Imaging Analyse von Neuron zu Glia Interaktionen in Microfluidic Kultur Platform (MCP)-basierte Neuronale Axon und Glia Co-Kultur-System

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt die Verfahren für die Einrichtung einer neuartigen neuronalen Axon und (astro) Glia Co-Kultur-Plattform. Auf diese Co-Kultur-System wird Manipulation direkte Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon (und einzigen Gliazelle) durchführbar ist, so dass mechanistischen Analyse des gegenseitigen Neuron zu glialen Signalisierung.

Zusammenfassung

Ordnungsgemäße Neuron zu Glia-Wechselwirkung ist entscheidend für physiologische Funktion des zentralen Nervensystems (ZNS). Diese bidirektionale Kommunikation wird raffiniert durch spezifische Signalwege zwischen Neuron und Glia ^1,2 vermittelt. Identifizierung und Charakterisierung dieser Signalwege ist wesentlich für das Verständnis, wie Neuron zu Glia-Wechselwirkung Formen CNS Physiologie. Zuvor haben Neuron und Glia Mischkulturen weithin zum Testen und Charakterisieren Signalwege zwischen Neuronen und Glia ausgenutzt. Was wir von diesen Präparaten und anderen Werkzeugen in vivo gelernt hat jedoch vorgeschlagen, dass die gegenseitige Signalisierung zwischen Neuronen und Glia häufig in speziellen Kompartimenten innerhalb von Neuronen (dh Axon, Dendrit oder Soma) ³ aufgetreten ist. Daher ist es wichtig, eine neue Kultur System, Trennung der Fächer ermöglicht neuronalen Entwicklung und speziell untersucht die Wechselwirkung zwischen Glia und neuronal Axone / Dendriten. Darüber hinaus ist das herkömmliche System Mischkultur nicht fähig Differenzieren der löslichen Faktoren und direkte Membrankontakt Signalen zwischen Neuronen und Gliazellen. Außerdem fehlt die große Menge von Neuronen und Gliazellen im herkömmlichen Co-Kultursystem die Auflösung notwendig, die Wechselwirkung zwischen einem einzelnen Axon und einer Gliazelle beobachten.

In dieser Studie beschreiben wir eine neue Axone und Glia Kokultur System mit der Verwendung eines mikrofluidischen Kulturplattform (MCP). Auf diese Co-Kultur-System sind Neuronen und Gliazellen in zwei getrennte Kammern, die durch mehrere zentrale Kanäle angeschlossen sind, kultiviert. In diesem mikrofluidischen Kultur-Plattform, kann nur neuronale Prozesse (insbesondere Axone) die Gliazellen Seite durch den zentralen Kanälen geben. In Kombination mit leistungsfähigen fluoreszierendes Protein Etikettierung, ermöglicht dieses System eine direkte Untersuchung von Signalwegen zwischen axonalen / dendritischen und Glia Interaktionen, eine solches Axon-vermittelten Transkriptionsregulation in Glia, Glia-vermittelte Rezeptor-in neuronalen Terminals und Glia-vermittelten Axon Wachstum. Die schmalen Durchmesser der Kammer ebenfalls signifikant verbietet die Strömung des Neurons angereicherten Mediums in die Kammer gliale, Erleichterung Sondieren des direkten Membran-Protein-Wechselwirkung zwischen Axone / Dendriten und glialen Oberflächen.

Protokoll

Ein. Versammlung der Mikrofluidik Kultur Kammer (MCP)

1. MCP (Abbildung 1) offenen Kammern für kompartimentierten Kulturen verschiedener Zelltypen ⁴ ausgebildet ist. Es hat typischerweise zwei Abteile, die durch die mittleren Kanäle (3 um im Durchmesser) verbunden sind. Versammlung des MCP mit Glasboden-Gerichte ist zur Vorbereitung Kulturen und anschließende Bildanalyse.
2. Erstens Mantel sterilen Glasbodengondel Gerichte mit Polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) in Natriumtetraborat (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) gelöst und über Nacht bei 37 ° C inkubiert
3. Am folgenden Tag wurden die beschichteten Glasboden Gerichte dreimal mit ddH ₂ O gewaschen und getrocknet unter der sterilen Abzug. Die Glasbodengondel Schalen wurden dann weiter mit Laminin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) gewaschen und unter UV-Licht 1 Stunde. Beschichtete Platten sind gebrauchsfertig oder können bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert werden. Diese Beschichtung eineswieder notwendig, für die Beschichtung Neuronen und Astrozyten in der Co-Kultur.
4. Die Kultur Plattform zusammenzubauen, wurden mikrofluidischen Kultur Plattformen auf der beschichteten Glasbodengondel Gerichte mit zentralen Verbindungskanäle an seiner Unterseite angeordnet, um eine Abdichtung zu bilden. Regelmäßige Neuron oder Astrozyten Nährböden wurden zugesetzt (von den Zell Plattierungsflächen) auf beiden Seiten (Fig. 1) in der zusammengebauten MCP und inkubiert für 2-4 Stunden bei 37 ° C, um sicherzustellen, dass keine Undichtigkeit zwischen MCP und dem Glas- Boden Gericht. Wir haben mit Medium vor dem Plattieren Zellen getestet, um sicherzustellen, dass kein Leck. Die Montage der MCP auf dem Glasboden-Gericht sollte vor Gebrauch frisch hergestellt werden.

2. Vorbereitung neuronaler Kultur und Induktion der neuronalen Axonen in Assembled MCP

1. Kortikalen neuronalen Zellkulturen wurden frisch aus embryonalen 14-16 Tage alten Maus Gehirn vorbereitet. Das Neuron Kulturmedium Neurobasalmedium, 2% B27 neurobasa zusammenl Ergänzung, 2 mM Glutamin durch Zugabe von 1% der 100x GlutaMAX und 1% Penicillin-streptomysin. Nach Dissektion der Maus Gehirn, wurde die Meningen aus der Rinde unter dem Binokular entfernt. Das Gewebe wurde dann mit einer Rasierklinge zu kleinen Blöcken Gewebe zu machen, um den Oberflächenbereich zu erhöhen ausgesetzt Trypsin zerkleinert. Tissue Blöcke wurden trypsiniert (Sigma-Aldrich, 0,05% Trypsin) für 10 min in einem 37 ° C Wasserbad und anschließend dissoziiert leicht durch Verreiben mit einem feuerpolierte Pasteur Pipette. Dissoziierten Zellen wurden durch eine 70 um Sieb gefiltert, um klare neuronalen Zellsuspension zu sammeln.
2. Neuronen (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 ul) wurden auf die Plattierungsflächen Zelle auf der rechten Seite (Figur 1) des zusammengebauten MCP ausplattiert so daß Neuronen in der Zelle Retentionsbereich (Abbildung 1) befestigen kann. Frisch hergestellten Neuronen wurden mit Neuron Plattierungsmedium, welches mit 5% fötalem Rinderserum (Hyclone) in die Regulierung wird ausplattiertr Neuron Kulturmedium. Da nur die Neuronen, die in der Zelle Retentionsbereich befestigen können Axone in die andere Seite des zusammengebauten MCP durch zentrale Kanäle wachsen, ist es wichtig zu Platte hoher Dichte von Neuronen in der Zelle zu gewährleisten, Plattierungsfläche genug Neuronen zur gebunden sind Zellrückhaltung Bereich. Ein repräsentatives Bild von hoher Dichte von neuronalen Axonen ist in 2A gezeigt.
3. Am folgenden Tag wurde das Neuron Plattierungsmedium durch die regelmäßige Neuron Kulturmedium ersetzt. Ändern Medium wurde durch vorsichtiges Absaugen des Mediums von der Zelle Plattierungsfläche der Kammer erreicht, aber nicht aus der Zelle Retentionsbereich des zusammengebauten MCP., Um Luftblasen in der Zelle Retentionsbereich und den zentralen Verbindungskanäle vermeiden Luftblasen stark hemmen das Axon Auswuchs und anschließenden Eintritt in die zentralen Kanäle in der MCP. Glial-cell derived neurotrophic factor (GDNF, 10-20 ng / ml) wurde auch auf der anderen (linken) Seite angefügtder Kammer am selben Tag um die Induktion von Axon Auswuchs ⁵ aus dem neuronalen Seite und quer durch zentralen Kanäle der versammelten MCP (2A) zu erleichtern. Angemessene Menge der spontanen Neuritenwachstum ohne GDNF wird ebenfalls aus dem neuronalen Seite und quer durch zentralen Kanäle der zusammengebauten MCP beobachtet. Axone, die in den zentralen Kanal geben sind oft 2-3 Tage nach dem Ausplattieren beobachtet. Sobald die Axone in den zentralen Kanal geben, sie in der Regel geben die andere Seite innerhalb eines Tages. Axone sind normalerweise für mindestens eine Woche nach der Eingabe des intakten anderen Seite.

3. Zugabe von Astrozyten zu MCP eine unterteilte Co-Kultur zu etablieren

Primäre Astrozytenkulturen wurden aus dem P1-3 Maus pup Gehirn vorbereitet. Das Gehirn Dissoziation Verfahren ist ähnlich dem neuronalen Zellisolation oben beschriebenen Verfahrensweise. Astrozyten wurden zunächst in 10 cm Schüssel, wurden vorab überzogenMit Polyornithin (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) beschichtet. Die Astrozyten Kulturmedium (DMEM, 10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin-streptomysin) wurde jeden Tag für die nächsten zwei Tage, um die Ablagerungen zu entfernen. Danach wurde das Medium alle drei Tage gewechselt.

1. Astrozyten 90% konfluent geworden und bilden eine Monoschicht nach 7 Tagen. Konfluente Astrozyten wurden mit Trypsin behandelt und 150 ul des resuspendierten Astrozyten (1x10 ⁶ / ml) wurden in die Zelle Plattierungsfläche des linken Seite des zusammengebauten MCP erneut ausplattiert wenn Axone etwa einzugeben sind oder einfach in der linken Seite des eingegebenen die versammelte MCP. Astrozyten wurden in der Regel beschichtet 4-5 Tage nachdem die Neuronen waren vergoldet. GDNF wurde zuerst vor der erneuten Beschichtung der Astrozyten in die linke Seite des MCP entfernt. Re-plattierten Astrozyten wurden in der Zelle Retentionsbereich angebracht, wie durch die Immunfärbung GFAP (Abbildung 1) gezeigt. Nur minimale Strömung des Mediums zwischen beiden Seiten der Kammern (bestimmt durch Fluoreszenz dja) wurde auf die MCP gefunden, wie zuvor ^4,6 gezeigt.
2. Astrozyten 90% konfluent geworden und bilden eine Monoschicht nach 7 Tagen. Konfluente Astrozyten wurden mit Trypsin behandelt und 150 ul des resuspendierten Astrozyten (1 x 10 ⁶ / ml) wurden in die Zelle Plattierungsfläche des linken Seite des zusammengebauten MCP erneut ausplattiert wenn Axone zu betreten oder nur in den linken eingegeben sind Seite des zusammengebauten MCP. Astrozyten wurden in der Regel beschichtet 4-5 Tage nachdem die Neuronen waren vergoldet. GDNF wurde zuerst vor der erneuten Beschichtung der Astrozyten in die linke Seite des MCP entfernt. Re-plattierten Astrozyten wurden in der Zelle Retentionsbereich angebracht, wie durch die Immunfärbung GFAP (Abbildung 1) gezeigt. Nur minimale Strömung des Mediums zwischen beiden Seiten der Kammern (bestimmt durch Fluoreszenzfarbstoffe) wurde auf die MCP gefunden, wie zuvor ^4,6 gezeigt.
3. Nach der erneuten Beschichtung der Astrozyten, Axone, die die linke Seite des zusammengesetzten MCP eingegebenen direkt mit dem astr interagierenocytes entweder durch direkten Kontakt oder axonalen Freisetzung von löslichen Faktoren. Immunfärbung von astroglialen Plasmamembran Glutamattransporter GLT1 und neuronalen βIII-Tubulin wurde durchgeführt, um die Wechselwirkung zwischen den Axonen und die Astrozyten visualisieren, wie in 2D-F dargestellt.

Ergebnisse

Zeitraffer-Aufnahmen Analyse der Axon-induzierte GLT1 Promotoraktivierung in Astrozyten

Der Fächerwagen Neuron und Astrozyten Kokultur System erlaubt nur die neuronalen Prozesse, insbesondere die Axone, um selektiv mit Astrozyten interagieren. Nach der erfolgreichen Etablierung der Axon und Astrozyten (oder andere Gliazellen) Co-Kultur im zusammengebauten MCP, können verschiedene Arten von Axon-Glia Interaktionen wie studiert werden; Axon-induzierte Aktivierung von Astrozyten-Gen-Promotor-Akt...

Diskussion

Die MCP basierte Neuron und Astrozyten Co-Kultur-System ermöglicht Dissektion detaillierte Neuron Astroglia Signalwege, indem nur die Axone leiten die zentralen Kanäle und Interaktion mit den Astrozyten. Diese Co-Kultur-System bequem eingerichtet werden mit herkömmlichen Neuron und Astrozyten Kultur Verfahren. Beschrieben wir auch eine praktische Anwendung dieser Co-Kultur-System durch den Einsatz eines eGFP basierte Reporter für den Nachweis Axon-abhängige GLT1 Promotoraktivierung in Astrozyten.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fötales Rinderserum	Hyclone	SH30070.03	für die Beschichtung Neuron für Neuron cutlure Medium
Fötales Rinderserum	Sigma-Aldrich	F4135	für Astrozyten Kulturmedium
Glialem Nerven Faktor	R & D-Systeme	212-GD	Anwenden 10-20 ng / ml bis Neuron Seite der Kammer
Dulbecco modifiziertes Eagle-Medium hoher Glukose	Sigma-Aldrich	11995
70 mm Zellsieb	BD Falcon	352350
Sterile Glasboden Gericht	MatTek Konzern
Mikrofluidische Kultur Plattformen	Xona Microfluidics LLC	SND150
6 Vertiefungen der Kulturplatte	CELLSTAR	657 160
			Neuron Kulturmedium Neurobasalmedium 2% B27 Neurobasal Ergänzung 2 mM Glutamat durch Zugabe von 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin
			Neuron Nährboden für Galvanisierzelle Neurobasalmedium 2% B27 Neurobasal Ergänzung 2 mM Glutamat durch Zugabe von 1% 100x GlutaMAX 1% Penicillin-streptomysin 5% Fötales Rinderserum SH30070.03
			Astrocyte Kulturmedium Dulbecco modifiziertem eagle mittel hoch Glukose 10% Fötales Rinderserum F4135 1% Penicillin-streptomysin
			Tabelle 1. Materialien in der mikrofluidischen Kultur plattformbasierte neuronalen Axonen und Glia Co-Kultursystem benutzt.