Analyse en Imagerie du Neuron à l'interaction Glia dans la plate-forme microfluidique Culture (MCP) à base neuronale et Axon Glia co-culture système

Résumé

Cette étude décrit les procédures de mise en place d'un axone des neurones et roman (astro) glie plate-forme de co-culture. Dans ce système de co-culture, la manipulation de l'interaction directe entre un axone unique (et unique cellule gliale) devient possible, ce qui permet une analyse mécaniste du neurone mutuelle à la signalisation gliales.

Résumé

Neurone propre à l'interaction glie est essentielle à la fonction physiologique du système nerveux central (SNC). Cette communication bidirectionnelle est subtilement médiée par les voies de signalisation spécifiques entre les neurones et les cellules gliales ^1,2. L'identification et la caractérisation de ces voies de signalisation est essentielle à la compréhension de la façon dont l'interaction neurone glie formes physiologie du système nerveux central. Auparavant, des cultures de neurones et de cellules gliales mixtes ont été largement utilisés pour tester et caractériser les voies de signalisation entre les neurones et les cellules gliales. Ce que nous avons appris de ces préparations et autres outils in vivo, cependant, a suggéré que la signalisation mutuelles entre neurones et cellules gliales sont souvent produits dans des compartiments spécifiques à l'intérieur des neurones (c.-à axones, dendrites, ou soma) ^3. Il est donc important de développer un nouveau système de culture qui permet la séparation des compartiments neuronaux et étudie spécifiquement l'interaction entre les cellules gliales et neuroaxones internes / dendrites. En outre, le système de culture conventionnel mixte n'est pas capable de différencier les facteurs solubles et directs signaux de contact membranaire entre les neurones et les cellules gliales. En outre, la grande quantité de neurones et des cellules gliales dans le classique système de co-culture n'a pas la résolution nécessaire pour observer l'interaction entre un axone unique et une cellule gliale.

Dans cette étude, nous décrivons une nouvelle axone et les cellules gliales du système de co-culture avec l'utilisation d'une plate-forme microfluidique culture (MCP). Dans ce système de co-culture, les neurones et les cellules gliales sont cultivées dans deux chambres séparées qui sont connectées par le biais de plusieurs canaux centraux. Dans cette plate-forme microfluidique la culture, seuls les processus neuronaux (en particulier les axones) peut entrer dans le côté gliale à travers les canaux centraux. En combinaison avec marquage des protéines fluorescentes puissant, ce système permet un examen direct des voies de signalisation entre les interactions axonales / dendritiques et des cellules gliales, une telles axone médiée par la régulation transcriptionnelle dans les cellules gliales, les cellules gliales trafic des récepteurs induite dans les terminaux de neurones, les cellules gliales et médiée par la croissance axonale. Le petit diamètre de la chambre également interdit de manière significative l'écoulement du fluide enrichi en neurone dans la chambre gliale, facilitant palpage de la protéine membranaire directe interaction entre les axones / dendrites et les surfaces gliales.

Protocole

1. Assemblée de la Chambre Culture microfluidique (MCP)

1. MCP (figure 1) sont conçus pour les chambres ouvertes cultures compartimentées de différents types de cellules ^4. Il a généralement deux compartiments qui sont reliés par les canaux centraux (3 m de diamètre). Assemblée des MCP avec fond de verre plats est nécessaire pour la préparation de cultures et d'analyse d'images ultérieur.
2. Tout d'abord, manteau stériles à fond de verre plats de polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) dissous dans le tétraborate de sodium (Sigma-Aldrich, 10 mM, pH 8,5) et on a incubé une nuit à 37 ° C.
3. Le lendemain, les enduits à fond de verre plats ont été lavés trois fois avec ddH ₂ O et séché sous la hotte stérile fumées. Les plats à fond de verre ont ensuite été en outre revêtues de laminine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) et séché sous lumière UV pendant 1 heure. Plats couchés sont prêts à l'emploi ou peut être conservé à -20 ° C jusqu'à utilisation. Ce revêtement d'unre nécessaire pour les neurones et les astrocytes de placage dans la co-culture.
4. À assembler la plate-forme de la culture, les plates-formes de culture microfluidiques ont été placés au-dessus des enduits à fond de verre plats centraux avec des canaux de liaison sur son côté inférieur pour former un joint étanche. Neurone régulière ou milieux de culture d'astrocytes ont été ajoutées (des zones de placage de cellules) sur les deux côtés (figure 1) dans le MCP assemblé et mis à incuber pendant 2-4 heures à 37 ° C, pour s'assurer qu'il n'ya pas de fuite entre le MCP et le verre Plat à fond. Nous avons testé avec support avant étalement des cellules pour s'assurer qu'il n'y ait pas de fuite. L'assemblage de MCP sur le plat à fond de verre doit être fraîchement préparée avant utilisation.

2. Préparation de la culture neuronale et induction de axones neuronaux en assemblée MCP

1. Cultures de cellules neuronales corticales ont été fraîchement préparés à partir de cerveaux de souris embryonnaires 14-16 jours d'âge. Le milieu de culture neurone est composé du milieu neurobasal, 2% B27 neurobasaSupplément l, 2 mM de glutamine en ajoutant 1% de Glutamax 100x, et 1% de pénicilline-streptomysin. Après dissection du cerveau de la souris, les méninges a été retiré du cortex sous la loupe binoculaire. Le tissu est ensuite haché avec une lame de rasoir pour faire les petits blocs de tissus en vue d'augmenter l'aire de surface exposée à la trypsine. Blocs de tissus ont été traitées à la trypsine (Sigma-Aldrich, la trypsine 0,05%) pendant 10 min dans un bain à 37 ° C de l'eau, puis dissociées par trituration doucement avec une pipette Pasteur polie au feu. Les cellules dissociées sont filtrées à travers un filtre 70 microns pour recueillir clair suspension cellulaire neuronale.
2. Neurones (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 pi) ont été étalées sur les zones de placage de cellules sur le côté droit (figure 1) de la MCP assemblés de sorte que les neurones peuvent joindre dans la zone de rétention cellulaire (Figure 1). Neurones fraîchement préparés ont été étalées avec un milieu de placage neurone qui est supplémenté avec 5% de sérum fœtal bovin (Hyclone) dans la réglementationmilieu de culture neurone r. Parce que seuls les neurones qui se fixent dans la zone de rétention des cellules sont capables de croître axones vers l'autre côté de l'assemblée MCP par les voies centrales, il est important de densité élevée plaque de neurones dans la zone de placage cellulaire pour assurer suffisamment de neurones sont attachés à la cellule de zone de rétention. Une image représentative de la densité élevée des axones neuronaux est représenté sur la figure 2A.
3. Le jour suivant, le milieu d'étalement neurone a été remplacé par du milieu de culture neurone régulière. Milieu changeant a été soigneusement réalisé par aspiration du milieu de la zone de placage cellule de la chambre, mais pas de la zone de retenue de cellules de la MCP assemblés, afin d'éviter les bulles d'air dans la zone de retenue de cellules et les canaux centraux de liaison. Bulles d'air fortement inhiber la croissance axonale et l'entrée subséquente dans les canaux centraux de la MCP. Cellules gliales facteur neurotrophique dérivé de cellules (GDNF, 10-20 ng / ml) a été ajoutée à l'autre (gauche)de la chambre le même jour pour faciliter l'induction de la croissance axonale ⁵ de la partie neuronale et traverser les canaux centraux de l'assemblée MCP (figure 2A). Mal de la croissance des neurites spontanée sans GDNF est également observé de côté neuronale et transversale à travers les canaux centraux de la MCP assemblé. Les axones qui entrent dans le canal central sont souvent observées 2-3 jours après placage. Une fois que les axones entrer dans le canal central, ils entrent habituellement dans l'autre en une journée. Les axones sont normalement intactes pendant au moins une semaine après la saisie de l'autre côté.

3. Outre une culture d'astrocytes à MCP pour établir une co-culture compartimentée système

Cultures primaires d'astrocytes ont été préparés à partir du cerveau de la souris P1-3 chiot. La procédure de dissociation cerveau est similaire à la procédure d'isolement de cellules neuronales décrit ci-dessus. Les astrocytes ont d'abord été étalées dans des boîte de 10 cm qui ont été préRevêtu de polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Le milieu de culture des astrocytes (DMEM, 10% de sérum de veau fœtal, 1% de pénicilline-streptomysin) a été changé tous les jours pendant les deux prochains jours pour enlever les débris. Après cela, le milieu a été changé tous les trois jours.

1. Astrocytes deviennent confluentes et 90% d'une monocouche après 7 jours. Astrocytes confluentes ont été traitées à la trypsine et 150 ul de re-suspension des astrocytes (1x10 ⁶ / ml) ont été ré-étalées dans la zone de placage cellule du côté gauche de l'assemblée GPE lorsque les axones sont sur ​​le point d'entrer ou venez d'entrer dans le côté gauche de l'assemblée MCP. Les astrocytes sont généralement plaquées 4-5 jours après que les neurones étaient plaqués. GDNF a été éliminée avant la première ré-plaquage des astrocytes dans le côté gauche de la MCP. Re-plaqué astrocytes ont été fixés dans le domaine de la conservation de cellules, comme le montre l'immunomarquage GFAP (Figure 1). Seulement un débit minimal de fluide entre les deux côtés des chambres (déterminée par fluorescence doui) a été trouvé dans le MCP, comme indiqué précédemment ^4,6.
2. Astrocytes deviennent confluentes et 90% d'une monocouche après 7 jours. Astrocytes confluentes ont été traitées à la trypsine et 150 ul de re-suspension des astrocytes (1 x 10 ⁶ / ml) ont été ré-étalées dans la zone de placage cellule du côté gauche de l'assemblée GPE lorsque les axones sont sur ​​le point d'entrer ou venez d'entrer dans la gauche côté de l'assemblée MCP. Les astrocytes sont généralement plaquées 4-5 jours après que les neurones étaient plaqués. GDNF a été éliminée avant la première ré-plaquage des astrocytes dans le côté gauche de la MCP. Re-plaqué astrocytes ont été fixés dans le domaine de la conservation de cellules, comme le montre l'immunomarquage GFAP (Figure 1). Seulement un débit minimal de fluide entre les deux côtés des chambres (déterminé par des colorants de fluorescence) a été trouvé dans le MCP, comme précédemment indiqué ^4,6.
3. Après le re-dépôt des astrocytes, les axones qui sont entrées dans la partie gauche de la MCP assemblé interagir directement avec le astrocytes par axonale soit un contact direct ou libération de facteurs solubles. Immunomarquage de la membrane plasmique GLT1 astrogliale glutamate transporteur et neuronale βIII-tubuline a été réalisée afin de visualiser l'interaction entre les axones et les astrocytes, comme le montre la figure 2D-F.

Résultats

L'analyse d'imagerie time-lapse de l'activation induite par axone promoteur GLT1 dans les astrocytes

Le neurone compartimenté et co-culture d'astrocytes système ne permet que les processus neuronaux, notamment des axones, d'interagir sélectivement avec les astrocytes. Suite à la mise en place réussie de l'axone et des astrocytes (cellules gliales ou d'autres) co-culture dans l'assemblée des MCP, différents types d'interactions axone-cellules gliales pe...

Discussion

Le MCP neurone base et les astrocytes du système de co-culture de neurones permet dissection détaillée de astroglies voies de signalisation en n'autorisant que les axones passent les canaux centraux et interagissant avec les cellules astrocytaires. Ce système de co-culture peut être facilement mis en place avec des neurones classiques et des procédures de culture d'astrocytes. Nous avons également décrit une application pratique de ce système de co-culture en employant un journaliste eGFP base pour dém...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sérum de veau fœtal	Hyclone	SH30070.03	pour le placage neurone neurone à moyen cutlure
Sérum de veau fœtal	Sigma-Aldrich	F4135	pour un milieu de culture des astrocytes
Gliale facteur de nerf dérivée	R & D systèmes	212-GD	Appliquer 10-20 ng / ml à côté de la chambre de neurone
Dulbecco modifié Eagle milieu glucose à haute	Sigma-Aldrich	11995
70 mm tamis cellulaire	BD Falcon	352350
Stérile à fond de verre plat	MatTek Corporation
Plates-formes de culture microfluidiques	Xona Microfluidique LLC	SND150
6 puits de la plaque de culture	Cellstar	657 160
			Milieu de culture neurone Milieu Neurobasal 2% supplément B27 Neurobasal 2 mM de glutamate en ajoutant 1% 100x Glutamax 1% de pénicilline-streptomysin
			Milieu de culture cellulaire neurone pour placage Milieu Neurobasal 2% supplément B27 Neurobasal 2 mM de glutamate en ajoutant 1% 100x Glutamax 1% de pénicilline-streptomysin 5% de sérum fœtal bovin SH30070.03
			Milieu de culture des astrocytes Dulbecco modifié eagle de glucose moyen-élevé 10% de sérum bovin fœtal F4135 1% de pénicilline-streptomysin
			Matériaux tableau 1. Utilisés dans la culture à base de plate-forme microfluidique axone des neurones et cellules gliales du système de co-culture.