu sur un tissu propre pendant 30 sec et le poids.
10. Les surnageants peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure des cytokines libérées (IL-6) par ELISA ou d'autres métabolites (c.-à-nitrite) dans le surnageant en suivant les instructions du fabricant.
11. Normaliser les concentrations mesurées en poids de tissus ME.

7. Les résultats représentatifs

1. Études fonctionnelles
   Le paramètre le plus important pour évaluer la gravité de POI est l'examen de GIT in vivo. Figure 1A montre une distribution typique de FITC dextran le long du tractus gastro-intestinal chez les témoins non traités et manipulés intestinale, souris 24 heures après la chirurgie. «Sham exploité" animaux ont montré un GIT normale avec un centre de calcul géométrique (GC) dans le caecum alors que IM a entraîné un retard significatif de GIT dans le jéjunum proximal (figure 1B)
   Motricité colique a été porté sur séparément par la mesure de la balle temps excrétion ofa 2 mm boule de verre. Une opération fictive souris montrent un temps d'excrétion de 48 - 200 sec tandis que IM a conduit à une excrétion prolongée de temps entre 470 à 775 sec (figure 1C).
2. Des études morphologiques
   Pour décrire l'inflammation s'étend à l'intérieur des phénotypes ME plusieurs de leucocytes pourraient être analysées à l'aide histochimie ou immunohistochimie. Dans la figure 2A + B une faible présence des PMN dans «opération fictive» des animaux a été observée (39 ± 7 cellules / mm ^2). IM de l'intestin grêle a conduit à une forte infiltration des PMN (660 ± 86 cellules / mm ²⁾ par rapport aux souris une opération fictive
3. Culture organes ME
   De nombreux médiateurs inflammatoires libérés par les cellules sont difficiles à détecter dans les lysats tissulaires. Des cultures d'organes de permettre la détection des médiateurs libérés dans le surnageant de culture. Un médiateur représentant POI est NON, qui est aussi un neurotransmetteur inhibiteur majeur dans le tractus gastro-intestinal. ⁵
   NO n'a pas pu être détecté dans des cultures d'organes MEsurnageants ture des animaux témoins non opérés (5 ± 6 uM / 24 h / mg de tissu). Dans une opération fictive (laparotomie) souris basale niveaux de NO de 53 ± 36 pM / 24 h / mg de tissus ont été observées. ME cultures de souris intestinale, manipulées (récoltées 24 heures après la chirurgie) produisent beaucoup plus de NO (2254 ± 853 pM / 24 h / mg de tissus) pendant 24 h de culture d'organes ME (figure 3).

Figure 1. Effet de la GI sur le GIT (A + B) et de transit colique (C) GIT a été mesurée en pour cent de la non-absorbable marqué à la fluorescéine dextrane dans 15 segments gastro-estomac (Sto), l'intestin grêle (SI 1-9 ), le caecum (Cec) et du côlon (Co) -90 min après l'ingestion. Transit colique a été mesurée par le temps de tirer sur la sonde jusqu'à ce que la fistule excrétion d'une perle de verre de 2 mm. (A) la distribution gastro-intestinales de l'isothiocyanate de fluorescéine dextran après imposture opération ou messagerie instantanée. Chez les animaux une opération fictive de plus le marqueur se trouve dans le caecum ou du côlon proximal par rapport à jéjunum proximal lieu chez les animaux manipulés. Les lignes en pointillé indiquent calculée GC. (B) Calcul de la GC fait preuve d'un ralentissement du transit gastro-intestinal après IM. (C) temps de transit colique a montré un retard significatif chez les souris de messagerie instantanée par rapport aux animaux une opération fictive. GC pour les 15 segments intestinaux sont affichés sous forme de moyenne (n = 5). Temps de transit colique ont été affichées signifie que toutes les valeurs individuelles (n = 6). *** = P <0,001, t de Student-test.

Figure 2. Détection de cellules MPO positifs au sein de l'intestin grêle ME. (A) ME montures entières ont été colorées avec Hanker Yates réactif pour la détection de MPO positifs PMN 24 heures après laparotomie (fictive) ou de la procédure IM. (B) Quantification des cellules positives MPO dans les 5 domaines choisis au hasard par la souris. n = 6 unnimals par groupe. *** = P <0,001, t de Student-test.

Figure 3. Production de NO dans les surnageants de culture de ME. Échantillons musculaires de contrôles non opérés, une opération fictive et souris GI ont été prises 24 heures après l'opération et cultivées pendant 24 heures. Souris non traitées ont montré qu'une très faible production basale de NO. Après laparotomie NO libération est augmentée sans mesurer des différences significatives entre le groupe témoin et souris témoins opérés. 24 heures après l'IM production de NO est considérablement augmenté par rapport à des souris non traitées ou fictive exploités. n = 5 animaux par groupe. *** = P <0,001, 1 ANOVA façon.

Discussion

Une étude comparative analysant les différents niveaux de GI (éventration intestin grêle pendant 10 minutes par rapport doucement l'inspection de l'intestin grêle au moyen de deux applicateurs en coton par rapport à la messagerie instantanée avec évacuation du contenu de l'intestin grêle dans le caecum) a révélé une corrélation entre l'ampleur de la manipulation chirurgicale et POI. En comparaison avec les autres groupes IM a montré la plus grande quantité de leucocytes dans le ME (PNM, le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif / Equipement	Entreprise	Numéro de catalogue
Ethilon 5/0	Ethicon	1666H
Applicateurs en coton	Estropié	71010
Cathéter artériel	Vygon	115-798
Plaque de 96 puits (noir)	Greiner Bio One	655096
boule de verre (2 mm de diamètre)	Worf	sur demande
Broches insectes	Outils Fine Science	26000-25
Hanker Yates réactif	Polyscience	560694
Aquatek	Merck	HC109850
DMEM	Lonza	BE12-604 F
FITC-dextran (PM 70000)	Sigma Aldrich	46945-500MG-F