Quantifier glomérulaire perméabilité des macromolécules fluorescentes en microscopie 2 photons à Munich chez le rat Wistar

Résumé

Une technique utilisant haute résolution intavital microscopie 2-photons pour visualiser directement et de quantifier filtration gloemrular dans les glomérules de surface. Cette méthode permet la détermination directe des caractéristiques de perméabilité des macromolécules dans des états normaux et malades.

Résumé

Les maladies du rein impliquant la perte urinaire de grandes macromolécules essentielles, comme l'albumine sérique, ont longtemps été pensé pour être causés par des altérations de la barrière de perméabilité composé de podocytes, cellules endothéliales vasculaires, et une membrane basale de travail à l'unisson. Les données de notre laboratoire en utilisant intravitale microscopie 2 photons ont révélé une barrière plus perméable de filtration glomérulaire (GFB) qu'on ne le pensait dans des conditions physiologiques, avec récupération des filtré albumine se produisant dans un sous-ensemble au début de cellules appelées cellules des tubules proximaux (PTC) ^{1,2 3.}

Les techniques précédentes utilisées pour étudier la filtration rénale et d'établir les caractéristiques de la barrière de filtration impliqué micropuncture de la lumière de ces segments tubulaires début de l'échantillonnage du contenu et analyse ⁴ fluide. Ces études ont déterminé la concentration d'albumine dans le liquide luminal être pratiquement inexistante; correspondant étroitementpour ce qui est normalement détecté dans l'urine. Cependant, la caractérisation des polymères de dextran avec des tailles définies par cette technique a révélé celles d'une taille similaire à l'albumine sérique des niveaux plus élevés dans la lumière tubulaire et l'urine; suggérant une perméabilité accrue ^5.

Ce document est un aperçu détaillé de la technique utilisée pour visualiser et quantifier directement glomérulaire fluorescent perméabilité albumine in vivo. Cette méthode permet la détection de l'albumine filtrée à travers la barrière de filtration dans l'espace de Bowman (la chambre initiale de filtration urinaire), et permet également la quantification de l'albumine réabsorption par les tubules proximaux et la visualisation de suite transcytosis albumine ^6. L'absence d'albumine fluorescent le long des segments tubulaires plus tard, en route vers la vessie met en évidence l'efficacité de la voie de récupération dans les segments des tubules proximaux plus tôt. De plus, lorsque cette technique a été appliquée pour déterminer la perméabilitéde dextranes ayant une taille similaire à des valeurs de perméabilité pratiquement identiques albumine ont été signalés ^2. Ces observations appuient directement la nécessité d'élargir la portée de beaucoup de maladies rénales protéinuriques de modifications incluses dans la remise en état des cellules du tubule proximal.

Protocole

1. Conjugaison de sérum albumine de rat de sulfo-rhodamine 101 sulfonyle (Texas Red)

1. Dissoudre 100 mg de Rat albumine sérique (RSA) dans 6.667 ml de 100 mM Sodium Bicarbonate pH 9,0; concentration finale de 15 mg / ml dans un tube conique de 50 ml.
2. Lieu solution dans la glace / eau bécher et refroidir à entre 0 et 4 ° C.
3. Ajouter 200 pi de qualité diméthylformamide élevé (DMF) anhydre à un flacon de 10 mg de Texas Red sulfonyle (TRSC); vortex sur le milieu pendant 15 sec.
4. Solution RSA Vortex à moyen et ajouter le TRSC dissous.
5. Wrap 50 ml conique en feuille (Parafilm peut être utilisé pour assurer un joint étanche est formé), lieu horizontalement dans un seau à glace w / glace seulement et le placer sur rocker à agiter solution lentement (éviter la formation de bulles), laissez réaction se poursuivre à 0 à 4 ° C pendant 1 heure.
6. Assurez-5 L de solution saline à 0,9%, et mouiller un poids moléculaire de 50 kDa couper chambre off qui peut être soit a) membrane de dialyse avec clips, b) ditube de alysis comme dans un flotteur-a-lyseur, ou c) un tiroir-lyseur cassette (tous adaptés pour enlever RSRT non conjuguée).
7. mélange réactionnel de place dans la chambre de dialyse et le lieu de la 5 L w / la solution saline à 0,9%, dialyser la nuit à 4 ° C avec une agitation douce à l'aide d'un barreau aimanté.
8. Changer la solution de dialyse de 5 L en matinée et en fin d'après midi jusqu'à une nuit d'incubation résultats dans pratiquement aucun changement de couleur (Cela prend généralement ~ 48 h avec au moins 4 échanges). En outre, avec le seuil de rétention de 50 kDa être si près de la MW de RSA, 66kDa, il est possible de ne jamais produire une solution claire, ce sera dépend de la distribution de la taille des pores de la membrane; 60 h et 5 échanges est plus de suffisamment de temps.
9. Mesurer le volume et diviser le poids initial de 100 mg par le volume de donner concentration approximative de TR-RSA; concentrations varient généralement de 10 à 13 mg / ml. Le colorant final: le rapport albumine doit être ~ 4:1, 1 fluorophore par 15,000 Daltons de MW de protéine. Conserver à 4 ° C; ne gèlent jamais la solution TR-RSA, telle qu'elle résulte fragmentation qui peut se produire va modifier les valeurs de perméabilité.

2. Préparer la platine du microscope inversé pour l'imagerie / Microscope Paramètres

1. Lieu ~ 7.4 des morceaux de ruban autoclave (environ ¾ "de long) parfaitement empilés les uns sur les autres à l'intérieur d'un plat de 50 mm avec un fond de la lamelle 40 mm (lamelle plat à fond). Celles-ci doivent être placés plus près de l'un des bords de sorte que le bord de la bande va prendre contact avec le bord de courbure du rein, mais ne bloque pas le chemin de la lumière objective (Figures 1A et 1B); rats plus grands auront besoin de plus d'espace entre la bande et le bord du plat.
2. Placer 2 Repti-Therm patins à côté de la scène aux côtés de l'antenne de 50 mm (figure 1A). Placez un réchauffement de l'eau veste couverture sur la scène.
3. Maximiser l'efficacité lors de la collecte des images en assurant la tourelle a un objectif 10x air oR 20x (air ou l'eau) objectif et un objectif à immersion d'eau alimenté élevée, pour recueillir des images pour la quantification.
4. Au cours de l'imagerie de la manière la plus efficace pour ajouter de l'eau à des objectifs est de faire tourner les sur le côté et ajouter de l'eau à l'aide d'une seringue de 1 avec un long morceau de tuyau PE-200 qui peuvent atteindre le haut des objectifs.
5. Réglez l'intensité d'excitation du laser 10watt à ~ 15-20% en utilisant les filtres de densité neutre sur le logiciel. Les arséniure de gallium phosphure photodétecteurs non descanned sont fixés à 750 pour recueillir les émissions verts, et 625 pour recueillir les émissions rouges. Émission bleue (comme la tache Hoechst 33342 nucléaire) sont collectées à l'aide d'un détecteur de multialkaline nondescanned standard avec un réglage entre 750-800.
6. Afin d'assurer la perception correcte des émissions de faible intensité à l'intérieur de l'espace de Bowman, assurez-vous que les limites inférieures des détecteurs sont réglés de manière à ne pas exclure ces valeurs. Marqueurs d'avertissement visuels indiquent si la sensibilitéréglage est trop bas, et ces valeurs est donnée une valeur d'intensité égale à zéro.
7. Chargez une seringue de 1 à ~ 5-8 mg de la solution d'albumine fluorescent dilué avec 0,9% de solution saline stérile pour faire apparaître le volume total de 1 cc.

3. Exposer le rein dans un Rat Wistar Munich pour Intravitale 2-Photon Imaging

1. Commencez avec un rat pré-anesthésiés en utilisant Pentabarbitol (50 mg / ml, solution, 120 g de poids corporel μl/100), Inactin (130 mg / ml, solution, 120 μ/100 g de poids corporel), ou isofluorane (5% induction, 1.5 à la maintenance de 2,5%), une ligne demeure veineuse d'accès (veineuse jugulaire ou fémorale soit), et le flanc gauche rasé juste en dessous de la cage thoracique juste au-dessus de la cuisse gauche.
2. Placez le rat plat sur ​​le côté droit de sorte que l', côté rasé gauche est orientée vers le haut, assurez-vous qu'il soit à plat sur ​​la table, avec sa posture allongée et pas accroupi, avec les pattes avant de toucher les uns les autres et à l'arrière des pattes de toucher l'autre (Figure 2A).
3. Très palper doucement à sentir le rein pour déterminer où il pond naturellement dans le rétropéritoine et tracer une ligne droite parallèle au corps (de la cage thoracique à la cuisse) à l'aide d'un Sharpie (figure 2A).
4. Choisir la peau avec une paire de pince à griffes, et pincer la peau le long de la ligne tracée à l'aide d'une paire de pinces hémostatiques à écraser le tissu et d'éviter des saignements. Couper le long de l'incision à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux. Broyage de la peau extérieure et les couches musculaires avant la coupe va considérablement réduire et éliminer typiquement saignement.
5. Répétez cette procédure pour la couche musculaire externe, qui est mince.
6. Pour l'incision dans la couche musculaire interne, qui va exposer le péritoine, re-palper le rein d'estimer la taille. Pincez une ligne d'incision plus petite que le rein, en assurant l'incision est juste sur le rein. Il est préférable de faire cette incision trop petite et l'agrandir si nécessaire. Si cela est fait trop grand, suture sera nécessaire.Cette dernière incision est critique; trop loin sur dans n'importe quelle direction va affecter la stabilité sur la scène et induire soit des artefacts de mouvement de la respiration (meilleur scénario) ou va étirer la perfusion pédicule rénal et réduire négativement rénale (le pire scénario).
7. Localisez le rein (comme le montre la figure 2B) et l'adhérence de la graisse entourant aide d'une pince, en travaillant vers le pôle inférieur du rein dans une main sur la mode de la main.
8. Une fois le pôle inférieur du rein est atteint, tirez doucement sur le rein à travers l'incision tout en serrant très légèrement en dessous du rein à extérioriser. Si l'incision est trop petit, écraser la couche musculaire et réduire l'élargir; répéter la procédure d'extérioriser rein.

4. Placer le Rat Wistar Munich sur la scène pour l'imagerie

1. Placer le rein vers le bord du plat de la lamelle avec le rein légèrement tourné vers la dorsale (côté arrière) du rat de sorte que le côté ventral du rein is la prise de contact avec le plat à fond lamelle (figure 1A). Ajouter une solution chauffée, stérile 09.% De solution saline à l'antenne.
2. Regardez à travers l'objectif 10x ou 20x et vérifier mouvement. Si un mouvement est détecté, rouler le rat sur ​​un peu de sorte que le thorax est plus loin de la boîte de fond de la lamelle, assurez-vous que le rein est aussi près du bord du plat sans étirement du pédicule rénal (figure 1B).

5. Acquisition d'images pour quantifier la perméabilité rénale de l'albumine

1. Le calcul de la perméabilité glomérulaire (Glomeruluar coefficient de tamisage; CGC) de toute macromolécule nécessitera de prendre des images de référence de fond de glomérules individuels avant la perfusion de la molécule fluorescente. Si votre microscope est équipé d'une platine motorisée capable d'emplacements de marquage, trouver et centre glomérules individuels en utilisant l'objectif motorisé inférieur et marquer chaque emplacement. Un double passe fluorescéine / rhodamine épifluorescence filter est idéal pour cette procédure, bien que ce soit filtre d'émission fonctionnera (contraste de phase ou d'autres sources non-fluorescence d'éclairage ne fonctionnera pas). Glomérules apparaîtra comme des structures circulaires vides entourés de tubules proximaux ayant une autoflourescence jaune-orange inhérente lorsqu'il est vu à travers le filtre double passe.
2. Si votre microscope n'a pas une platine motorisée, scannez le rein dans une configuration de trame avec l'objectif de faible puissance et de faire une carte rudimentaire où les glomérules individuels sont situés, en s'appuyant sur des repères naturels tels que les gros vaisseaux sanguins superficiels situés au-dessus de la capsule rénale ou patchs de graisse.
3. Mettez la tourelle à l'eau puissance objectif à immersion supérieur et prendre les ensembles de données 3D de chaque glomérules en s'assurant que les boucles capillaires et l'espace de Bowman sont clairement visibles. Utilisant une palette pseudocouleur (autre que B / W quelque chose) permettra de visualiser ces structures.
4. En se concentrant sur un vaisseau sanguin superficiel infuser lentement en til fluorescent s'assurant temps albumine est donnée pour permettre la distribution systémique. Pour les molécules à faible CGC, il est essentiel de maximiser les valeurs d'intensité dans le plasma, mais pas pour atteindre des niveaux qui vont saturer les photo-détecteurs au microscope. Cela augmente la détectabilité des molécules filtrées. Remarque: il existe généralement un laps sec 5-7 entre le moment où l'albumine fluorescent est introduit à la fois qu'il apparaît à l'écran (l'acquisition des images complètes à ~ 1 image / seconde).
5. Laisser environ 10 minutes pour permettre à tous les petits fragments potentiels de poids moléculaire aient disparu avant l'acquisition de volumes 3D à des intervalles de 1 um à être utilisées dans le calcul de la CGC albumine. En règle générale, la souche de Munich rats Wistar de l'Simonsen a beaucoup moins de glomérules de surface, donc tout ce qui peut être visualisée sont imagés et quantifiés. La souche Frömter dispose d'un nombre beaucoup plus élevé si nous limitons le nombre chiffré à ~ 10.
6. A la fin de l'étude, le rat est euthanasié par une surdose d'anesthésique l'IC utilisée dans l'étude. Un double pneumothoracotamy est effectuée pour assurer l'euthanasie.

6. Calcul de la CGC pour Fluorescent albumine à partir de volumes 3D

1. Grâce à un logiciel de traitement d'image Metamorph charger des ensembles de données 3D pour chaque glomérules, à la fois l'ensemble de fond et mis en prise après la perfusion de l'albumine fluorescente.
2. Dans le volume contenant le fluorescent albumine localiser une boucle capillaire superficiel avec suffisamment d'espace vide entre ses marges définies et le bord de la capsule de Bowman.
3. Dans le volume de fond localiser le même plan focal qui doit contenir toutes les indications visuelles de l'image contenant l'albumine. Sélectionnez une région dans la boucle capillaire d'intérêt et noter la valeur moyenne de l'intensité. Ensuite, sélectionnez une région dans l'espace de Bowman et noter la valeur moyenne de l'intensité. Celles-ci seront utilisées comme valeurs de référence.
4. Pour la quantification, sélectionnez la région similaire au sein de l'espace de Bowman dans le c albumineontenant image. Faites cela pour au moins deux autres régions à prendre une valeur moyenne de l'intensité moyenne à l'intérieur de l'espace de Bowman.
5. Sélectionnez la boucle capillaire avec l'intensité de plasma lumineux et dessiner une région autour d'elle. Suivant en utilisant la fonction de seuil, mettre en évidence les valeurs de luminosité dans le plasma circulant, en évitant les rayures foncées qui circulent de RBC. Remarque les valeurs d'intensité moyenne de l'espace de plasma sélectionné. Il est important de choisir de préférence les zones claires de l'écran plasma, car les facteurs dans le sang ne servent qu'à provoquer et sous-estimation des niveaux de fluorescence plasma.
6. Utiliser un tableur Microsoft Excel entrez les valeurs pour calculer la CGC où:

Résultats

La figure 3 montre un exemple d'une image prise à partir d'un glomérule de surface d'un Munich Wistar Frömter rat et les mesures prises pour déterminer la perméabilité de l'albumine fluorescente. La valeur CGC de l'albumine de 0,0111 dérivé pour cette glomérule chute individu au sein de la gamme vu dans cette souche de rats Wistar Munich lorsque dans l'état nourri ^3. La stabilité observée dans ces images est due à la planification minutieuse et l'exéc...

Discussion

Les étapes soulignés ici représentent ce que nous croyons être celles qui vont produire des valeurs de perméabilité cohérentes et précises car elles contournent les pièges suivants:

1. Diffusion: L'utilisation d'un dispositif d'émission des fluorophores rouges permettre une collecte plus efficace de la lumière depuis plus photons de longueurs d'onde sont moins enclins à se disperser. En utilisant soit des fluorophores émettant vert ou bleu va introduire une plus grande variation da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07