Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Zusammenfassung

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Zusammenfassung

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) ^{1,2, 3.}

Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt ^4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit ^5.

Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose ^6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden ^{2 angegeben.} Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Protokoll

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red)

1. Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen.
2. Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C.
3. In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek.
4. Vortex RSA Lösung auf mittlere und fügen Sie die gelösten TRSC.
5. Wrap 50 ml konischen in Folie (Parafilm kann verwendet werden, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten werden gebildet), statt horizontal im Eiskübel w / Eis nur und auf Wippe Lösung langsam rühren (Bildung von Blasen zu vermeiden), erlauben Reaktion bei 0 weiter bis 4 ° C für 1 Stunde.
6. Mache 5 L von 0,9% iger Kochsalzlösung, und befeuchten Sie ein 50 kDa Molekulargewicht off Kammer geschnitten, die entweder a) Dialysemembran mit Clips sein kann, b) dialysis-Schlauchmaterial nach einem Schwimmer-a-analysator, oder c) Slide-a-lysator Kassette (alle geeignet für die Entfernung unkonjugierten TRSC).
7. Platz Reaktionsmischung im Dialysekammer und Platz in der 5 L Kanister w / der 0,9% iger Kochsalzlösung, Dialyse über Nacht bei 4 ° C mit einem leichtem Rühren mit einem Rührstab.
8. Ändern Sie den 5 L Dialysierlösung morgens und am späten Nachmittag bis eine Inkubation über Nacht Ergebnisse in praktisch keiner Farbänderung (Dies dauert in der Regel 48 ~ hr mit mindestens 4 Austausch). Zusätzlich mit der MWCO von 50 kDa, so nah an der MW von RSA, 66 kDa, es ist möglich, niemals eine klare Lösung, dies hängt von der Verteilung der Porengröße der Membran; 60 Stunden und 5 Austausch ist mehr als ausreichend Zeit.
9. Measure Volumen und teilen die Einwaage von 100 mg von der Lautstärke auf ungefähre Konzentration von TR-RSA geben, in der Regel Konzentrationen reichen von 10 bis 13 mg / ml. Die endgültige Farbstoff: Albumin-Verhältnis sollte ~ 4:1 1 Fluorophor je 15,00 sein0 Dalton Protein MW. Lagerung bei 4 ° C; NIE frieren die TR-RSA-Lösung, wie sie sich die Fragmentierung, die auftreten können Permeabilitätswerte verändern wird.

2. Vorbereiten des Inverses Mikroskop Bühne Imaging / Microscope Einstellungen

1. Platz ~ 4-7 Stücke Autoklavenband (etwa ¾ "long) perfekt übereinander in einem 50-mm-Schale mit 40 mm Deckglas Boden (Deckglas unteren Schale) gestapelt. Diese sollten näher zu einem der Ränder angeordnet werden, so dass die Rand des Bandes wird mit dem Rand der Krümmung der Niere zu machen, aber nicht blockieren Ziel Lichtweg (1A und 1B), größere Ratten mehr Raum zwischen dem Band und der Rand Schale erfordern.
2. Platz 2 Repti-therm Pads neben der Bühne neben dem 50 mm-Schale (Abbildung 1A). Legen Sie eine Erwärmung Wassermantel Decke über der Bühne.
3. Maximieren Sie die Effizienz beim Erfassen von Bildern durch die Gewährleistung der Objektivrevolver hat eine 10x Luft or 20x (Luft oder Wasser Immersion) und eine höhere angetriebene Wasserimmersionsobjektiv, um Bilder für die Quantifizierung zu sammeln.
4. Bei der Bebilderung der effizienteste Weg, um Wasser zu den Zielen hinzuzufügen ist, um sie zur Seite drehen und Wasser unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einem langen Stück PE-200 Rohr, das die Spitze der Ziele erreichen kann.
5. Stellen Sie die Intensität der Anregung 10watt Laser zu ~ 15-20% mit den Graufilter auf der Software. Die Gallium-Arsenid-Phosphid nichtdescannten Photodetektoren auf 750 eingestellt, um grün-Emissionen und 625 sammeln, um rot-Emissionen zu sammeln. Blau-Emission (wie Nuklearfarbstoff Hoechst 33342) gesammelt unter Verwendung eines Standard-non descanned multialkaline Detektor mit einem Wert zwischen 750-800.
6. Um die korrekte Erhebung der geringen Intensität Emissionen innerhalb der Bowman-Raum zu gewährleisten, stellen Sie sicher, die unteren Grenzen der Detektoren so eingestellt sind, wie diese Werte nicht zu auszuschließen. Visuelle Warnung Marker zeigt an, ob die Empfindlichkeitist zu niedrig, und diese Werte werden eine Intensität von Null gegeben.
7. Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit ~ 5-8 mg des fluoreszierenden Albumin-Lösung mit 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um das Gesamtvolumen auf 1 cc.

3. Freilegen der Nieren in einer Münchner Wistar Ratte für Intravital 2-Photon Imaging

1. Beginnen Sie mit einem Pre-narkotisierten Ratten mit Pentabarbitol (50 mg / ml Lösung, 120 μl/100 g Körpergewicht), Inactin (130 mg / ml Lösung, 120 μ/100 g Körpergewicht) oder Isofluran (5% Induktion, 1.5 auf 2,5% Wartung), eine innewohnende venösen Zugang Linie (entweder Vena femoralis oder venöse) und die linke Flanke von knapp unterhalb des Brustkorbs bis knapp über den linken Oberschenkel rasiert.
2. Legen Sie die Ratte flach auf der rechten Seite, so dass die linke, rasiert Seite nach oben; sicherzustellen, dass es flach auf dem Tisch, mit seiner Haltung länglich und nicht geduckt, mit den Vorderpfoten berühren einander und hinteren Pfoten berühren einander (Abbildung 2A).
3. Sehr vorsichtig abtasten, um die Niere zu bestimmen, wo sie legt natürlich im Retroperitoneum und zeichnen Sie eine gerade Linie parallel zum Körper (vom Brustkorb bis zum Oberschenkel) mit einem Sharpie (2A) fühlen.
4. Pick-up die Haut mit einem Paar Hakenpinzette, und nehmen Sie die Haut entlang der gezeichneten Linie mit einem Paar hemostats, um das Gewebe zu vernichten und zu verhindern, Blutungen. Schneiden Sie entlang der Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Zerkleinern der Außenhaut und die Muskelschichten vor dem Schneiden wird drastisch reduziert und in der Regel beseitigt Blutungen.
5. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die äußere Muskelschicht, die dünn ist.
6. Für den Einschnitt in das innere Muskelschicht, die das Bauchfell freilegt, re-tasten die Niere zu schätzen. Pinch einen Einschnitt Linie kleiner als der Niere; Sicherstellung der Schnitt ist nur über die Niere. Es ist am besten, um diesen Schnitt zu klein und es bei Bedarf vergrößert. Wenn dies wird zu groß, wird Naht erforderlich.Dieser letzte Schnitt ist kritisch, zu weit in jede Richtung über die Stabilität auf der Bühne beeinflussen und induzieren entweder Bewegungsartefakte von der Atmung (best case-Szenario) oder die Nieren Stiel und negativ die renale Perfusion (worst case scenario) dehnen.
7. Suchen Sie die Niere (wie in 2B gezeigt) und Griff die umliegende Fett mit einer Pinzette, arbeiten in Richtung der unteren Pol der Niere in der Hand über Hand-Mode.
8. Sobald die unteren Pol der Niere erreicht ist, ziehen die Niere durch den Einschnitt zwar sehr leicht zusammendrücken unterhalb der Niere zu exteriorisieren. Wenn der Schnitt ist zu klein, zerdrücken die Muskelschicht und geschnitten, um es zu erweitern, wiederholen Sie den Vorgang, um Nieren exteriorisieren.

4. Platzieren des München Wistar Ratte auf der Bühne für Imaging

1. Zeigen die Niere zum Rand des Deckglases Schale mit der Niere leicht gedreht in Richtung der dorsalen (Rückseite) der Ratte so der Bauchseite der Niere is in Kontakt mit der unteren Schale Deckglas (Abbildung 1A). Fügen Sie einen erwärmten, sterile 09.% Iger Kochsalzlösung in die Schale.
2. Schauen Sie durch den 10x oder 20x-Objektiv und überprüfen Sie die Bewegung. Wenn eine Bewegung erkannt wird, rollen die Ratte über etwas so der Brustkorb ist weit weg von dem Deckglas unteren Schale, sicherzustellen, dass die Niere ist wie an den Rand der Schale zu schließen, ohne Dehnung der renalen Stiel (Abbildung 1B).

5. Aufnehmen von Bildern zu Renal Permeabilität von Albumin Quantify

1. Berechnung der glomerulären Permeabilität (Glomeruluar Siebkoeffizienten; GSC) jeder Makromolekül erfordern unter Bezugnahme Hintergrund Bilder der einzelnen Glomeruli vor der Infusion des fluoreszierenden Moleküls. Wenn Ihr Mikroskop mit einem motorisierten Bühne fähig Kennzeichnung Standorte ausgestattet ist, finden und in der Mitte einzelne Glomeruli mit der unteren angetriebenen Ziel und markieren jeden Standort. Ein Dual-Pass Fluorescein / Rhodamin Epifluoreszenz filter ist ideal für dieses Verfahren zwar entweder Emission Filter funktionieren wird (Phasenkontrast oder andere Nicht-Fluoreszenz-Lichtquellen, wird nicht funktionieren). Glomeruli wird als leere kreisförmige Strukturen von proximalen Tubuli mit einer inhärenten gelb-orange autoflourescence wenn durch die Dual Tiefpassfilter angesehen umgeben erscheinen.
2. Wenn Ihr Mikroskop keinen motorisierten Tisch, scannen die Niere in einem Raster-Muster mit der Low-Power-Ziel und eine rudimentäre Karte, wo die einzelnen Glomeruli befinden; sich auf die natürlichen Sehenswürdigkeiten wie große oberflächliche Blutgefäße oberhalb der Nierenkapsel entfernt Fett oder Patches.
3. Schalten Sie den Revolver an die höhere Macht Wasserimmersionsobjektiv und nehmen 3D-Datensätze der einzelnen Glomeruli sicherstellen, dass die Kapillarschlingen und Bowman-Raum sind deutlich sichtbar. Mit einem Pseudo-Palette (etwas anderes als B / W) wird dazu beitragen, diese Strukturen zu visualisieren.
4. Fokussierung in auf einer oberflächlichen Blutgefäße langsam in t ziehener fluoreszierende Albumin dafür, dass Zeit gegeben wird, um für die systemische Verteilung zu ermöglichen. Bei Substanzen mit niedrigem GSC ist es wichtig, die Intensitätswerte in dem Plasma zu maximieren, jedoch nicht auf ein Niveau, das die Photodetektoren in dem Mikroskop zu erreichen sättigen. Dies erhöht Nachweisbarkeit filtriert Moleküle. Hinweis: Es ist in der Regel ein 5-7 sec Ablauf zwischen dem Zeitpunkt der fluoreszierenden Albumin zur Zeit eingeführt wird, erscheint es auf dem Bildschirm (Erwerb Vollbilder bei ~ 1 Bild / Sekunde).
5. Lassen Sie ca. 10 min, um eventuelle kleine Molekulargewicht Fragmente vor dem Erwerb 3D-Volumen bei 1 &mgr; m-Abständen zur Berechnung Albumin GSC verwendet werden löschen. Typischerweise wird die Simonsen Stamm von München Wistarratten weit weniger Oberfläche Glomeruli hat, so dass alle, die visualisiert werden kann abgebildet und quantifiziert werden. Die Frömter Stamm weist eine weitaus größere Zahl, so dass wir die Zahl quantifiziert, um ~ 10 zu begrenzen.
6. Am Ende der Studie wurde die Ratte ist über eine Überdosis des anesthet euthanasiertic verwendet in der Studie. Ein Dual pneumothoracotamy wird durchgeführt, um Sterbehilfe zu versichern.

6. Berechnung GSC für Leuchtstofflampen Albumin aus 3D-Volumes

1. Mit Metamorph Bildverarbeitungssoftware laden Sie die 3D-Datensätze für die einzelnen Glomeruli, sowohl die Hintergrund-Set und Set genommen nach der Infusion des fluoreszierenden Albumin.
2. In dem Band mit dem fluoreszierenden Albumin suchen eine oberflächliche Capillarschlinge mit genügend Platz leeren Raum zwischen den definierten Rändern und dem Rand der Bowman-Kapsel.
3. Im Hintergrund das gleiche Volumen lokalisieren Brennebene, die alle visuellen Hinweisen der eiweißhaltigen Bild enthalten sollte. Wählen Sie eine Region innerhalb des Capillarschlinge von Interesse und beachten Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Weiter wählen Sie eine Region innerhalb der Bowman-Raum und notieren Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Diese werden als Hintergrund-Werte verwendet werden.
4. Zur Quantifizierung, wählen Sie das ähnlich Region innerhalb der Bowman-Raum in der Albumin-containing Bild. Tun Sie dies für mindestens zwei anderen Regionen, um einen Durchschnittswert für die durchschnittliche Intensität innerhalb Bowman-Raum zu nehmen.
5. Wählen Sie die Capillarschlinge mit dem hellsten Plasma Intensität und zeichnen Sie eine Region um ihn herum. Weiter mit dem Schwellenwert-Funktion, markieren die hellen Werte innerhalb des zirkulierenden Plasma, die Vermeidung der dunkle Streifen, die zirkulierenden RBC werden. Beachten Sie die durchschnittliche Intensität Werte des ausgewählten Plasma Raum. Es ist wichtig, bevorzugt aus den hellen Bereichen des Plasmas, weil Faktoren im Blut nur dazu dient, um zu bewirken, und Unterschätzung der Plasma Fluoreszenz Ebenen.
6. Mit einem Microsoft Excel-Tabelle die Werte, um die GSC wo berechnen:

Ergebnisse

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand ³ gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführun...

Diskussion

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen:

1. Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilit...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07