Quantificar glomerular Permeabilidade de Macromoléculas fluorescentes Usando Microscopia 2-Photon em Munique Ratos Wistar

Resumo

Uma técnica de alta resolução utilizando microscopia intavital 2-fotão para visualizar e quantificar directamente filtração gloemrular nos glomérulos superfície. Este método permite a determinação direta de características de permeabilidade de macromoléculas em estados normais e doentes.

Resumo

Doenças renais envolvendo perda urinária de grandes macromoléculas essenciais, tais como albumina do soro, têm sido desde há muito se pensa ser causada por alterações na permeabilidade da barreira composta de podócitos, as células endoteliais vasculares, e uma membrana basal trabalhando em uníssono. Dados do nosso laboratório usando microscopia intravital dois fótons revelou uma barreira mais permeável de filtração glomerular (GFB) do que se pensava em condições fisiológicas, com a recuperação de albumina filtrada ocorrendo em um subconjunto inicial de células chamadas células do túbulo proximal (PTC) ^{1,2 3.}

As técnicas anteriores usados ​​para estudar a filtração renal e estabelecer a característica da barreira de filtração envolvido micropunção do lúmen desses segmentos tubulares de amostragem mais cedo com o conteúdo ea análise do fluido ^4. Estes estudos determinaram a concentração de albumina no fluido luminal ser virtualmente inexistente; correspondente estreitamentecom o que é normalmente detectado na urina. No entanto, a caracterização de polímeros de dextrano com tamanhos definidos por esta técnica revelou aqueles com uma dimensão semelhante à albumina do soro tinham níveis mais elevados no lúmen tubular e de urina, o que sugere uma maior permeabilidade ^5.

Aqui é uma descrição pormenorizada da técnica utilizada para visualizar diretamente e quantificar glomerular fluorescente permeabilidade albumina in vivo. Este método permite a detecção da albumina filtrada através da barreira de filtração para o espaço de Bowman (a câmara de filtração inicial urinária) e também permite a quantificação de albumina reabsorção pelo túbulo proximal e visualização subsequente de transcitose albumina ^6. A ausência de albumina fluorescente ao longo dos segmentos tubulares posteriores rota para a bexiga realça a eficácia da via de recuperação nos segmentos tubulares proximais anterior. Além disso, quando esta técnica foi aplicada para determinar a permeabilidadedos foram relatados dextranos possuindo um tamanho semelhante aos valores de permeabilidade virtualmente idênticos albumina ^2. Estas observações suportam diretamente a necessidade de ampliar o foco de muitas doenças renais proteinúricas para incluídos alterações na recuperação de células do túbulo proximal.

Protocolo

1. Conjugação de albumina de soro de rato Sulfo-rodamina 101 sulfonilo (vermelho do Texas)

1. Dissolve-se 100 mg de albumina de soro de rato (RSA) em 6.667 ml de bicarbonato de sódio a 100 mM pH 9,0; concentração final de 15 mg / ml num tubo de 50 mL cónico.
2. Solução lugar no gelo / água copo e legal entre 0 e 4 ° C.
3. Adicionar 200 mL de dimetil formamida anidra qualidade elevada (DMF) a um frasco de 10 mg de cloreto de sulfonilo vermelho do Texas (TRSC); vórtice no meio durante 15 seg.
4. Solução RSA Vortex no meio e adicione o TRSC dissolvido.
5. Envoltório cónico de 50 ml em folha (Parafilm pode ser usado para assegurar uma vedação hermética é formada), local horizontalmente w / gelo e apenas lugar no balancim solução a agitar lentamente (para evitar a formação de bolhas) no balde de gelo, para permitir a reacção prosseguir a 0 a 4 ° C durante 1 hora.
6. Adicione 5 L de solução salina a 0,9%, e molhar um peso molecular de 50 kDa cortado câmara, que pode ser tanto uma) membrana de diálise com clipes, b) ditubagem ÁLISE como num flutuador-a-lyzer, ou c) da cassete Slide-a-lyzer (todos adequados para a remoção de TRSC não conjugada).
7. Mistura de reacção lugar na câmara de diálise e colocar no recipiente de 5 L w / solução salina a 0,9%, dializar durante a noite a 4 ° C, com uma agitação suave, utilizando uma barra de agitação.
8. Alterar a solução de diálise de 5 L de manhã e no fim da tarde até uma incubação durante a noite resulta em praticamente nenhuma mudança de cor (Isto normalmente leva ~ 48 h, com pelo menos quatro trocas). Além disso, com o MWCO de 50 kDa estar tão perto do MW de RSA, 66kDa, que nunca é possível produzir uma solução límpida, que será dependente da distribuição do tamanho de poro da membrana, 60 horas e 5 trocas é tempo mais do que suficiente.
9. Medir o volume e se dividir o peso inicial de 100 mg por o volume para dar uma concentração aproximada de TR-RSA; tipicamente concentrações intervalo 10-13 mg / ml. O corante final: razão de albumina deve ser ~ 4:1, um fluoróforo por 15,000 Daltons de massa molecular da proteína. Armazenar a 4 ° C; NUNCA congelar a solução TR-RSA, como resultado a fragmentação que pode ocorrer se alterar os valores de permeabilidade.

2. Preparando o Microscópio Stage invertido para a imagem latente / Microscópio Configurações

1. Ponto ~ 4-7 pedaços de fita de autoclave (aproximadamente ¾ "de comprimento) perfeitamente empilhadas umas sobre as outras no interior de 50 mm com um prato inferior lamela de 40 mm (lamela prato inferior). Estes devem ser colocados mais perto de uma das arestas de modo que o borda da fita vai entrar em contacto com a borda de curvatura do rim, mas não bloquear o caminho da luz objectivo (Figuras 1A e 1B), ratos maiores exigirá mais espaço entre a fita ea aresta de prato.
2. Colocar duas almofadas Repti-Therm próximos à fase juntamente com os primeiros 50 mm prato (Figura 1A). Coloque um aquecimento da água da camisa cobertor sobre o palco.
3. Maximizar a eficiência na recolha de imagens, assegurando a torre objetivo tem o ar 10xr 20x (ar ou água de imersão) a objetiva de imersão em água de maior potência para coletar imagens para a quantificação objetiva e.
4. Durante as imagens do modo mais eficiente para adicionar água para os objectivos está a rodar para o lado e adicionar água usando uma seringa de 1 cc com uma peça longa de tubo de PE-200, que pode atingir o topo dos objectivos.
5. Definir a intensidade da excitação do laser 10watt a ~ 15-20%, utilizando os filtros de densidade neutra em relação ao software. O arsenieto de gálio fosforeto fotodetectores não descanned estão definidos para 750 para coletar as emissões verdes, e 625 para recolher as emissões vermelhas. Emissão azul (tal como a mancha nuclear Hoechst 33342) são recolhidos utilizando um detector de multialkaline nondescanned padrão com uma definição entre 750-800.
6. Para assegurar a correcta recolha das emissões de baixa intensidade no espaço de Bowman, certifique-se os limites inferiores dos detectores são ajustados de modo a não excluir esses valores. Marcadores de aviso visual irá indicar se a sensibilidadeajuste é demasiado baixo e estes valores são sendo dado um valor de intensidade de zero.
7. Carregue uma seringa de 1 cc com ~ 5-8 mg da solução de albumina fluorescente diluído com solução salina 0,9% estéril para abrir o volume total de 1 cc.

3. A exposição do Rim em Munich Wistar Rat para Intravital dois fótons de imagem

1. Comece com um rato pré-anestesiados usando Pentabarbitol (50 mg / ml de solução, μl/100 120 g de peso corporal), Inactina (130 mg / ml de solução, μ/100 120 g de peso corporal), ou Isofluorano (indução 5%, 1,5 a manutenção 2,5%), uma linha de acesso venoso residente (venosa ou femoral ou jugular), e do flanco esquerdo raspada a partir debaixo da caixa torácica para apenas acima da coxa esquerda.
2. Coloque o rato plana em seu lado direito, para que o lado esquerdo raspada está voltada para cima, certifique-se que está sobre a mesa, com a sua postura alongada e não agachado, com as patas dianteiras tocando um ao outro e as patas traseiras tocar uns aos outros (Figura 2A).
3. Muito apalpar suavemente para sentir o rim para determinar onde ele naturalmente coloca dentro do retroperitônio e desenhar uma linha reta paralela ao corpo (de costelas de coxa), utilizando uma Sharpie (Figura 2A).
4. Pegue a pele com um par de pinças dentadas, e apertar a pele ao longo da linha traçada usando um par de hemostats para esmagar o tecido e evitar hemorragias. Corte ao longo da incisão usando um par de tesouras cirúrgicas. Trituração a pele exterior e as camadas musculares antes do corte irá reduzir drasticamente e tipicamente eliminar sangramento.
5. Repita este procedimento para a camada muscular externa, que é fino.
6. Para a incisão na camada muscular interna, que vai expor o peritoneu, o re-apalpar o rim para estimar o tamanho. Beliscar uma linha de incisão menor do que o rim, garantindo a incisão é apenas sobre o rim. É melhor fazer essa incisão muito pequena e torná-lo maior, se necessário. Se esta for muito grande, será necessário suturar.Esta última incisão é crítica; muito mais em qualquer direção irá afetar a estabilidade no palco e induzir tanto artefatos de movimento de respiração (melhor cenário) ou vai esticar a perfusão renal pedículo e reduzir adversamente renal (pior cenário).
7. Localize o rim (como mostrado na Figura 2B) e pega a gordura ao redor usando uma pinça, trabalhando para o pólo inferior do rim em uma mão sobre a mão de moda.
8. Uma vez que o pólo inferior do rim é atingido, puxe o rim através da incisão enquanto aperta muito suavemente abaixo do rim para exteriorizar. Se a incisão é muito pequena, da camada muscular esmagar e cortar a alargá-la, repetindo o procedimento para exteriorização do rim.

4. Colocar a Munich Wistar Rat no Palco for Imaging

1. Colocar o rim para a borda do prato lamela com o rim ligeiramente rodado para a dorsal (lado posterior) do rato de modo que o lado ventral do rim is fazer contato com o prato fundo de lamela (Figura 1A). Adicionar uma solução aquecida, estéril 09.% De solução salina para o prato.
2. Olhar através da objetiva de 10x ou 20x e verificar se há movimento. Se for detectado movimento, rolar o rato sobre um pouco para que o tórax é mais longe do prato fundo lamela, certifique-se o rim é o mais próximo da borda do prato, sem alongamento do pedículo renal (Figura 1B).

5. Aquisição de Imagens para quantificar a permeabilidade renal de albumina

1. Cálculo da permeabilidade glomerular (Glomeruluar coeficiente de crivagem; SGC) de qualquer macromolécula exigirá tendo referência a imagens de glomérulos individuais fundo antes da infusão da molécula fluorescente. Se o seu microscópio é equipado com um palco motorizado capaz de localizações de marcação, encontrar e centro de glomérulos individuais usando o objetivo potência menor e marcar cada local. A dupla passagem Fluorescein / Rhodamine epifluorescência filter é ideal para este procedimento, embora seja filtro de emissão vai funcionar (contraste de fase ou de outras fontes não-fluorescência de iluminação não vai funcionar). Os glomérulos aparece como estruturas circulares vazios rodeados por tubos proximais possuindo um autoflourescence amarelo-laranja inerente quando vista através do filtro de passagem dupla.
2. Se o microscópio não tem uma fase motorizada, digitalizar o rim num padrão de quadriculação, com o objectivo de baixa potência e fazer um mapa do local onde o rudimentar glomérulos individuais estão localizados, baseando-se marcos naturais, tais como grandes vasos sanguíneos superficiais que se encontram acima da cápsula renal ou manchas de gordura.
3. Desligue o revólver para o objectivo de imersão em água poder superior e tomar conjuntos de cada glomérulos de dados 3D certificando-se as alças capilares e espaço de Bowman são claramente visíveis. Usando uma paleta de pseudo (algo diferente de B / W) vai ajudar a visualizar essas estruturas.
4. Concentrando-se em um vaso sanguíneo superficial lentamente infundir em tele fluorescente albumina tomada de tempo com certeza é dada para permitir a distribuição sistêmica. Para moléculas com baixo SGC é essencial para maximizar os valores da intensidade do plasma, mas não atingir níveis que saturam os fotodetectores no microscópio. Isto aumenta a detecção de moléculas de filtrados. Nota: normalmente há um lapso sec 5-7 entre o tempo da albumina fluorescente é introduzido para o tempo que aparece na tela (aquisição de quadros completos em ~ 1 frame / segundo).
5. Permitir que aproximadamente 10 min, para permitir que quaisquer potenciais pequenos fragmentos de peso molecular para limpar, antes de adquirir os volumes 3D em intervalos de 1 um a ser utilizados no cálculo SGC albumina. Normalmente, a tensão de Munique ratos Wistar do Simonsen tem muito menos glomérulos superficiais, por isso tudo o que pode ser visualizado são analisados ​​e quantificados. A estirpe Frömter tem um número muito maior de modo que limita o número quantificado para ~ 10.
6. No final do estudo, o rato é sacrificado através de uma sobredosagem de anestésicosic utilizado no estudo. Uma dupla pneumothoracotamy é realizada para assegurar a eutanásia.

6. Calculando GSC para fluorescente Albumina de Volumes 3D

1. Usando o software de processamento de imagem Metamorph carregar os conjuntos de dados 3D para cada glomérulos, tanto o conjunto de fundo e definir tomada após a infusão da albumina fluorescente.
2. No volume que contém a fluorescente albumina localizar uma alça capilar superficial com espaço suficiente espaço vazio entre suas margens definidas e da borda da cápsula de Bowman.
3. No volume fundo localizar o mesmo plano focal que deve conter todos os elementos visuais da imagem que contém albumina. Selecione uma região dentro do ciclo capilar de interesse e anote a leitura média intensidade. Em seguida, selecione uma região no espaço de Bowman e observe a leitura média intensidade. Estes serão utilizados como valores de fundo.
4. Para a quantificação, selecione a região semelhante dentro do espaço de Bowman no c albuminaimage ontaining. Faça isso por pelo menos duas outras regiões para ter um valor médio para a intensidade média no espaço de Bowman.
5. Selecione o ciclo capilar com a intensidade plasma brilhante e desenhar uma região em torno dele. Em seguida utilizando a função de limiar, destacar os valores brilhantes dentro do plasma circulante, evitando as estrias escuras que estão circulando RBC. Note-se os valores médios da intensidade do espaço de plasma seleccionado. É importante selecionar preferencialmente as áreas brilhantes do plasma porque fatores dentro do sangue servirá apenas para provocar e subestimação dos níveis plasmáticos de fluorescência.
6. Usando uma planilha do Microsoft Excel insira os valores para calcular o GSC onde:

Resultados

A Figura 3 mostra um exemplo de uma imagem feita a partir de uma superfície de um glomérulo Munique Frömter rato Wistar e as medidas tomadas para determinar a permeabilidade da albumina fluorescente. O valor do SGC para a albumina derivada de 0,0111 para esta queda glomérulo individual no intervalo visto nesta linhagem de ratos Wistar de Munique, quando na condição alimentada ^3. A estabilidade visto nestas imagens é devido à concepção e execução de instruções representadas nas <...

Discussão

Os passos destacados aqui representam o que sentimos ser aqueles que irão produzir valores de permeabilidade consistentes e precisas, porque eles contornar as seguintes armadilhas:

1. Dispersão: a utilização de um emissor de fluoróforos vermelhos permitem uma recolha mais eficiente da luz uma vez que mais fotões de comprimento de onda são menos propensas a dispersão. Usando tanto fluorophores emissores verdes ou azuis irá introduzir uma maior variação na GSC da causa do aumento da variabilidade nos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07