마이크로 유체 문화 플랫폼에 Glia 상호 작용 (MCP) 기반 Neuronal 축삭과 Glia 공동 문화 시스템에 신경의 영상 분석

요약

이 연구는 소설 neuronal 축삭과 (천체) glia 공동 문화 플랫폼을 설정하는 절차를 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 하나의 축삭 (및 단일 glial 세포) 사이의 직접 상호 작용 조작은 glial 신호에 대한 상호 신경 세포의 기계론의 분석을 수 있도록 가능한된다.

초록

glia 상호 작용에 적절한 신경 세포는 중추 신경계 (CNS)의 생리적 기능에 중요합니다. 이 양방향 통신이 sophisticatedly 뉴런과 glia ^1,2 사이에 특정 신호 경로에 의해 중재됩니다. 이러한 신호 경로의 식별 및 특성은 glia 상호 작용 형태의 CNS의 생리에 얼마나 신경 세포의 이해에 필수적입니다. 이전 뉴런과 glia 혼합 문화가 널리 뉴런과 glia 사이의 신호 경로를 테스트 및 특성화에 활용되었습니다. 우리가 생체 도구에서 이러한 준비 및 기타에서 배운 것을 그러나, 뉴런과 glia 사이의 상호 신호가 자주 뉴런 (즉, 축삭, dendrite, 또는 소마) ³ 내의 특정 구획에서 오류가 발생 것을 제안했습니다. 이것은 중요한 neuronal 구획의 분리 할 수​​있는 새로운 문화 시스템을 개발 할 수 있으며 특별히 glia과 신경 사이의 상호 작용을 검사NAL axons / 수석. 또한, 기존의 혼합 문화 시스템은 가용성 요인과 뉴런과 glia 사이에 직접 멤브레인 연락처 신호를 구별 할 수 없습니다. 또한, 종래의 공동 문화 시스템의 뉴런과 glial 세포의 큰 수량은 하나의 축삭과 glial 세포 사이의 상호 작용을 관찰하는 데 필요한 해상도를 부족합니다.

본 연구에서는, 우리는 마이크로 유체 문화 플랫폼 (MCP)의 사용과 소설 축삭과 glia 공동 문화 시스템을 설명합니다. 이 공동 문화 시스템에서 뉴런과 glial 세포는 여러 중앙 채널을 통해 연결된 2 개의 별도의 방에서 배양되어 있습니다. 이 마이크로 유체 문화 플랫폼에서 만 neuronal 프로세스 (특히 axons) 중앙 채널을 통해 glial 측면을 입력 할 수 있습니다. 강력한 형광 단백질 라벨과 함께,이 시스템은, / axonal 수지상와 glial 상호 작용 사이의 경로를 신호를 직접 검사 할 수 있습니다neuronal 터미널에서 glia, glia로 인한 수용체 인신 매매 및 glia로 인한 축삭의 성장에의 축삭로 인한 전사 조절. 챔버의 좁은 직경은 크게 axons / 수석과 glial 표면 사이의 직접 막 단백질 상호 작용의 프로빙 촉진, glial 챔버에 신경 강화 매체의 흐름을 금지합니다.

프로토콜

1. 마이크로 유체 문화 회의소의 조립 (MCP)

1. MCP (그림 1)은 세포 ⁴ 종류 compartmented 문화 용으로 설계된 개방형 챔버 있습니다. 그것은 일반적으로 중앙 채널 (직경 3 μm)를 통해 연결된 2 개의 구획이 있습니다. 바닥이 유리로 요리 MCP 조립 문화와 이후의 이미징 분석을 준비하기위한 필요합니다.
2. 첫째, Polyornithine (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)와 코트 멸균 유리 바닥 요리 나트륨 테트라 보레이트 (시그마 - 알드리치, 10 밀리미터 산도 8.5)에 용해하고 37 ° C.에서 하룻밤 incubated되었습니다
3. 다음 날, 코팅 유리 바닥 요리는 ddH ₂ O로 세 번 씻어되었으며, 멸균 배기함에 넣고 건조. 유리 바닥 요리는 더 laminin (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)로 코팅 1 시간 동안 UV 빛 아래에서 건조했다. 코팅 요리 사용할 수 있습니다 또는 사용 할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 이러한 코팅공동 문화에 도금 뉴런과 astrocytes에 필요한 재.
4. 문화 플랫폼을 조립하기 위해 마이크로 유체 문화 플랫폼은 방수 밀봉을 형성하기 위해 아래 쪽 중앙 연결 채널을 시청할 수있는 코팅 유리 바닥 요리의 상단에 배치했다. 일반 신경이나 astrocyte 문화 매체는 조립 MCP로 양쪽 (그림 1)에 (셀 도금 지역에서) 추가하고 37 ° C에서 2~4시간에 대한 incubated, MCP와 유리 사이에 누수가 없는지 확인하기 위해 한 바닥 요리. 우리는 누수가없는 보장하기 위해 도금 세포하기 전에 중간에서 테스트했습니다. 유리 바닥 요리에 MCP의 어셈블리가 신선하게 사용하기 전에 준비해야합니다.

2. 조립 MCP에 Neuronal Axons의 Neuronal 문화 유도의 작성

1. 대뇌 피질의 neuronal 세포 문화는 신선한 배아 14-16일 된 마우스 뇌에서 준비되었다. 뉴런 문화 매체는 neurobasal 매체 2% B27 neurobasa으로 구성되어 있습니다난 보충, 100x GlutaMAX의 1 %, 그리고 1퍼센트 페니실린 - streptomysin를 추가하여 글루타민이 음. 마우스 뇌의 해부 후, meninges는 해부 현미경으로 피질에서 제거되었습니다. 조직은 다음 트립신에 노출 면적을 증가시키기 위해 작은 조직 블록을 만들기 위해 면도날과 다진했다. 조직 블록은 37 ° C의 물을 욕조에 10 분 동안 (시그마 - 알드리치, 0.05 % 트립신) trypsinized, 그리고 불타는 광택 파스퇴르 피펫으로 분쇄하여 부드럽게 한 다음 dissociated했다. Dissociated 세포는 일반 neuronal 세포 현탁액를 수집하기 위해 70 μm의 스트레이너를 통해 필터링되었습니다.
2. 뉴런이 세포 보존 지역 (그림 1)에 첨부 할 수 있도록 뉴런은 (2-3 × 10 ⁶ / ML, 150 μl) 조립 MCP의 오른쪽 (그림 1)에서 셀 도금 부분에 도금되었습니다. 신선하게 조리 된 뉴런은 regula에 5% 태아 소 혈청 (Hyclone)로 보완되어 신경 도금 매체를 도금했다R 뉴런 문화 매체입니다. 세포 보존 영역에 첨부 만 뉴런이 중앙 채널을 통해 조립 MCP의 다른 측면에 axons 성장을 할 수 있기 때문에 충분한 뉴런이 연결된 수 있도록하기 위해 셀 도금 지역의 뉴런의 판 고밀도 중요합니다 세포 보존 지역. neuronal axons의 높은 밀도의 대표 이미지가 그림 2A에 표시됩니다.
3. 다음 날에서 신경 도금 매체는 일반 뉴런 문화 매체로 대체되었습니다. 변경 매체는 조심스럽게 챔버의 세포 도금 지역에서 매체를 aspirating하여 수행하지만, 조립 MCP의 세포 보존 지역에서, 셀 보존 지역과 중앙 연결 채널에 기포를 방지하기 위해 인치되었습니다 기포가 심각한 MCP의 중심 채널로 축삭의 가지와 이후의 항목을 억제합니다. Glial 세포 파생 neurotrophic 요인 (GDNF, 10-20 NG / ML)도 다른 (왼쪽) 측면에 추가되었습니다조립 MCP (그림 2A)의 중앙 채널을 통해 neuronal 측면과 십자가에서 축삭의 가지 ^(5)의 유도를 촉진하기 위해 같은 날 챔버의. GDNF없이 자연 neurite의 파생물의 공정한 금액도 조립 MCP의 중심 채널을 통해 neuronal 측면과 십자가에서 관찰된다. 중앙 채널에 입력 Axons은 종종 2-3일 도금 후 관찰됩니다. axons는 중앙 채널에 입력되면, 그들은 보통 하루 내에 다른 쪽을 입력합니다. Axons은 다른 쪽을 입력 한 후 최소 1 주일 동안 정상적으로 그대로입니다.

3. Compartmentalized 공동 문화 시스템을 구축하기 위해 MCP에 대한 양식 Astrocytes의 추가

기본 astrocyte 문화는 P1-3 마우스 새끼 뇌에서 준비되었다. 뇌 분리 절차는 위에서 설명한 neuronal 세포 분리 절차와 비슷합니다. Astrocytes 먼저 사전에 한 10cm 요리로 도금 된Polyornithine (시그마 - 알드리치, 1 MG / ML)로 코팅. astrocyte 문화 매체는 (DMEM, 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - streptomysin) 파편을 제거하려면 다음 두 일 동안 매일 변경되었습니다. 그 후, 매체는 매 3 일마다 교체되었습니다.

1. Astrocytes는 90 %의 합류가 7 일 후에 monolayer를 형성하고 있습니다. 합류 astrocytes는 trypsinized되었으며 axons가에 대한 입력하려고합니다 또는 왼쪽의 체결했을 때 다시 중지 astrocytes (1x10 ⁶ / ML) 150 μl은 조립 MCP의 왼쪽의 셀 도금 지역으로 다시 도금했다 MCP 조립. 뉴런이 도금 한 이후 Astrocytes는 일반적으로 4-5일 도금했다. GDNF 먼저 MCP의 왼쪽에 astrocytes의 재 도금하기 전에 삭제되었습니다. 재 도금 astrocytes는 같은 GFAP의 immunostaining (그림 1)에 의해 도시 된 바와 같이, 셀 고정 영역에 첨부되었습니다. 챔버의 양쪽 사이에 매체의 최소한의 흐름 (형광 D에 의해 결정이전에 ^4,6를 그림과 같이 예)는 MCP에서 발견되었다.
2. Astrocytes는 90 %의 합류가 7 일 후에 monolayer를 형성하고 있습니다. 합류 astrocytes는 axons가에 대한 입력 또는 왼쪽에 입력 한 경우 조립 MCP의 왼쪽의 셀 도금 지역으로 다시 도금 된 trypsinized하고 다시 중지 astrocytes (1 × 10 ⁶ / ML) 150 μl되었습니다 조립 MCP의 측면. 뉴런이 도금 한 이후 Astrocytes는 일반적으로 4-5일 도금했다. GDNF 먼저 MCP의 왼쪽에 astrocytes의 재 도금하기 전에 삭제되었습니다. 재 도금 astrocytes는 같은 GFAP의 immunostaining (그림 1)에 의해 도시 된 바와 같이, 셀 고정 영역에 첨부되었습니다. 이전에 ^4,6를 그림과 같이 챔버의 양쪽 사이에 매체의 최소한의 흐름 (형광 염료에 의해 ​​결정), MCP에서 발견되었다.
3. astrocytes의 재 도금 후, 조립 MCP의 왼쪽을 입력 axons 직접 astr과 상호 작용직접 axonal 연락처 또는 수용성 요소의 릴리스에 의해 ocytes. astroglial 플라즈마 막 glutamate의 전송 GLT1와 neuronal βIII-tubulin의 Immunostaining은 그림 2D-F에 도시 된 바와 같이, axons과 astrocytes 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 수행되었다.

결과

astrocytes의 축삭 유도 GLT1 프로모터 활성화의 시간 경과 영상 분석

compartmented 신경 세포와 astrocyte 공동 문화 시스템은 neuronal 프로세스, 특히 axons은 선택적으로 astrocytes와 상호 작용 할 수 있습니다. 조립 MCP의 축삭과 astrocyte (또는 다른 glial 세포) 공동 문화의 성공적인 설립 후, 축삭-glia 상호 작용의 다른 유형은 다음과 같은 연구 될 수있다; astroglial 유전자 프로모터 활성화, astr...

토론

MCP 기반의 뉴런과 astrocytes 공동 문화 시스템은 axons는 중앙 채널을 통과 허용하고 astroglial 세포와 상호 작용에 의해 astroglia 신호 경로에 대한 자세한 뉴런의 절개를 할 수 있습니다. 이 공동 문화 시스템은 편리하게 기존의 신경 세포와 astrocyte 문화 절차를 설정할 수 있습니다. 우리는 또한 astrocytes의 축삭에 의존 GLT1 프로모터 활성화를 입증 eGFP 기반 기자를 고용하여 공동 문화 시스템의 실제 응?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
태아 소 혈청	Hyclone	SH30070.03	뉴런의 cutlure 매체에 신경을 도금 용
태아 소 혈청	시그마 - 알드리치	F4135	astrocyte 문화 매체에 대한
Glial 파생 된 신경 요소	R & D 시스템	212-GD	챔버의 신경 세포 측에 10-20 NG / ML을 적용
Dulbecco 수정 독수리 중간 높은 포도당	시그마 - 알드리치	11,995
70mm 셀 스트레이너	BD 팔콘	352350
멸균 유리 바닥 요리	MatTek 공사
마이크로 유체 문화 플랫폼	Xona Microfluidics LLC	SND150
문화 판 6 우물	Cellstar	657 160
			뉴런 문화 매체 Neurobasal 매체 2퍼센트 B27 Neurobasal 보충 1퍼센트 100x GlutaMAX을 추가로 약 2 밀리미터 glutamate 1퍼센트 페니실린 - streptomysin
			도금 세포에 대한 신경 세포의 배양액 Neurobasal 매체 2퍼센트 B27 Neurobasal 보충 1퍼센트 100x GlutaMAX을 추가로 약 2 밀리미터 glutamate 1퍼센트 페니실린 - streptomysin 5% 태아 소 혈청 SH30070.03
			Astrocyte 문화 매체 Dulbecco 수정 EAgle은 중간 높은 포도당 10% 태아 소 혈청 F4135 1퍼센트 페니실린 - streptomysin
			마이크로 유체 문화 플랫폼 기반의 neuronal 축삭과 glia 공동 문화 시스템에서 사용되는 표 1. 자료.