כימות חדירות גלומרולרי של מקרומולקולות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ 2-פוטון בחולדות Wistar מינכן

Summary

טכניקת ניצול הרזולוציה הגבוהה intavital מיקרוסקופיה 2 פוטונים ישירות לדמיין ולכמת סינון gloemrular במשטח glomeruli. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של מאפייני חדירות של מולקולות במצבים נורמלים ובחולים.

Abstract

מחלות כליה הקשורות אובדן שתן של מולקולות חיוניות גדולות, כגון אלבומין, כבר מזמן חשבתי להיגרם על ידי שינויים בחדירות המחסום מורכבים מpodocytes, תאי אנדותל כלי דם, וקרום במרתף עובד בהרמוניה. נתונים מהמעבדה שלנו באמצעות מיקרוסקופ 2 הפוטונים intravital חשפו מחסום חדיר יותר גלומרולרי סינון (GFB) מאשר סברו עד כה בתנאים פיסיולוגיים, עם ליפה של אלבומין המסונן המתרחש בקבוצת משנה מוקדמת של תאים הנקרא תאי אבובית הפרוקסימלית (PTC) ^{1,2, 3.}

טכניקות קודמות שימש ללמוד סינון הכלייתי והקמה אופיינית למחסום הסינון המעורב micropuncture של לומן של המגזרים צינורי המוקדמים אלה עם דגימה של התוכן וניתוח ⁴ נוזל. מחקרים אלה קבעו ריכוז אלבומין בנוזל luminal להיות כמעט לא קיים; מקביל באופן הדוקלמה שבדרך כלל הוא זוהה בשתן. עם זאת, אפיון של הפולימרים dextran עם גדלים שהוגדרו על ידי טכניקה זו חשף אלה של גודל דומה לאלבומין בסרום היו רמות גבוהות יותר בלומן ושתן צינורי; מציע חדירות מוגברת ^5.

מסמך זה הוא תיאור מפורט של הטכניקה המשמשת כדי להמחיש באופן ישיר ולכמת חדירות אלבומין ניאון גלומרולרי in vivo. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אלבומין מסונן על פני מחסום הסינון לתוך החלל של באומן (הקאמרית הראשוני של סינון שתן), וגם מאפשרת כימות של ספיגה חוזרת אלבומין על ידי צינוריות והדמיה של transcytosis ⁶ הבא אלבומין הפרוקסימלי. העדרו של ניאון אלבומין יחד מאוחרת מגזרים צינורי בדרך לשלפוחית ​​השתן מדגיש את היעילות של המסלול אחזור במגזרים אבובית הפרוקסימלי קודם לכן. יתר על כן, כאשר טכניקה זו יושמה כדי לקבוע חדירותשל dextrans בעל גודל דומה לערכי חדירות כמעט זהים אלבומין דווח ^2. תצפיות אלו תומכות ישירות בצורך להרחיב את הפוקוס של מחלות כליות proteinuric רבות לשינויים שנכללו בטיוב תא אבובית הפרוקסימלי.

Protocol

1. נטיה של סרום אלבומין לעכברוש כלוריד Sulfonyl 101 sulfo-Rhodamine (טקסס האדומה)

1. ממיסים 100 מ"ג של עכברוש 6.667 מיליליטר סרום אלבומין (RSA) ב100 מ"מ של סודיום ביקרבונט pH 9.0, ריכוז סופי 15 מ"ג / מ"ל ​​בשפופרת 50 מיליליטר חרוטי.
2. פתרון מקום בכוס קרח / מים ומגניבים בין 0 עד 4 ° C.
3. הוסף 200 μl של לפוראמיד דימתיל איכות הגבוהה נטול מים (DMF) לבקבוקון 10 מ"ג של כלוריד Sulfonyl האדום טקסס (TRSC); מערבולת על מדיום במשך 15 שניות.
4. פתרון RSA במערבולת בינונית ומוסיף TRSC המומס.
5. לעטוף 50 מ"ל חרוטי בנייר הכסף (Parafilm יכול לשמש כדי להבטיח חותם חזק נוצר), מקום אופקי בדלי קרח w / קרח בלבד ומניח על נדנדה כדי להתסיס פתרון לאט (למנוע היווצרות של בועות), מאפשרים תגובה להמשיך ב0 עד 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
6. הפוך 5 ליטר של תמיסת מלח 0.9%, והרטיב 50 kDa משקל מולקולרי נותק תא שיכול להיות קרום דיאליזה) עם קליפים, ב) דיצינורות alysis כמו בלצוף-lyzer, או ג) קלטת שקופית-lyzer (כל מתאים להסרת TRSC unconjugated).
7. תערובת תגובת מקום בתא הדיאליזה והמקום במכל L w 5 / תמיסת מלח 0.9%, dialyze לילה בשעה 4 ° C עם תסיסה עדינה באמצעות סרגל ומערבבים.
8. לשנות את פתרון דיאליזה L 5 בבוקר ובשעתי אחר הצהריים מאוחרות, עד שתוצאות דגירה לילה בכמעט ללא שינוי צבע (זה בדרך כלל לוקח ~ 48 שעות עם לפחות 4 חילופים). בנוסף, עם MWCO של 50 kDa להיות כל כך קרוב למגוואט של RSA, 66kDa; זה אפשרי לא לייצר פתרון ברור, זה יהיה תלוי בהפצה בגודל הנקבובית של הקרום; 60 שעות ו -5 חילופים היא יותר ממספיק זמן.
9. נפח מדוד ולחלק את המשקל ההתחלתי של 100 מ"ג בנפח לתת ריכוז משוער של TR-RSA; בדרך כלל טווח ריכוזים 10-13 מ"ג / מ"ל. צבע הסופי: יחס אלבומין צריך להיות ~, 1 fluorophore 04:01 ל15,000 Daltons של MW החלבון. חנות ב 4 ° C, אף פעם לא להקפיא את פתרון TR-RSA, כתוצאת פיצול שעלול להתרחש תשנה ערכי חדירות.

2. מכין את הבמה מיקרוסקופ הפוכה להגדרות הדמיה / מיקרוסקופ

1. מקום ~ 4-7 חתיכות של נייר חיטוי (¾ "ארוך כ) נערמות אחד על השני בצורה מושלמת בתוך צלחת 50 מ"מ עם תחתית coverslip 40 מ"מ (צלחת תחתית coverslip). אלה צריכים להיות ממוקמים קרובים יותר לאחד הקצוות, כך ש קצה של הקלטת יהיה ליצור קשר עם הקצה של עקמומיות של הכליה, אך לא לחסום את נתיב האור האובייקטיבי (האיורים 1A ו-1B); חולדות גדולות יותר ידרשו יותר מקום בין הסרט לבין קצה הצלחת.
2. מקום 2 רפידות Repti-THERM הקרובים לבמה לצד המנה 50 מ"מ (איור 1 א). הנח שמיכת ז'קט מים התחממות מעל הבמה.
3. למקסם את היעילות בעת איסוף תמונות על ידי הבטחת הצריח האובייקטיבי יש אוויר O 10xR 20x (אוויר או מים טבילה) אובייקטיבי ואובייקטיבי טבילה במים מופעל גבוהה כדי לאסוף תמונות כדי לכמת.
4. במהלך הדמיה את הדרך היעילה ביותר כדי להוסיף מים למטרות היא לסובב אותם לצד ומוסיף מים באמצעות מזרק 1 סמ"ק עם חתיכה ארוכה של PE-200 צינורות שיכולים להגיע לפסגה של המטרות.
5. הגדר את עוצמת העירור של לייזר 10watt ל ~ 15-20% תוך שימוש במסנני הצפיפות ניטראליים על התוכנה. את photodetectors descanned שאינו זרח גליום arsenide נקבעים 750 לאסוף פליטות ירוקות, ו625 לאסוף את הפליטה אדומה. פליטה הכחולה (כגון Hoechst 33342 גרעיני הכתם) נאספות באמצעות גלאי multialkaline nondescanned סטנדרטי עם הגדרה בין 750-800.
6. כדי להבטיח את האוסף הנכון של פליטות בעצימות הנמוכות בתוך החלל של באומן, לוודא את הגבולות התחתונים של הגלאים מוגדרים כדי לא לכלול את הערכים הללו. סמני אזהרה חזותיים יציינו אם הרגישותההגדרה היא נמוכה מדי וערכים אלה מקבלים ערך עוצמת אפס.
7. טען מזרק 1 סמ"ק עם ~ 5-8 מ"ג של אלבומין פתרון הניאון מדולל עם 0.9% מלח סטרילית כדי להעלות את הנפח הכולל עד 1 סמ"ק.

3. הדמיה חושף את הכליה בחולדת Wistar מינכן לIntravital 2-פוטון

1. התחל עם עכברוש מראש מורדם באמצעות Pentabarbitol (פתרון מ"ל 50 מ"ג /, 120 גר 'משקל גוף μl/100), Inactin (פתרון מ"ל 130 מ"ג /, 120 גרם במשקל μ/100 גוף), או isofluorane (5% אינדוקציה, 1.5 לרמה של 2.5% אחזקה), שורת שכינת ורידי גישה (או ורידי הצוואר או הירך), והאגף השמאלי גילח מ, ממש מתחת לבית החזה כדי בדיוק מעל הירך השמאלית.
2. מניחים את החולדה שטוחה בצדו ממני, כך שצד השמאל, מגולח הוא פונה כלפי מעלה; לוודא שהוא שטוח על השולחן, עם היציבה שלו מוארכת ולא שפופה, עם רגליו קדמיות נוגעות זה בזה ומאחור כפות נוגעות זה בזה (איור 2 א).
3. מאוד בעדינות למשש להרגיש את הכליה כדי לקבוע היכן מניח אותו באופן טבעי בתוך retroperitoneum ולצייר קו ישר במקביל לגוף (מבית החזה לירך) באמצעות טוש (איור 2 א).
4. להרים את העור עם זוג המלקחיים שיניים, ולצבוט את העור לאורך הקו נמשך באמצעות זוג hemostats כדי למחוץ את הרקמה ולמנוע דימום. לחתוך לאורך החתך בעזרת זוג המספריים כירורגיות. ריסוק העור החיצוני ואת שכבות שרירים לפני החיתוך יהיה להפחית באופן דרמטי ובדרך כלל למנוע דימום.
5. חזור על תהליך עבור שכבת השריר החיצונית, שהוא רזה.
6. לחתך לתוך שכבת השריר הפנימית, שיחשוף את הצפק, מחדש למשש את הכליה כדי להעריך את הגודל. צבוט קו חתך קטן יותר מהכליה; מבטיח חתך הוא רק מעל הכליה. עדיף לעשות החתך הזה קטן מדי ולהפוך אותו גדול יותר במידת הצורך. אם זה נעשה גדול מדי, תפירה תידרש.החתך אחרון זו הוא קריטי; רחוקה מדי מעל לכל כיוון ישפיע על יציבות על הבמה ולגרום גם ממצא תנועה מנשימה (תרחיש מקרה הטוב ביותר) או ימתח פרפוזיה גבעול ולהפחית לרעה הכליות (תרחיש מקרה הגרוע ביותר).
7. אתר את הכליות (כפי שמוצג באיור 2) ואחיזת השומן שמסביב באמצעות מלקחיים, פועל לקוטב התחתון של הכליה ביד אחרת יד האופנה.
8. ברגע שהקוטב התחתון של הכליה הוא הגיע, משוך בעדינות את הכליה דרך החתך בעדינות רבה תוך סחיטה מתחת לכליות לexteriorize. אם החתך קטן מדי, למעוך את שכבת השריר ולחתוך להרחבתו; לחזור על התהליך לexteriorize כליות.

4. הצבת עכברוש Wistar מינכן בשלב הדמיה

1. הנח את הכליות לכיוון הקצה של צלחת coverslip עם הכליה מעט הסתובב לכיוון (בצד האחורי) הגב של העכברוש כל כך בצד הגחוני של כליותיישל יצירת קשר עם צלחת תחתית coverslip (איור 1 א). הוסף% פתרון חימם, סטרילי 09. מלח למנה.
2. להסתכל דרך אובייקטיבי 10x או 20x ולבדוק לתנועה. אם הצעה הוא זוהה, לגלגל את העכבר מעל מעט כל כך את בית החזה הוא רחוקה יותר מצלחת תחתית coverslip; לוודא הכליות הן קרובה לקצה הצלחת ללא מתיחה (איור 1) pedicle כליות.

5. רכישת תמונות לכמת חדירות כליות של אלבומין

1. חישוב חדירות גלומרולרי (מקדם Glomeruluar הסינון; GSC) של כל מקרומולקולה ידרוש לקחת תמונות רקע התייחסות של glomeruli הבודדים לפני העירוי של מולקולת הניאון. אם המיקרוסקופ שלך מצויד בבמה ממונעת מסוגלים סימון מיקומים, ולמצוא glomeruli הבודדים מרכז באמצעות העצמה נמוכה יותר אובייקטיבי ולסמן כל מיקום. מסירה כפולה העמסה / Rhodamine epifluorescence filter הוא אידיאלי להליך זה למרות שגם מסנן הפליטה יעבוד (לעומת שלב או ממקורות שאינם הקרינה אחרות של תאורה לא יעבדו). Glomeruli יופיע כמבנים עגולים ריקים מוקפים בצינוריות הפרוקסימלי יש autoflourescence הצהוב כתום גלום כאשר נצפים מבעד לעבור סינון הכפול.
2. אם המיקרוסקופ שלך לא חייב במה ממונעת, לסרוק הכליות בדפוס סריקה במטרה בעצמה הנמוכה ולהפוך את המפה בסיסית של הפרט שבו glomeruli נמצאים; להסתמך על ציוני דרך טבעיות כגון כלי דם שטחיים גדולים הממוקמים מעל הקפסולה הכליות או כתמי שומן.
3. לעבור את הצריח למטרת הטבילה במי החשמל הגבוהה ולקחת ערכות נתונים 3D של כל glomeruli לוודא את לולאות הנימים והמרחב של האומן גלויים לעין. שימוש בצבעי pseudocolor (משהו אחר מאשר B / W) יעזור לדמיין מבנים אלה.
4. התמקדות בכלי דם שטחי להחדיר לאט בtהוא זמן לוודא אלבומין ניאון הוא נתון, כדי לאפשר החלוקה מערכתית. למולקולות עם GSC הנמוך זה הכרחי כדי למקסם את ערכי עוצמה בפלזמה, אבל לא להגיע לרמות שיהיו להרוות את התמונה גלאי במיקרוסקופ. זה מגדיל detectability של מולקולות מסוננות. הערה: יש בדרך כלל 5-7 שניות בין לשגות זמן אלבומין ניאון הוא הציג בפעם שהוא מופיע על המסך (רכישת מסגרות מלאות במסגרת ~ 1 / שנייה).
5. לאפשר כ 10 דקות כדי לאפשר לכל ברי משקל מולקולריים קטנים פוטנציאליים כדי לנקות לפני רכישת כרכי 3D במרווחים של 1 מיקרומטר כדי לשמש בחישוב GSC אלבומין. בדרך כלל, המתח של סימונסן של מינכן Wistar חולדות יש הרבה פחות שטח glomeruli, אז כל מה שיכול להיות דמיינו הם צילמו וכימות. יש מתח Frömter מספר גדול בהרבה ולכן אנחנו מגבילים את המספר לכמת ל ~ 10.
6. בסוף המחקר את העכברוש הוא מורדמים באמצעות מנת יתר של anesthetIC בשימוש במחקר. Pneumothoracotamy כפול מבוצע כדי להבטיח המתת חסד.

6. חישוב GSC לפלורסנט אלבומין מכרכי 3D

1. שימוש בתוכנת עיבוד תמונת Metamorph לטעון את ערכות נתונים 3D עבור כל glomeruli, הן סט הרקע ולהגדיר נלקח לאחר עירוי של אלבומין ניאון.
2. בהיקף המכיל אלבומין ניאון לאתר לולאת נימים שטחית עם חלל ריק מספיק מקום בין השוליים המוגדרים שלה והקצה של הקפסולה של באומן.
3. בהיקף הרקע לאתר אותו מישור המוקד שאמור להכיל את כל הרמזים החזותיים של התמונה המכילה אלבומין. בחר אזור בתוך לולאת הנימים של עניין ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. הבא בחרו אזור בשטח של באומן ולציין את עוצמת הקריאה הממוצעת. אלה ישמשו כערכי רקע.
4. כדי לכמת, בחר את האזור הדומה בתוך החלל של באומן בג אלבומיןontaining תמונה. האם זה במשך לפחות שני אזורים אחרים לקחת ערך ממוצע לעצמה הממוצעת בתוך החלל של באומן.
5. בחר את לולאת הנימים עם עוצמת הפלזמה הבהירה ולצייר אזור סביבו. הבא באמצעות פונקצית הסף, להדגיש את הערכים הבהירים בתוך הפלזמה במחזור, תוך הימנעות מפסים הכהים שהמחזור של RBC. שימו לב לערכי עוצמה הממוצעים של חלל הפלזמה שנבחר. חשוב לבחור מעדיף את האזורים הבהירים של הפלזמה בגלל גורמים בתוך הדם ישמשו אך ורק כדי לגרום ולהערכה נמוכה מדי של רמות הקרינה הפלזמה.
6. שימוש בגיליון אלקטרוני של Excel של מיקרוסופט להזין את הערכים כדי לחשב את GSC שבו:

תוצאות

איור 3 מראה דוגמה של תמונה שנלקחה מglomerulus פני השטח של עכברוש Frömter Wistar מינכן ואת הצעדים שננקטו כדי לקבוע את החדירות של ניאון אלבומין. ערך GSC לאלבומין של 0.0111 נגזר לglomerulus נפילת אדם זה בטווח ראה בזן זה של חולדות מינכן Wistar כאשר במצב הפד ^3. היציבות ראתה בתמונות א...

Discussion

הצעדים המודגשים כאן מייצגים את מה שאנחנו מרגישים להיות אלה שמייצרים ערכי חדירות עקביות ומדויקים משום שהם לעקוף את המלכודות הבאות:

1. פיזור: השימוש בfluorophores פולטות אדום מאפשר גבייה יעילה יותר של אור מאז פוטונים באורך גל ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07