Анализ изображений нейрона к Glia Взаимодействие в Микрофлюидных Платформа культуры (MCP) на основе нейронных аксонов и глии Co-культуре системы

Резюме

Данное исследование описывает процедуры создания новых нейронных аксонов и (ASTRO) глии совместного культивирования платформы. В этой совместной системе культуры, манипуляции прямого взаимодействия между одним аксона (и единственной глиальных клеток) становится возможным, позволяя механистического анализа взаимного нейрона к глиальных сигнализации.

Аннотация

Правильное нейрона к глии взаимодействие имеет решающее значение для физиологических функций центральной нервной системы (ЦНС). Это двусторонняя связь изощренно опосредовано конкретных сигнальных путей между нейроном и глии ^1,2. Идентификация и характеристика этих сигнальных путей имеет важное значение для понимания того, как нейрон глия взаимодействия физиологии ЦНС формы. Ранее нейронов и глии смешанных культур были широко использованы для тестирования и характеризующие сигнальные пути между нейроном и глии. То, что мы узнали из этих препаратов и других инструментов в естественных условиях, однако, предположил, что взаимное сигнализации между нейроном и глии часто происходило в конкретных отделений в нейронах (т.е., аксон, дендритов, или сома) ^3. Это делает его важным для разработки новой системы культуры, которые позволяют разделение отсеков нейронов и, в частности исследует взаимодействие между глии и нейровнутренней аксоны / дендритов. Кроме того, обычные смешанной системе культуры не способны дифференцироваться растворимых факторов и прямой контакт мембраны сигналы между нейроном и глии. Кроме того, большое количество нейронов и глиальных клеток в обычных совместного культивирования системе отсутствует разрешение, необходимое для наблюдения за взаимодействием между одним аксонов и глиальных клеток.

В этой работе мы описываем новую аксонов и глии совместного культивирования системы с использованием платформы микрофлюидных культуре (MCP). В этой совместного культивирования системы, нейроны и глиальные клетки культивируют в двух отдельных камер, которые подключены через несколько центральных каналов. В этом микрофлюидных платформе культуры, только нейронных процессов (особенно аксоны) может войти в глиальных стороне через центральные каналы. В сочетании с мощной флуоресцентной маркировки белков, эта система позволяет непосредственного изучения сигнальных путей между аксональной / дендритные и глиальные взаимодействия, такие,с аксон-опосредованной регуляции транскрипции в глии, глия-опосредованной рецепторами нейронов торговли терминалы, и глии-опосредованного роста аксонов. Узкого диаметра камеры также значительно запрещает поток нейронов обогащенной среды в глиальных камеры, облегчая зондирования прямого мембранного белка взаимодействия между аксонами / дендритов и глиальных поверхности.

протокол

1. Собрание Микрофлюидных палата культуры (MCP)

1. MCP (рис. 1) открытые камеры предназначены для отсеки культур разных типов клеток ^4. Она обычно состоит из двух отсеков, которые подключены через центральные каналы (3 мкм в диаметре). Собрания MCP со стеклянным дном блюда необходимо для подготовки культур и последующего анализа изображений.
2. Во-первых, слой стерильной стеклянным дном блюда с полиорнитином (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл), растворенных в тетрабората натрия (Sigma-Aldrich, 10 мМ рН 8,5) и инкубировали в течение ночи при 37 ° C.
3. На следующий день, покрытый стеклянным дном блюда промывают три раза DDH ₂ O и сушат в стерильном вытяжном шкафу. Стеклянным дном блюда были затем дополнительно покрыты ламинин (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл) и сушат под УФ-светом в течение 1 часа. Покрытые блюда готовые к использованию или может храниться при температуре от -20 ° C до использования. Эти покрытияповторно необходимый для покрытия нейронов и астроцитов в совместной культуре.
4. Чтобы собрать культуры платформы, платформы микрофлюидных культуры были размещены на верхней части стекла с покрытием дном блюда с центральным подключением каналов на его нижней стороне, чтобы сформировать уплотнение. Регулярные нейронов или астроцитов средах культуры были добавлены (из районов ячейки покрытия) с обеих сторон (рис. 1) в собранном MCP и выдерживают в течение 2-4 часов при температуре 37 ° C, чтобы убедиться в отсутствии утечки между МКП и стекло дном блюдо. Мы протестировали со средним перед покрытием клетки убедиться в отсутствии утечки. Сборка MCP на стеклянным дном блюдо должно быть свежеприготовленным перед использованием.

2. Подготовка нейронов культуры и индукция аксонов в собранном MCP

1. Кортикальных нейронов, клеточные культуры были недавно получены из эмбриональных 14-16 дневных мозга мыши. Средой нейрона культуры состоит из Neurobasal среду, 2% B27 neurobasaл добавки, 2 мМ глутамина путем добавления 1% 100x Glutamax, и 1% пенициллин-streptomysin. После вскрытия мозга мыши, мозговых оболочек была удалена из коры под рассекает микроскопом. Затем ткань фарш с лезвием для создания небольших блоков ткани для того, чтобы увеличить площадь поверхности воздействию трипсина. Ткань блоков трипсинизировали (Sigma-Aldrich, 0,05% трипсина) в течение 10 мин при 37 ° С водяной бане, а затем диссоциированных мягко растиранием с огневой полировкой пипетки Пастера. Диссоциированных клеток фильтруют через 70 мкм фильтр для сбора ясно нейронной клеточной суспензии.
2. Нейроны (2-3 х 10 ⁶ / мл, 150 мкл) помещают в клетку покрытие области на правой стороне (рис. 1) собранных MCP, так что нейроны можно прикрепить в области сохранения ячейки (рис. 1). Свежеприготовленный нейроны были покрыты нейрона покрытие среда, которая с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone) в регуляцииГ нейрона культуральной среде. Потому что только нейроны, которые прикрепляются в области сохранения клетки способны к росту аксонов в другую сторону собравшихся MCP через центральные каналы, важно, чтобы плиты высокой плотности нейронов в области покрытия ячейки для обеспечения достаточного количества нейронов, ассоциируются с ячейку сохранения области. Представитель изображений высокой плотности аксонов показано на рисунке 2А.
3. На следующий день, среда нейрона покрытие было заменено регулярной культуральной среде нейронов. Изменение среды осуществляется путем тщательно аспирационных среду из зоны покрытия ячейки в камере, но не из области ячейки сохранения собранного MCP, для того, чтобы избежать образования воздушных пузырей в области ячейки хранения и центральных соединительных каналов. Пузырьки воздуха будет сильно повлиять на результат аксонов и последующее вступление в центральных каналов в MCP. Глиальных клеток нейротрофический фактор (GDNF, 10-20 нг / мл) был добавлен на другой (левой) сторонев камере в тот же день для облегчения индукции аксона результатом ⁵ из нейронных стороны и крест через центральные каналы собранных MCP (рис. 2A). Изрядное количество спонтанных вырост нейритов без GDNF наблюдается также от нейронов стороны и крест через центральные каналы собранных MCP. Аксоны, которые входят в центральный канал часто наблюдаются 2-3 дней после посева. Как только аксоны входят в центральный канал, они обычно вступают в другую сторону в течение одного дня. Аксоны обычно нетронутым в течение не менее одной недели после вступления в другую сторону.

3. Добавление Искусственный астроциты с MCP, чтобы установить разобщенным Co-культуре системы

Первичный астроцитов культур были получены из P1-3 мыши щенка мозга. Процедура мозга диссоциации похож на нейронную процедуры изоляторе описанных выше. Астроциты были впервые высевали в 10 см блюдо, которые были предварительноПокрытие с полиорнитином (Sigma-Aldrich, 1 мг / мл). Астроцитов культуральной среде (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% пенициллин-streptomysin) был изменен каждый день в течение следующих двух дней, чтобы удалить мусор. После этого в среду меняли каждые три дня.

1. Астроциты стать 90% вырожденная и формирования монослоя через 7 дней. Confluent астроциты трипсинизировали и 150 мкл повторно приостановил астроциты (1х10 ⁶ / мл) были повторно высевали в области ячейки обшивки левой части собраны MCP, когда аксоны собираются вводить или только вступили в левой части собранном MCP. Астроциты, как правило, покрыты 4-5 дней после того, как нейроны были покрытием. GDNF впервые был удален перед повторным покрытием из астроцитов в левую сторону MCP. Re покрытием астроциты были прикреплены в области сохранения ячейки, как показано на иммуноокрашивания GFAP (рис. 1). Только минимальным потоком среды между обеими сторонами камер (определяется флуоресценции Dда) было найдено в MCP, как было показано ранее ^4,6.
2. Астроциты стать 90% вырожденная и формирования монослоя через 7 дней. Confluent астроциты трипсинизировали и 150 мкл повторно приостановил астроциты (1 х 10 ⁶ / мл) были повторно высевали в области ячейки обшивки левой части собраны MCP, когда аксоны собираются вводить или только что вошли в левую стороны собрались MCP. Астроциты, как правило, покрыты 4-5 дней после того, как нейроны были покрытием. GDNF впервые был удален перед повторным покрытием из астроцитов в левую сторону MCP. Re покрытием астроциты были прикреплены в области сохранения ячейки, как показано на иммуноокрашивания GFAP (рис. 1). Только минимальным потоком среды между обеими сторонами камер (определяется флуоресценции красителей) был найден в MCP, как было показано ранее ^4,6.
3. После повторного покрытия на астроциты, аксоны, которые вошли в левой части собраны MCP непосредственно взаимодействовать с астрономическийocytes либо прямого контакта аксональной или высвобождение растворимых факторов. Иммуноокрашивание астроглиальных плазматической мембраны глутамата GLT1 транспортер и нейронных βIII-тубулина был выполнен для визуализации взаимодействия между аксонами и астроциты, как показано на рисунке 2D-F.

Результаты

Время изображений в заданный промежуток анализ Аксон-индуцированной GLT1 промоутер активации астроцитов

Отсеки нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет только нейронных процессов, особенно аксоны, чтобы избирательно взаимодействовать с астр...

Обсуждение

MCP на основе нейронов и астроцитов совместного культивирования система позволяет рассечение подробную нейрона к астроглии сигнальных путей, позволяя только аксоны проходят центральные каналы и взаимодействия с астроглиальных клеток. Это сотрудничество культура система может быть л...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Эмбриональной бычьей сывороткой	Hyclone	SH30070.03	для металлизации нейрона на нейрон среднего cutlure
Эмбриональной бычьей сывороткой	Sigma-Aldrich	F4135	для астроцитов культуральной среде
Глиальных полученных нерва фактор	R & D систем	212-GD	Примените 10-20 нг / мл до нейрона сторону камеры
Игла изменения орел среде с высоким содержанием глюкозы	Sigma-Aldrich	11995
70 мм, ячейки фильтра	BD Falcon	352350
Стерильные блюдо со стеклянным дном	Маттек корпорации
Микрофлюидных платформ культуры	Xona Microfluidics ООО	SND150
6 скважин культуры пластины	Cellstar	657 160
			Нейрон культуральной среде Neurobasal среде 2% B27 Neurobasal добавки 2 мМ глутамата путем добавления 1% 100x Glutamax 1% пенициллин-streptomysin
			Нейрон питательную среду для покрытия ячейки Neurobasal среде 2% B27 Neurobasal добавки 2 мМ глутамата путем добавления 1% 100x Glutamax 1% пенициллин-streptomysin 5% эмбриональной телячьей сыворотки SH30070.03
			Astrocyte культуральной среде Игла изменения штGLE среде с высоким содержанием глюкозы 10% эмбриональной телячьей сыворотки F4135 1% пенициллин-streptomysin
			Таблица 1. Материалы, используемые в микрофлюидных культуры на базе платформы аксона нейронов и глии совместного культивирования системы.