ניתוח הדמיה של תא עצב לאינטראקצית גליה בפלטפורמת תרבות Microfluidic (MCP)-מבוסס אקסון העצבי ומערכת גליה שיתוף תרבות

Summary

מחקר זה מתאר את ההליכים של הקמת אקסון עצבי רומן ופלטפורמה (אסטרו) גליה שיתוף תרבות. במערכת זו שיתוף התרבות, מניפולציה של אינטראקציה ישירה בין האקסון יחיד (ותאי גלייה יחידים) הופכת להיות ריאלית, המאפשרת ניתוח מכניסטית של נוירון ההדדי לאיתות גליה.

Abstract

נוירון הנכון לאינטראקצית גליה הוא קריטי לתפקוד פיסיולוגי של מערכת העצבים המרכזית (CNS). תקשורת דו כיוונית זו מתווכת על ידי מתוחכמת מסלולי איתות ספציפיים בין תא העצב ^ו1,2 גליה. זיהוי ואפיון של מסלולי האיתות הללו חיוניים להבנה של איך נוירון לפיזיולוגית CNS צורות אינטראקצית גליה. בעבר, תרבויות נוירון וגליה המעורבות כבר נוצל באופן נרחב לבדיקה ואפיון מסלולי איתות בין תא העצב וגליה. מה למד מהכנות ואחרות אלה בכלי vivo, לעומת זאת, הציע כי איתות הדדית בין תא עצב וגליה שאירעה לעתים קרובות בתאים ספציפיים בתוך הנוירונים (כלומר, אקסון, דנדריט, או סומא) ^3. זה עושה את זה חשוב לפתח מערכת תרבות חדשה המאפשרת פרדה של תאים עצביים ובמיוחד בוחן את האינטראקציה בין גליה ונוירואקסונים / דנדריטים nal. בנוסף, מערכת התרבות המעורבת הקונבנציונלית אינה מסוגלת להבדיל את הגורמים המסיסים ואותות קשר ישירים בין קרום תא העצב וגליה. יתר על כן, הכמות הגדולה של תאי עצב ותאי גליה במערכת הקונבנציונלית שיתוף התרבות חסרת רזולוצית הצורך לקיים אינטראקציה בין האקסון אחת ותא גליה.

במחקר זה, אנו מתארים מערכת גליה שיתוף תרבות האקסון רומן ועם השימוש בפלטפורמת תרבות microfluidic (MCP). במערכת זו שיתוף התרבות, נוירונים ותאי גלייה מתורבתים בשני חדרים נפרדים המחוברים באמצעות ערוצים מרכזיים מרובים. במצע תרבות microfluidic זה, רק תהליכים עצביים (בעיקר אקסונים) יכולים להיכנס לצד גליה בערוצים המרכזיים. בשילוב עם תיוג חלבון פלואורסצנטי חזק, מערכת זו מאפשרת חקירה ישירה של מסלולי איתות בין אינטראקציות axonal / הדנדריטים וגליה, כגוןרגולציה של האקסון בתיווך בתעתיק גליה סחר, גליה בתיווך הקולטן במסופים עצביים, וצמיחת האקסון גליה בתיווך. הקוטר הצר של החדר גם אוסר באופן משמעותי את הזרימה הבינונית נוירון המועשר לתא גלייה, בהנחיית חיטוט אינטראקצית קרום החלבון הישיר בין האקסונים / דנדריטים ומשטחי גליה.

Protocol

1. אסיפה של לשכת תרבות Microfluidic (MCP)

1. MCP (1 איור) הם תאים פתוחים המיועדים לתרבויות מחולקות לסוגים שונים של תאים ^4. זה בדרך כלל יש שני תאים המחוברים באמצעות הערוצים המרכזיים (3 מיקרומטר בקוטר). הרכבה של MCP עם מנות עם רצפת זכוכית היא הכרחית להכנת תרבויות וניתוח הדמיה שלאחר מכן.
2. ראשית, מנות סטריליים מעייל עם רצפת זכוכית עם Polyornithine (סיגמה אולדריץ, 1 מ"ג / מ"ל) מומסות tetraborate נתרן (סיגמה אולדריץ, 10 המ"מ pH 8.5) והודגרו למשך הלילה ב 37 ° C.
3. ביום למחרת, את הכלים המצופים רצפת זכוכית נשטפו שלוש פעמים עם DDH ₂ O והתייבשו תחת מנדף סטרילי. המנות עם רצפת הזכוכית היו אז עוד יותר מצופות עם laminin (סיגמה אולדריץ, 1 מ"ג / מ"ל) והתייבש תחת אור UV במשך שעה 1. מנות מצופות מוכנות לשימוש או שניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. אלה ציפוימחדש נחוץ לנוירונים ציפוי והאסטרוציטים בשיתוף התרבות.
4. כדי להרכיב את פלטפורמת התרבות, פלטפורמות תרבות microfluidic הונחו על גבי הכלים המצופים רצפת הזכוכית עם ערוצי חיבור מרכזיים בצד התחתון שלו כדי ליצור חותם חזק. נוירון הרגיל או מדיומי התרבות astrocyte נוספו (מאזורי הציפוי הסלולריים) משני הצדדים (איור 1) לMCP התאסף ודגר 2-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס, על מנת להבטיח שאין דליפה בין MCP והזכוכית צלחת תחתית. בדקנו עם מדיום לפני תאי ציפוי על מנת להבטיח שאין דליפה. ההרכבה של MCP על צלחת זכוכית בעל תחתית צריכה להיות מוכנה טרי לפני השימוש.

2. הכנה של תרבות ואינדוקציה העצביות של האקסונים עצביים בMCP Assembled

1. תרביות תאים עצביות בקליפת המוח היו מוכנות טריה 14-16 מוח עכבר בני יום עוברי. מדיום תרבות נוירון מורכב מבינוני neurobasal, 2% B27 neurobasaתוסף הליטר, 2 מ"מ גלוטמין ידי הוספת 1% מ100x GlutaMAX, ו1% פניצילין-streptomysin. בעקבות נתיחה של מוח העכבר, קרומי המוח הוסרו מהקליפה תחת מיקרוסקופ לנתח. הרקמה הייתה אז קצוצות בסכין גילוח כדי להפוך בלוקים קטנים של רקמה על מנת להגדיל את שטח הפנים החשופים לטריפסין. לוקי רקמות היו trypsinized (סיגמא אולדריץ, טריפסין 0.05%) למשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן ניתק בעדינות על ידי טחינה דקה עם פיפטה פסטר אש מלוטשת. תאים ניתקו סוננו דרך מסננת מיקרומטר 70 לאסוף השעית תא עצבית ברורה.
2. הנוירונים (2-3 x 10 ⁶ / מ"ל, 150 μl) היו מצופים על אזורי הציפוי הסלולריים בצד ימין (איור 1) של MCP הורכב כך שנוירונים יכולים לצרף באזור החזקת התא (איור 1). הנוירונים טריים מוכנים היו מצופים בינוני ציפוי תא עצב אשר היא השלים עם 5% בסרום שור עוברי (Hyclone) להתקנותמדיום תרבות נוירון r. מפני שרק הנוירונים המחברים את האזור בהחזקת התא מסוגלים לגדול אקסונים לצד השני של MCP התאסף בערוצים מרכזיים, חשוב לצפיפות גבוהה צלחת של נוירונים באזור ציפוי התא על מנת להבטיח מספיק נוירונים מחוברים תא שטח שייר. תמונה מייצגת של צפיפות גבוהה של האקסונים עצביים מוצגת באיור 2 א.
3. ביום למחרת, בינוני ציפוי נוירון הוחלף על ידי התרבות הבינונית נוירון הרגיל. בינוני שינוי בוצע על ידי aspirating הבינוני בזהירות מאזור תא הציפוי של החדר, אבל לא מאזור החזקת התא של MCP התאסף, כדי למנוע בועות אוויר באזור החזקת התא ומחברים את הערוצים המרכזיים. בועות אוויר תהיינה קשות לדכא את תולדת האקסון והכניסה הבאה לערוצים המרכזיים בMCP. גורם גליה תאים נגזר neurotrophic (GDNF, 10-20 ng / ml) הוסיף גם בצד השני (משמאל)של החדר באותו היום כדי להקל על הגיוס של תולדת האקסון ⁵ מהצד והצלב העצבי בערוצים מרכזיים של MCP כנס (איור 2 א). כמות נכבדה של תולדת neurite ספונטנית ללא GDNF הוא ציין גם מהצד הנגדי והעצבי בערוצים מרכזיים של MCP כנס. אקסונים הנכנסים לתוך הערוץ המרכזי לעתים קרובות נצפו 2-3 ימים לאחר ציפוי. ברגע שייכנסו לאקסונים הערוץ המרכזי, שהם בדרך כלל להיכנס לצד השני בתוך יום אחד. האקסונים הם בדרך כלל ללא פגע במשך שבוע אחד לפחות לאחר הכניסה לצד השני.

3. תוספת של האסטרוציטים מתורבתים לMCP להקים מערכת ממודרת שיתוף תרבות

תרבויות astrocyte העיקריות הוכנו ממוח גור P1-3 עכבר. הליך ניתוק המוח דומה להליך בידוד התא העצבי שתואר לעיל. האסטרוציטים היו מצופים הראשון לתוך צלחת 10 סנטימטרים שהיו מראשמצופים עם Polyornithine (סיגמה אולדריץ, 1 מ"ג / מ"ל). מדיום תרבות astrocyte (DMEM, 10% בסרום שור עוברי, 1% פניצילין-streptomysin) שונה בכל יום במשך הימים הבאים כדי להסיר את הפסולת. אחרי זה, המדיום היה שונה כל שלושה ימים.

1. האסטרוציטים הופכים confluent 90% ויוצרים monolayer לאחר 7 ימים. האסטרוציטים confluent היו trypsinized ו150 μl של האסטרוציטים מחדש מושעים-(1x10 ⁶ / מ"ל) היו מצופים מחדש, לאזור ציפוי התא של הצד השמאלי של MCP התאסף כאשר האקסונים עומדים להיכנס, או סתם נכנסו בצד השמאל של התאסף MCP. האסטרוציטים בדרך כלל מצופים 4-5 ימים לאחר את הנוירונים היו מצופים. GDNF הוסר ראשון לפני הציפוי מחדש של האסטרוציטים לצד השמאל של MCP. האסטרוציטים העניין מצופים היו צמודים באזור החזקת התא, כפי שמוצגים על ידי immunostaining GFAP (איור 1). רק זרימה מינימאלית של מדיום בין שני הצדדים של התאים (הנקבע על ידי הקרינה דכן) נמצא בMCP, כפי שמוצג ^4,6 בעבר.
2. האסטרוציטים הופכים confluent 90% ויוצרים monolayer לאחר 7 ימים. האסטרוציטים confluent היו trypsinized ו150 μl של האסטרוציטים מחדש מושעים (1-x 10 ⁶ / מ"ל) היו מצופים מחדש, לאזור ציפוי התא של הצד השמאלי של MCP התאסף כאשר האקסונים עומדים להיכנס, או פשוט נכנס מהשמאל צד של MCP כנס. האסטרוציטים בדרך כלל מצופים 4-5 ימים לאחר את הנוירונים היו מצופים. GDNF הוסר ראשון לפני הציפוי מחדש של האסטרוציטים לצד השמאל של MCP. האסטרוציטים העניין מצופים היו צמודים באזור החזקת התא, כפי שמוצגים על ידי immunostaining GFAP (איור 1). רק זרימה מינימאלית של מדיום בין שני הצדדים של התאים (הנקבע על ידי צבעי קרינה) נמצאה בMCP, כפי שמוצג ^4,6 בעבר.
3. לאחר הציפוי מחדש של האסטרוציטים, האקסונים שנכנסו לצד השמאל של MCP התאסף ישירות אינטראקציה עם astrocytes ידי או מגע ישיר אקסונלית או שחרור של גורמים מסיסים. Immunostaining של GLT1 astroglial פלזמת הקרום גלוטמט טרנספורטר וβIII-טובולין העצבי בוצע כדי להמחיש את האינטראקציה בין אקסונים ואת האסטרוציטים, כפי שמוצג באיור 2D-F.

תוצאות

ניתוח זמן לשגות הדמיה של הפעלת אמרגן האקסון המושרה GLT1 בהאסטרוציטים

מערכת astrocyte שיתוף תרבות נוירון והמחולק מאפשר רק את התהליכים העצביים, בעיקר אקסונים, באופן סלקטיבי אינטראקציה עם האסטרוציטים. בעקבות ההקמה המוצלחת של האקסון ו( או ת...

Discussion

האסטרוציטים מערכת שיתוף תרבות נוירון מבוסס MCP ומאפשר נתיחה של נוירון המפורט למסלולי astroglia איתות שהיא מאפשרת רק את האקסונים עוברים בערוצים המרכזיים ואינטראקציה עם תאי astroglial. מערכת זו שיתוף התרבות ניתן להגדיר בנוחות עם נוירון הקונבנציונלי ונהלי התרבות astrocyte. אנחנו גם ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
סרום שור עוברי	Hyclone	SH30070.03	לציפוי נוירון לנוירון בינוני cutlure
סרום שור עוברי	סיגמה אולדריץ	F4135	למדיום התרבות astrocyte
גורם עצבי נובע גליה	מו"פ מערכות	212-GD	החל 10-20 ng / ml לצד עצב של קאמרי
Dulbecco modified נשר בינוני גלוקוז גבוה	סיגמה אולדריץ	11995
מסננת תא 70 מ"מ	BD פלקון	352350
צלחת תחתית זכוכית סטרילית	מאטק תאגיד
פלטפורמות התרבות microfluidic	Xona מיקרופלואידיקה LLC	SND150
6 בארות של צלחת התרבות	Cellstar	657 160
			מדיום תרבות Neuron בינוני Neurobasal 2% B27 תוסף Neurobasal גלוטמט 2 מ"מ על ידי הוספת 1% 100x GlutaMAX 1% פניצילין-streptomysin
			מדיום תרבות נוירון לתא ציפוי בינוני Neurobasal 2% B27 תוסף Neurobasal גלוטמט 2 מ"מ על ידי הוספת 1% 100x GlutaMAX 1% פניצילין-streptomysin 5% בסרום שור עוברי SH30070.03
			מדיום התרבות astrocyte Dulbecco modified eaרמת סוכר גבוה בינונית gle 10% עוברי שור בסרום F4135 1% פניצילין-streptomysin
			לוח 1. חומרים בשימוש במערכת גליה שיתוף תרבות האקסון microfluidic התרבות מבוססת פלטפורמה והעצבית.