Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Riepilogo

Questo studio descrive le procedure di creazione di un nuovo assone neuronale e (astro) glia co-coltura piattaforma. In questo sistema di co-coltura, la manipolazione di interazione diretta tra un singolo assone (e singole cellule gliali) diventa possibile, consentendo l'analisi meccanicistica del neurone reciproco segnalazione gliali.

Abstract

Neurone propria interazione glia è fondamentale per funzione fisiologica del sistema nervoso centrale (CNS). La comunicazione bidirezionale è sofisticato mediata da specifiche vie di segnalazione tra neuroni e glia ^1,2. Identificazione e caratterizzazione di queste vie di segnalazione è essenziale per la comprensione di come l'interazione neurone a glia forme CNS fisiologia. In precedenza, le colture di neuroni e glia misti sono stati ampiamente utilizzati per il test e la caratterizzazione di vie di segnalazione tra neuroni e glia. Quello che abbiamo imparato da questi preparativi e altri strumenti in vivo, tuttavia, ha suggerito che la segnalazione reciproci tra neuroni e glia sono presentati spesso in settori specifici all'interno dei neuroni (cioè, assoni, dendriti, o soma) ^3. Per questo è importante per sviluppare un nuovo sistema di cultura che permette la separazione dei compartimenti neuronali ed esamina in particolare l'interazione tra glia e neuronali assoni / dendriti. Inoltre, il sistema convenzionale coltura mista non è in grado di differenziare i fattori solubili e segnali in membrana di contatto tra neuroni e glia. Inoltre, la grande quantità di neuroni e cellule gliali del convenzionale sistema di co-coltura manca la risoluzione necessaria per osservare l'interazione tra un singolo assone e cellule gliali.

In questo studio, si descrive un assone romanzo e glia sistema di co-coltura con l'uso di una piattaforma microfluidica cultura (MCP). In questo sistema di co-coltura, neuroni e cellule gliali sono coltivati ​​in due camere separate che sono collegati attraverso molteplici canali centrali. In questa piattaforma microfluidica cultura, solo i processi neuronali (soprattutto assoni) può entrare nel lato gliali attraverso i canali centrali. In combinazione con potente etichettatura proteina fluorescente, questo sistema permette esame diretto di percorsi di segnalazione tra interazioni assonali / dendritiche e gliali, tales assone-mediata regolazione trascrizionale nelle cellule gliali, glia-mediata traffico recettore in terminali neuronali e glia-mediata della crescita degli assoni. Il diametro ridotto della camera vieta anche significativamente il flusso del neurone arricchito medio nella camera gliale, facilitando sondaggio della diretta membrana-proteina tra assoni / dendriti e superfici gliali.

Protocollo

1. Assemblea della Camera Cultura Microfluidic (MCP)

1. MCP (Figura 1) sono progettati per cavità si aprono culture compartimenti di diversi tipi di cellule ^4. Ha tipicamente due compartimenti che sono collegati attraverso i canali centrale (3 mm di diametro). Montaggio di MCP con fondo di vetro piatti è necessario per la preparazione di culture e l'analisi di immagini successive.
2. Primo, cappotto sterili fondo di vetro piatti con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) sciolto in tetraborato di sodio (Sigma-Aldrich, 10 mM pH 8,5) e sono state incubate per una notte a 37 ° C.
3. Il giorno seguente, il fondo di vetro rivestite piastre sono state lavate tre volte con DDH ₂ O ed essiccato sotto cappa sterile fumi. I fondo di vetro piatti erano poi ulteriormente rivestito con laminina (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml) ed essiccati sotto luce UV per 1 ora. Piatti rivestiti sono pronti all'uso o può essere conservato a -20 ° C fino all'uso. Questi un rivestimentori necessari per neuroni e astrociti placcatura in co-coltura.
4. Per assemblare la piattaforma cultura, piattaforme cultura microfluidici sono stati collocati in cima alle fondo di vetro rivestite con piatti centrali canali di connessione sul suo lato inferiore per formare una tenuta ermetica. Neurone regolare o terreni di coltura sono stati aggiunti astrociti (dalle zone di placcatura di cella) su entrambi i lati (figura 1) nella assemblato MCP e incubate per 2-4 ore a 37 ° C, per garantire l'assenza di fughe tra MCP e il vetro- piatto fondo. Abbiamo testato con il mezzo prima che le cellule placcatura per garantire non ci sono perdite. L'assemblea di MCP sul vetro a fondo piatto deve essere preparata estemporaneamente prima dell'uso.

2. Preparazione della Cultura neuronale e induzione degli assoni neuronali in assemblato MCP

1. Corticali colture di cellule neuronali sono stati preparati da embrionali 14-16 giorni di età cervello dei topi. Il mezzo di coltura neurone è composto medie Neurobasal, 2% B27 neurobasaL integratore, 2 mM glutammina aggiungendo 1% di 100x glutamax, e 1% di penicillina-streptomysin. Seguendo dissezione del cervello di topo, le meningi stato rimosso dalla corteccia sotto il microscopio da dissezione. Il tessuto è stato quindi macinata con una lama di rasoio per fare piccoli blocchi di tessuto al fine di aumentare la superficie esposta alla tripsina. Blocchi di tessuto sono state tripsinizzate (Sigma-Aldrich, 0,05% di tripsina) per 10 min in un bagno di acqua a 37 ° C, e quindi dissociato delicatamente per triturazione con un incendio lucidato pipetta Pasteur. Cellule dissociate sono state filtrate attraverso un filtro 70 micron a raccogliere chiaro sospensione cellulare neuronale.
2. Neuroni (2-3 x 10 ⁶ / ml, 150 ml) sono state piastrate su aree placcatura cella sulla destra (Figura 1) del MCP assemblato in modo che i neuroni possono attaccare nella zona di ritenzione cellulare (Figura 1). Neuroni preparate sono state piastrate in mezzo di placcatura neurone che viene integrata con il 5% di siero bovino fetale (Hyclone) nella regular neurone terreno di coltura. Perché solo i neuroni che fissano nella zona ritenzione delle cellule sono in grado di crescere assoni nell'altro lato della assemblato MCP attraverso canali centrali, è importante densità piastra elevato di neuroni nell'area placcatura cella per garantire pochi neuroni sono collegati al cella area di ritenzione. Una immagine rappresentativa di alta densità di assoni neuronali è mostrato nella figura 2A.
3. Il giorno seguente, il mezzo placcatura neurone è stato sostituito dalla media regolare cultura neurone. Medie cambiando è stata compiuta da aspirando accuratamente il terreno dalla superficie cellulare placcatura della camera, ma non dalla zona di ritenzione della cella assemblata MCP, per evitare bolle d'aria nella zona di ritenzione cellulare ei canali centrali di collegamento. Le bolle d'aria si inibiscono gravemente la conseguenza assone e la successiva entrata in canali centrali del MCP. Cellule gliali fattore neurotrofico derivato (GDNF, 10-20 ng / ml) è stato aggiunto anche dall'altro (sinistro)della camera il giorno stesso per facilitare l'induzione della crescita degli assoni ⁵ dal lato neuronale e trasversale attraverso canali centrali assemblato MCP (Figura 2A). Discreta quantità di crescita dei neuriti spontanea senza GDNF si osserva anche dal lato neuronale e trasversale attraverso i canali centrali della assemblato MCP. Assoni che entrano nel canale centrale sono spesso osservati 2-3 giorni dopo la placcatura. Una volta che gli assoni entra nel canale centrale, di solito immettere lato entro un giorno. Assoni sono normalmente intatto per almeno una settimana dopo aver inserito l'altro lato.

3. L'aggiunta di astrociti in coltura per MCP per stabilire una co-cultura a compartimenti stagni del sistema

Colture primarie di astrociti sono stati preparati da P1-3 cervello di topo cucciolo. La procedura di dissociazione cervello è simile alla procedura di isolamento cellulare neuronale descritto sopra. Astrociti sono stati piastrati in piatto 10 cm che sono stati pre-Rivestito con Polyornithine (Sigma-Aldrich, 1 mg / ml). Il mezzo di coltura astrociti (DMEM, 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomysin) è stato cambiato ogni giorno per i due giorni successivi per rimuovere i detriti. Dopo di che, il mezzo è stato cambiato ogni tre giorni.

1. Astrociti diventano 90% confluenti e formano un monostrato dopo 7 giorni. Astrociti confluenti sono state tripsinizzate e 150 pl di ri-sospese astrociti (1x10 ⁶ / ml) sono stati ri-piastrate nell'area cella fasciame del lato sinistro della assemblato MCP quando assoni stanno per entrare o appena entrato nel lato sinistro l'assemblato MCP. Gli astrociti sono stati di solito 4-5 giorni dopo piastrate i neuroni erano placcato. GDNF è stato rimosso prima della re-placcatura dei astrociti nel lato sinistro della MCP. Re placcati astrociti sono stati attaccati nella zona di ritenzione cellulare, come mostrato dalla immunostaining GFAP (Figura 1). Solo flusso minimo di mezzo tra entrambi i lati delle camere (determinata dalla fluorescenza dsì) è stato trovato nel MCP, come precedentemente illustrato ^4,6.
2. Astrociti diventano 90% confluenti e formano un monostrato dopo 7 giorni. Astrociti confluenti sono state tripsinizzate e 150 pl di ri-sospese astrociti (1 x 10 ⁶ / ml) sono stati ri-piastrate nell'area cella fasciame del lato sinistro della assemblato MCP quando assoni stanno per entrare o sono entrate in sinistra lato del MCP assemblato. Gli astrociti sono stati di solito 4-5 giorni dopo piastrate i neuroni erano placcato. GDNF è stato rimosso prima della re-placcatura dei astrociti nel lato sinistro della MCP. Re placcati astrociti sono stati attaccati nella zona di ritenzione cellulare, come mostrato dalla immunostaining GFAP (Figura 1). Solo flusso minimo di mezzo tra entrambi i lati delle camere (determinata da coloranti fluorescenti) è stato trovato nel MCP, come precedentemente illustrato ^4,6.
3. Dopo la ri-placcatura dei astrociti, assoni che sono entrate nel lato sinistro della assemblato MCP interagisce direttamente con il astrocytes di contatto diretto assonale o il rilascio di fattori solubili. Immunocolorazione astrogliale GLT1 membrana plasmatica trasportatore e glutammato neuronale βIII-tubulina è stata eseguita per visualizzare l'interazione tra gli assoni e astrociti, come mostrato nella Figura 2D-F.

Risultati

Time-lapse imaging di analisi assone indotta da attivazione del promotore GLT1 negli astrociti

Il neurone compartimenti e astrociti co-coltura sistema consente solo i processi neuronali, in particolare gli assoni, di interagire selettivamente con astrociti. Seguendo la costituzione ottimale di assoni e astrociti (o altre cellule gliali) co-coltura in assemblata MCP, diversi tipi di assone-glia interazioni possono essere studiate come; assone indotta attivazione di attivazione astrogliale gene p...

Discussione

Il neurone MCP based e astrociti co-coltura sistema consente di dissezione neurone dettagliata astroglia vie di segnalazione permettendo solo gli assoni passare i canali centrali e interagire con le cellule astrogliali. Questo co-coltura sistema può essere comodamente impostato con neurone convenzionale e procedure di coltura astrociti. Abbiamo anche descritto un applicazione pratica di questo sistema di co-coltura con l'impiego di un reporter eGFP based per dimostrare assone-dipendente attivazione promotore GLT1 n...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30070.03	per la placcatura neurone per neurone medio cutlure
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F4135	per il terreno di coltura astrociti
Gliale fattore nervoso derivato	R & D Systems	212-GD	Applicare 10-20 ng / ml a lato neurone della camera
Dulbecco modificato aquila medio alte concentrazioni di glucosio	Sigma-Aldrich	11995
70 millimetri filtro cella	BD Falcon	352350
Sterile piatto di vetro basso	MatTek Corporation
Piattaforme cultura microfluidici	Xona microfluidica LLC	SND150
6 pozzetti della piastra di coltura	Cellstar	657 160
			Neuron terreno di coltura Media Neurobasal 2% B27 supplemento Neurobasal 2 mM glutammato aggiungendo 1% 100x glutamax 1% di penicillina-streptomysin
			Neuron terreno di coltura per cellule placcatura Media Neurobasal 2% B27 supplemento Neurobasal 2 mM glutammato aggiungendo 1% 100x glutamax 1% di penicillina-streptomysin 5% di siero fetale bovino SH30070.03
			Terreno di coltura astrociti Dulbecco modificato eagle glucosio medio alto 10% di siero bovino fetale F4135 1% di penicillina-streptomysin
			Materiali Tabella 1. Utilizzati per la microfluidica cultura piattaforma basata su assone neuronale e glia di co-cultura di sistema.