Quantificare permeabilità glomerulare delle Macromolecole fluorescenti usando la microscopia a due fotoni a Monaco di Baviera ratti Wistar

Riepilogo

Una tecnica che utilizza alta risoluzione intavital microscopia a 2 fotoni di visualizzare direttamente e quantificare filtrazione gloemrular in glomeruli superficie. Questo metodo consente la determinazione diretta di caratteristiche di permeabilità di macromolecole in stati sia normali e malati.

Abstract

Malattie renali con perdita urinaria di grandi macromolecole essenziali, quali albumina sierica, sono stati a lungo pensato per essere causato da alterazioni nella permeabilità della barriera composto podociti, cellule endoteliali vascolari, e una membrana basale lavorano all'unisono. I dati ottenuti nel nostro laboratorio utilizzando intravital microscopia a 2 fotoni rivelato una più permeabile barriera di filtrazione glomerulare (ULA) di quanto si pensasse in condizioni fisiologiche, con il recupero di filtrato albumina che si verificano in un sottoinsieme precoce di cellule chiamate cellule del tubulo prossimale (PTC) ^{1,2, 3.}

Tecniche precedenti usate per studiare filtrazione renale e stabilendo la caratteristica della barriera di filtrazione coinvolto micropuntura del lume di questi segmenti tubolari primi con campionamento del fluido contenuto e analisi ^4. Questi studi determinata concentrazione di albumina nel fluido luminale essere praticamente inesistenti; corrispondente strettamentea quanto normalmente rilevata nelle urine. Tuttavia, la caratterizzazione dei polimeri di destrano con dimensioni definite da questa tecnica ha rivelato quelle di dimensioni simili all'albumina sierica avevano livelli più elevati nel lume tubulare e nelle urine; suggerendo un aumento della permeabilità ^5.

Qui è una descrizione dettagliata della tecnica utilizzata per visualizzare direttamente e quantificare glomerulare fluorescente permeabilità albumina in vivo. Questo metodo permette di individuare filtrata albumina attraverso la barriera di filtrazione nello spazio di Bowman (la camera iniziale di filtrazione urinaria), e permette anche la quantificazione di albumina riassorbimento dai tubuli prossimali e visualizzazione di successiva transcitosi albumina ^6. L'assenza di fluorescenza lungo albumina successivi segmenti tubolari in rotta alla vescica evidenzia l'efficienza del percorso di recupero nei segmenti tubulo prossimale precedenza. Inoltre, quando è stata applicata questa tecnica per determinare la permeabilitàdi destrani aventi dimensioni simili a valori di permeabilità praticamente identiche albumina sono stati segnalati ^2. Queste osservazioni supportano direttamente la necessità di ampliare l'attenzione di molte malattie renali proteinuriche ai inclusi alterazioni delle cellule del tubulo prossimale bonifica.

Protocollo

1. Coniugazione di Rat albumina sierica di solfo-rodamina 101 Sulfonyl Cloruro (Texas Red)

1. Sciogliere 100 mg di albumina sierica Rat (RSA) in 6,667 ml di 100 mM Sodio bicarbonato pH 9,0; concentrazione finale di 15 mg / ml in un tubo da 50 ml conica.
2. Soluzione luogo in bicchieri di ghiaccio / acqua e raffreddare a tra 0-4 ° C.
3. Aggiungere 200 ml di dimetilformammide anidra di alta qualità (DMF) per una fiala 10 mg di Texas Red Sulfonyl Cloruro (TRSC); vortice sul medio per 15 sec.
4. Soluzione Vortex RSA sul medio e aggiungere il TRSC sciolto.
5. Wrap 50 ml conica in lamina (Parafilm può essere utilizzato per assicurare una tenuta stagna è formata), posto in orizzontale w / ice solo e luogo il rocker ad agitare lentamente soluzione (evitare la formazione di bolle) nel secchio di ghiaccio, permettono la reazione di continuare a 0 a 4 ° C per 1 ora.
6. Fai 5 L di soluzione salina allo 0,9%, e bagnare un peso molecolare 50 kDa tagliato fuori da camera, che può essere sia una) membrana di dialisi con clip, b) ditubi ALISI come in un float-a-lizzatore, oppure c) cassette slide-a-lizzatore (tutti adatti per la rimozione TRSC non coniugata).
7. Posto miscela di reazione nella camera di dialisi e posto nel contenitore 5 L w / soluzione salina 0,9%, dializza notte a 4 ° C con una leggera agitazione mediante un agitatore.
8. Cambiare la soluzione di dialisi 5 L in mattinata e nel tardo pomeriggio, fino a quando una notte i risultati di incubazione in praticamente nessun cambiamento di colore (Questo richiede in genere ~ 48 ore con almeno 4 scambi). Ulteriormente, con il MWCO di 50 kDa essere così vicino al MW di RSA, 66kDa, è possibile mai produrre una soluzione limpida; questo sarà dipendente dalla distribuzione delle dimensioni dei pori della membrana; 60 hr e 5 scambi è tempo più che sufficiente.
9. Volume di misura e dividere il peso iniziale di 100 mg per il volume ad una concentrazione approssimativa di TR-RSA; variano tipicamente concentrazioni 10-13 mg / ml. Il colorante finale: rapporto albumina dovrebbe essere ~ 4:1, 1 fluoroforo per 15,000 Daltons di proteine ​​MW. Conservare a 4 ° C; MAI congelare la soluzione TR-RSA, come risultanti frammentazione che potrebbe verificarsi altererà i valori di permeabilità.

2. Preparazione del microscopio invertito fase di imaging / Microscopio Impostazioni

1. Posto ~ 4-7 pezzi di nastro autoclave (circa ¾ "lungo) perfettamente impilati uno sopra l'altro in un piatto di 50 mm con un fondo coprioggetto 40 millimetri (coprioggetto piatto inferiore). Questi dovrebbero essere messi più vicino ad uno dei bordi in modo che la bordo del nastro farà contatto con il bordo di curvatura del rene ma non bloccare il percorso della luce oggettiva (Figure 1A e 1B); ratti più grandi richiedono più spazio tra il nastro e il bordo del piatto.
2. Mettere 2 Repti-therm pad vicino al palco a fianco del piatto di 50 mm (Figura 1A). Mettere una coperta d'acqua giacca riscaldamento sopra il palco.
3. Massimizzare l'efficienza nella raccolta immagini, assicurando la torretta obiettivo ha un 10x di aria oR 20x (immersione con aria o acqua) obiettivo e un obiettivo ad immersione in acqua alimentato superiore a raccogliere le immagini per la quantificazione.
4. Durante l'imaging il modo più efficiente di aggiungere acqua agli obiettivi è per ruotarli al lato e aggiungere acqua utilizzando una siringa da 1 cc con un lungo pezzo di tubo in PE-200 che può raggiungere la cima degli obiettivi.
5. Impostare l'intensità di eccitazione del laser 10watt a ~ 15-20% usando i filtri a densità neutra sul software. Il gallio-arseniuro di fosfuro fotorilevatori non descanned sono impostati a 750 per raccogliere le emissioni di verde e 625 per raccogliere le emissioni rossi. Blue emissione (come il nucleare macchia Hoechst 33342) vengono raccolte utilizzando un rivelatore multialkaline nondescanned standard con una impostazione tra 750-800.
6. Per garantire la corretta riscossione delle emissioni a bassa intensità all'interno dello spazio di Bowman, assicurarsi che i limiti inferiori di rivelatori sono tarati in modo da non escludere questi valori. Marcatori di avvertimento visivi indicheranno se la sensibilitàregolazione bassa e questi valori vengono date un valore di intensità pari a zero.
7. Caricare una siringa da 1 cc con ~ 5-8 mg di soluzione di albumina fluorescente diluito con 0,9% soluzione salina sterile per portare il volume totale a 1 cc.

3. L'esposizione del rene in un Munich Wistar Rat per intravitale 2-Photon Imaging

1. Inizia con un topo pre-anestetizzato con Pentabarbitol (50 mg / ml soluzione, μl/100 120 g di peso corporeo), Inactin (130 mg / ml soluzione, μ/100 120 g di peso corporeo), o isofluorano (5% induzione, 1,5 al 2,5% di manutenzione), una linea di accesso venoso a permanenza (sia venoso giugulare o femorale), e il fianco sinistro rasate da appena sotto la gabbia toracica appena sopra la coscia sinistra.
2. Posizionare il topo piatta sul lato destro in modo che la sinistra, lato rasato è rivolto verso l'alto, assicurarsi che sia in piano sul tavolo, con la sua postura allungata e non rannicchiato, con le zampe anteriori che si toccano e posteriore zampe che si toccano (Figura 2A).
3. Molto palpare delicatamente per sentire il rene per determinare dove si stabilisce naturalmente all'interno del retroperitoneo e disegnare una linea retta parallela al corpo (dalla cassa toracica a coscia) utilizzando un pennarello (Figura 2A).
4. Sollevare la pelle con un paio di pinze dentate, e pizzicare la pelle lungo la linea tracciata con un paio di pinze emostatiche per schiacciare i tessuti e prevenire le emorragie. Tagliare lungo l'incisione utilizzando un paio di forbici chirurgiche. Schiacciare la pelle esterna e gli strati muscolari prima del taglio sarà drasticamente ridurre ed eliminare il sanguinamento in genere.
5. Ripetere questa procedura per lo strato muscolare esterno, che è sottile.
6. Per l'incisione nello strato muscolare interno, che espone il peritoneo, ri-palpare il rene per stimare dimensioni. Pizzicare una linea di incisione più piccola del rene, assicurando l'incisione è appena oltre il rene. E 'meglio per rendere questa incisione troppo piccolo e rendere più grande se necessario. Se questo è fatto troppo grande, la sutura sarà richiesto.Questa ultima incisione è fondamentale; troppo oltre in qualsiasi direzione influenzerà la stabilità sul palco e indurre sia gli artefatti da movimento di respirazione (best case scenario) oppure si allungherà la perfusione renale peduncolo e negativamente ridurre renale (worst case scenario).
7. Individuare il rene (come mostrato in Figura 2B) e l'impugnatura grasso circostante usando pinze, lavorando verso il polo inferiore del rene in una mano sopra mano moda.
8. Una volta raggiunto il polo inferiore del rene, tirare delicatamente il rene attraverso l'incisione, mentre molto delicatamente stringendo sotto il rene per esteriorizzare. Se l'incisione è troppo piccolo, schiacciare lo strato muscolare e tagliare ampliarlo; ripetere la procedura per esteriorizzarmi rene.

4. Posizionamento del Munich Wistar Ratto sullo stage per l'imaging

1. Collocare il rene verso il bordo del piatto coprioggetto con il rene leggermente ruotato verso il dorsale (lato posteriore) della ratto così la faccia ventrale del rene is prendere contatto con il piatto inferiore coprioggetto (Figura 1A). Aggiungi una riscaldata, soluzione fisiologica sterile 09.% Al piatto.
2. Guardare attraverso l'obiettivo 10x o 20x e verificare la presenza di movimento. Se viene rilevato un movimento, rotolare il topo sopra un po 'in modo che il torace è più lontano dal piatto fondo vetrino; assicurarsi che il rene è il più vicino al bordo del piatto senza allungare il peduncolo renale (Figura 1B).

5. Acquisizione di immagini per quantificare permeabilità renale di albumina

1. Calcolo della permeabilità glomerulare (Glomeruluar setaccio coefficiente; GSC) di qualsiasi macromolecola richiede assunzione di riferimento immagini dei singoli glomeruli fondo prima dell'infusione della molecola fluorescente. Se il microscopio è dotato di uno stadio motorizzato capace di posizioni di marcatura, trovare e Centro singoli glomeruli con l'obiettivo di bassa potenza e contrassegnare ogni posizione. Un doppio passaggio fluoresceina / Rodamina epifluorescenza filter è l'ideale per questa procedura, anche se uno dei due filtri emissione funzionerà (contrasto di fase o di altre fonti non fluorescenza di illuminazione non funziona). Glomeruli apparirà come strutture circolari vuote circondate da tubuli prossimali hanno un autoflourescence giallo-arancio inerente se visto attraverso il filtro a doppio passaggio.
2. Se il microscopio non ha uno stadio motorizzato, eseguire la scansione del rene in un modello raster, con l'obiettivo a basso e fare una rudimentale mappa di dove si trovano i glomeruli individuale, basandosi su punti di riferimento naturali come i grandi vasi sanguigni superficiali situati sopra la capsula renale o macchie di grasso.
3. Passare la torretta alla potenza obiettivo ad immersione d'acqua superiore e prendere set di dati 3D di ogni glomeruli assicurandosi che le anse capillari e lo spazio di Bowman sono chiaramente visibili. Utilizzando una tavolozza pseudocolore (qualcosa di diverso da B / N) vi aiuterà a visualizzare queste strutture.
4. Concentrandosi su un vaso sanguigno superficiale lentamente infondere in tegli fluorescente albumina fare il tempo che è dato per consentire la distribuzione sistemica. Per molecole con bassa GSC è essenziale per massimizzare i valori di intensità nel plasma ma non raggiungere livelli che satura il fotorivelatori nel microscopio. Questo aumenta la rilevabilità di molecole filtrate. Nota: di solito c'è un 5-7 sec intervallo tra il momento della fluorescenza albumina viene introdotto al tempo che viene visualizzato sullo schermo (l'acquisizione di immagini complete a ~ 1 frame / secondo).
5. Attendere circa 10 minuti per consentire eventuali piccoli frammenti di peso molecolare per chiarire prima di acquisire volumi 3D ad intervalli di 1 micron per essere utilizzate nel calcolo GSC albumina. In genere, la deformazione del Simonsen di Monaco ratti Wistar ha molti meno glomeruli di superficie, in modo tutto ciò che può essere visualizzato vengono esposte e quantificato. Il ceppo Frömter ha un numero di gran lunga maggiore in modo da limitare il numero quantificato a ~ 10.
6. Alla fine dello studio il ratto è eutanasia tramite un sovradosaggio di anesteticiic utilizzato nello studio. Un doppio pneumothoracotamy viene eseguita per assicurare eutanasia.

6. Calcolo GSC per fluorescente albumina da volumi 3D

1. Utilizzando il software di elaborazione delle immagini Metamorph caricare i set di dati 3D per ogni glomeruli, sia lo sfondo set e set presa dopo l'infusione della fluorescenza albumina.
2. Nel volume contenente il fluorescente albumina individuare un ciclo capillare superficiale con abbastanza spazio libero spazio tra i margini definiti e il bordo della capsula di Bowman.
3. Nel volume sfondo localizzare sullo stesso piano focale, che dovrebbe contenere tutte le indicazioni visive dell'immagine contenente albumina. Seleziona una regione all'interno del ciclo capillare di interesse e annotare la lettura media intensità. Quindi selezionare una regione all'interno dello spazio di Bowman e annotare il valore medio di intensità. Questi saranno utilizzati come valori di fondo.
4. Per la quantificazione, selezionare la regione di simile nello spazio di Bowman nel albumina cimmagine ontaining. Fate questo per almeno altre due regioni a prendere un valore medio per l'intensità media all'interno dello spazio di Bowman.
5. Selezionare il ciclo capillare con l'intensità di plasma luminoso e disegnare una regione intorno ad esso. Avanti con la funzione soglia, evidenziare i valori luminosi all'interno del plasma circolante, evitando le striature scure che circolano RBC. Notare i valori medi di intensità dello spazio plasma selezionato. E 'importante selezionare preferenzialmente le aree luminose di plasma perché fattori all'interno del sangue serviranno solo a provocare e sottostima dei livelli plasmatici di fluorescenza.
6. Utilizzando un foglio elettronico Microsoft Excel immettere i valori per calcolare il GSC dove:

Risultati

La figura 3 mostra un esempio di immagine presa da un glomerulo superficie di un Munich Wistar Frömter ratto e le misure adottate per determinare la permeabilità di albumina fluorescente. Il valore GSC per l'albumina di 0,0111 derivato per questo autunno glomerulo individuo all'interno del campo visto in questo ceppo di Monaco ratti Wistar quando nella condizione alimentato ^3. La stabilità visto in queste immagini è dovuta alla accurata progettazione e l'esecuzione di istruzio...

Discussione

I passaggi evidenziati qui rappresentano ciò che sentiamo di essere quelli che producono valori di permeabilità coerenti e precise, perché aggirano i seguenti problemi:

1. Scattering: L'uso di un rosso fluorofori che emettono permetterebbe una maggiore efficienza di raccolta della luce dal più fotoni di lunghezza d'onda sono meno inclini a disperdersi. Utilizzando sia fluorofori che emettono verdi o blu introdurrà maggiore variazione in GSC della causa della maggiore variabilità nei valori di int...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07