뮌헨의 Wistar 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 형광 고분자의 사구체 투과율을 정량화

요약

2 광자 현미경 높은 해상도 intavital을 활용하는 기술을 직접 시각화 및 표면 사구체에서 gloemrular 여과를 정량화한다. 이 방법은 정상과 질병 상태 모두에서 거대 분자의 투과 특성을 직접 측정 할 수 있습니다.

초록

같은 혈청 알부민, 긴 침투성 족으로 구성된 장벽, 혈관 내피 세포, 그리고 한마음으로 작업 기저막의 변화에​​ 의한 것으로 생각되어 같은 대형 필수 고분자의 소변 손실을 포함하는 신장 질환. intravital 2 광자 현미경을 사용하여 우리 연구소의 데이터는 근위 세뇨관 세포 (PTC)는 ^1,2 불리는 세포의 초기 집합에서 발생하는 필터링 알부민 검색과 이전에 생리 학적 조건에서 생각했던 것보다 더 투과성 사구체 여과 장벽 ^(GFB)를, 밝혀 ^3.

이전 기술은 신장 여과를 연구하는 데 사용 유체 콘텐츠 및 분석 ⁴ 샘플링이 초기 관 세그먼트의 루멘의 micropuncture을 포함 여과 장벽의 특성을 설정. 해당 밀접하게, 이러한 연구는 거의 존재하지 않는 것으로 내강 액에 알부민 농도를 결정일반적으로 소변에서 검출되는 것과. 그러나,이 기술에 의해 정의 된 크기의 덱스 트란 폴리머의 특성은 혈청 알부민과 비슷한 크기의 사람들을 밝혀 관 루멘과 소변에서 높은 수준을했다; 증가 투자율 ⁵ 제안.

여기에 직접 시각화하고 생체 내에서 사구체 형광 알부민 투과성을 계량하는 데 사용되는 기술에 대한 자세한 개요입니다. 이 방법은 보먼의 공간 (소변 여과의 초기 챔버)로 여과 장벽을 통해 여과 된 알부민을 검출 할 수 있고, 또한 근위 세뇨관과 이후 알부민 transcytosis ⁶ 시각화하여 알부민 재 흡수의 정량화 할 수 있습니다. 방광 도중에 이상 관 세그먼트에 따라 형광 알부민의 부재는 이전 근위 세뇨관 세그먼트에있는 검색 경로의 효율성을 강조 표시합니다. 또한,이 기술을 적용 할 때 투자율을 결정하기의 알부민 거의 동일 투자율 값으로 유사한 크기를 갖는 덱스 트란은 ^{2보고되었다.} 이러한 관찰은 직접 근위 세뇨관 세포 재생에 포함 된 변경에 많은 단백뇨 신장 질환의 초점을 확장 할 필요성을 지원합니다.

프로토콜

1. 설포-로다 민 101 포닐 염화물 (텍사스 레드) 알부민 쥐 혈청의 활용

1. 최종 농도 50 ML 원뿔 관에 15 밀리그램 / ML, 100 mM의 중조 산도 9.0의 쥐에서 (RSA) 혈청 알부민 6.667 ML 100 MG를 녹인다.
2. 장소 얼음 / 물 비커의 용액으로 0에서 11 ° C. 사이에 멋진
3. 15 초 동안 중간에 소용돌이, 텍사스 레드 포닐 염화물 (TRSC)의 10 mg을 유리 병에 고품질의 무수 디메틸 포름 아미드 (DMF) 200 μl를 추가합니다.
4. 소용돌이 RSA 매체에 솔루션 용해 TRSC을 추가합니다.
5. 호일 랩 50 ML 원뿔 (형성 파라 필름이 단단히 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다), 수평 W / 아이스 만과 장소 (거품 형성을 방지)을 천천히 솔루션을 선동하는 로커에 얼음 양동이에 장소는 반응이 0에서 계속할 수 4 ° C 1 시간 동안.
6. 0.9 % 생리 식염수 5 L를 확인하고 클립 하나) 투석 막을 수 있습니다 챔버 떨어져 컷 50 kDa의 분자량, B) 디 젖은플로트 - lyzer, 또는 c) 슬라이드 - lyzer 카세트 (접합 TRSC을 제거하기위한 모든 적절한)에서와 같이 투석 튜브.
7. 5 L 컨테이너 W / 0.9 % 생리 식염수에 투석 챔버와 장소에서 개최 반응 혼합물은, 교반 막대를 사용하여 부드러운 교반과 함께 4 ° C에서 하룻밤을 dialyze.
8. 사실상 색상 변화에 하룻밤 배양 결과 (이 일반적으로 최소 4 교류와 함께 ~ 48 시간 소요)까지 아침과 늦은 오후에 5 L 투석 솔루션을 변경합니다. 또한, 50 kDa의의 MWCO가 RSA, 66kDa의 분자량에 너무 가까이되고 함께, 그것은 명확한 솔루션을 생성하지 않을 수 있습니다,이 멤브레인의 기공 크기의 분포에 따라 달라집니다, 60 시간, 5 교환합니다 충분한 시간을보다.
9. 측정 볼륨 및 TR-RSA의 대략적인 농도를 제공하기 위해 부피 100 MG의 초기 무게를 분할, 일반적으로 농도 범위 10-13 MG / ML. 최종 염료 : 알부민 비율은 15.00 당 ~ 4:1 1 형광해야한다단백질 MW 0 달톤. 4에서 보관 ° C; 발생할 수있는 조각화가 발생하면 투자율 값을 변경하므로, TR-RSA 솔루션을 일시 정지하지 마십시오.

2. 이미지 / 현미경 설정 거꾸로 현미경 스테이지를 준비

1. 장소 ~ 오토 클레이브 테이프의 4-7 조각 (약 ¾ "롱) 완벽 40mm의 coverslip을 바닥 (coverslip에 바닥 접시)와 50mm 접시 내부에 서로 위에 쌓아.이는 가장자리 중 하나에 가까이 위치해야하므로 테이프의 가장자리 신장의 곡률의 가장자리와 접촉을하지만, 목표 빛의 경로 (그림 1A와 1B) 차단하지 않습니다, 큰 쥐가 요리의 테이프와 가장자리 사이에 더 많은 공간이 필요합니다.
2. 50 밀리미터 접시 (그림 1A)와 함께 무대 옆에 위치 2 Repti - 칼로리 패드. 무대 위에 온난화 물 재킷 담요를 놓습니다.
3. 객관적인 포탑을 보장하여 이미지를 수집하는 배 공기 O가있을 때 효율성을 극대화R 20X (공기 또는 물 침지) 객관적이고 정량 이미지를 수집하기 위해 높은 전원 침수 목표.
4. 영상 중에 목표에 물을 추가하는 가장 효율적인 방법은 측면에 회전 및 목표의 상단에 도달 할 수 PE-200 튜브의 긴 조각 1 CC의 주사기를 사용하여 물을 추가하는 것입니다.
5. 소프트웨어에 대한 중립적 인 밀도 필터를 사용하여 ~ 15 % ~ 20 %로 10w 레이저 여기 강도를 설정합니다. 갈륨 비소 인화물 비 descanned 광 검출기는 빨간색으로 배출량을 수집하는 녹색 배기 가스 및 625를 수집하기 위해 750로 설정됩니다. 블루 배출 (예 : 핵 얼룩 훽스트 33342)를 750-800 사이의 설정으로 표준 nondescanned multialkaline 탐지기를 사용하여 수집하고 있습니다.
6. 보먼의 공간에 낮은 강도 배출의 적절한 컬렉션을 보장하기 위해 검출기의 낮은 한계가이 값을 제외하지 않는 정도로 설정되어 있는지 확인합니다. 시각적 인 경고 표지가 표시됩니다 경우 감도설정이 너무 낮으며이 값이 0의 강도 값을 부여하고있다.
7. 1 CC의 전체 볼륨을 가지고 0.9 % 멸균 식염수로 희석 형광 알부민 용액의 ~ 5-8 MG와 1 CC의 주사기를로드합니다.

3. Intravital 위해 뮌헨의 Wistar 쥐의 신장을 노출 2 광자 이미징

1. Pentabarbitol (50 MG / ML 솔루션 120 μl/100 G 체중), Inactin (130 밀리그램 / ML 솔루션 120 μ/100 G 체중) 또는 Isofluorane (5 % 유도 1.5을 사용하여 미리 마취 쥐의 시작 ) 2.5 % 유지 보수, 내주 정맥 액세스 회선 (중 경정맥이나 대퇴 정맥), 왼쪽 측면은 흉곽 아래의 바로 왼쪽 허벅지 위에서 면도.
2. 그래서 그 오른쪽에 평평 쥐를 놓고 그 왼쪽, 면도면이 위로 향하고, 그 자세 늘어 (그림 앞발이 서로 닿지 서로 뒤 발을 만지고, 웅크 리고하지로는, 테이블에 평평하게되어 있는지 확인 2A).
3. 아주 부드럽게 자연스럽게 복막 내 낳는 위치를 결정하고 빈틈을 사용하여 몸 (허벅지 흉곽부터) (그림 2A)에 평행 한 직선을 그릴 신장을 느끼고 만져.
4. 이빨 포셉 한 쌍의 피부를 선택하고, 조직을 분쇄하고 출혈을 방지하기 위해 hemostats의 쌍을 사용하여 그린 선을 따라 피부를 꼬집어. 외과 가위를 사용하여 절개를 따라 잘라. 절단하기 전에 바깥 쪽 피부와 근육 층을 분쇄 극적으로 절감하고 일반적으로 출혈을 제거합니다.
5. 얇은 바깥 쪽 근육 레이어에 대해이 절차를 반복합니다.
6. 복막을 노출 할 내부 근육 층에 절개를 들어, 크기를 추정하기 위해 신장을 다시 만져. 신장보다 작은 절개 라인이 끼지; 절개를 보장하는 것은 바로 신장 이상이다. 그것은이 절개가 너무 작하고 필요한 경우 그것을 더 크게 만들 것이 좋습니다. 이 너무 큰 한 경우 봉합이 필요합니다.이 마지막 절개 중요하다, 너무 멀리 어떤 방향에하면 무대에서의 안정성에 영향을 미칠 유도 호흡 (최상의 시나리오)에서 하나의 모션 아티팩트를하거나 신장 작은 꽃자루에 악영향 감소 신장 관류 (최악의 경우) 늘릴 것입니다 것입니다.
7. 손 패션을 통해 손에 신장의 아래쪽 극을 향해 노력하고, 신장 (그림 2B 참조) 그립 집게를 사용하여 주변의 지방을 찾습니다.
8. 신장의 하부 극에 도달하면 매우 부드럽게 외면하는 신장 아래로 압박하면서, 조심스럽게 절개를 통해 신장을 당깁니다. 절개가 너무 작은 경우, 근육 층을 분쇄하고 넓혀 절단, 신장을 외면하는 절차를 반복합니다.

4. 이미징을위한 스테이지에서 뮌헨의 Wistar 쥐를 배치

1. 신장에 coverslip을 접시의 가장자리쪽으로 신장을 놓고 약간 쥐의 등쪽 (뒷면)으로 회전 신장의 복부 측면 그래서s는 coverslip을 바닥 접시 (그림 1A)와 접촉을 만들기. 접시에 따뜻하게, 멸균 09. % 생리 식염수를 추가합니다.
2. 10 배 또는 20 배 목표를보고 동작을 확인합니다. 움직임이 감지되면 가슴이 멀리 coverslip을 바닥 접시에서 그래서 약간에 쥐 롤, 신장 등의 신 경 (그림 1B)를 스트레칭없이 접시의 가장자리에 가까이 있는지 확인합니다.

5. 알부민의 신장 침투성을 정량화하는 이미지 획득

1. 사구체 투과성 (Glomeruluar 체질 계수, GSC) 계산하는 고분자의 것은 이전에 형광 분자의 주입에 개별 사구체 참조 배경 이미지를 촬영해야합니다. 귀하의 현미경 마킹 위치 할 수있는 전동 무대가 장착되어있는 경우, 찾아 낮은 전원 공급 목표를 사용하여 센터 개인 사구체 각각의 위치를​​ 표시합니다. 듀얼 패스 형광 / 로다 민 epifluorescence에 FIL하나 방출 필터 (위상 대비 또는 조명의 다른 비 형광 소스가 작동하지 않습니다) 작동하지만 터이 절차에 이상적입니다. 사구체는 듀얼 패스 필터를 통해 볼 때 고유의 노란색 - 오렌지 autoflourescence을 가진 근위 세뇨관으로 둘러싸인 빈 원형​​ 구조로 표시됩니다.
2. 귀하의 현미경 자동화 단계가없는 경우, 저전력 목적으로 래스터 패턴 신장 스캔 및 개별 사구체의 위치의 기초지도를 만든다; 같은 신장 캡슐 위에있는 큰 표면 혈관 등의 자연 명소에 의존 또는 지방 패치.
3. 높은 전력 침수 목표로 포탑을 전환하고 모세관 루프와 보먼의 공간을 명확하게 볼 수 있습니다 확인하고 각 사구체의 3D 데이터 세트를 가지고. 사색 팔레트 (B / W 이외)를 사용하여 이러한 구조를 시각화하는 데 도움이 될 것입니다.
4. 표면의 혈관에있는 집중 천천히 t에 주입그는 형광 알부민 결정해야 시간이 전신 배포 할 수 있도록 제공됩니다. 낮은 GSC와 분자의 경우는 플라즈마 강도 값을 최대화하는 것이 아니라 현미경 사진 탐지기를 포화 수준에 도달하지 필수적입니다. 이 필터링 분자의 검출을 증가시킵니다. 주 : (1 프레임 / 초 ~에서 전체 프레임을 취득) 화면에 나타나는 형광 알부민이 시간에 도입되는 시간 사이에 5-7 초 경과는 일반적으로있다.
5. 약 10 분은 잠재적 작은 분자량 조각이 알부민 GSC를 계산에 사용되는 1 ㎛ 간격으로 3 차원 볼륨을 취득하기 전에 취소 할 수 있도록 허용합니다. 일반적으로, 뮌헨의 Wistar 쥐의 시몬의 긴장이 훨씬 적은 표면 사구체를 가지고 시각화 할 수있는 모든 이미징 및 정량되도록. 우리는 ~ 10 정량화 수를 제한 할 수 있도록 Frömter 변형이 훨씬 더 큰 번호가 있습니다.
6. 연구의 끝에서 쥐가 anesthet의 과다 복용을 통해 안락사됩니다IC는 연구에 사용됩니다. 이중 pneumothoracotamy는 안락사를 보장하기 위해 수행됩니다.

6. 3D 볼륨에서 형광 알부민 GSC를 계산

1. Metamorph 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 배경 설정 모두 각각의 사구체에 대한 3D 데이터 세트를로드하고 형광 알부민 주입 후 촬영 설정합니다.
2. 정의 된 여백과 보먼의 캡슐의 가장자리 사이에 충분한 공간 빈 공간 표면 모세관 루프를 찾습니다 형광 알부민을 포함하는 볼륨.
3. 배경 볼륨에서 알부민 함유 이미지의 시각적 단서를 포함해야 동일한 초점 비행기를 찾습니다. 관심 모세관 루프 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 수치를 기록합니다. 다음 보먼의 공간 내에서 영역을 선택하고 평균 강도 판독 값을 기록합니다. 이러한 배경 값으로 사용됩니다.
4. 정량, 알부민 C에서 보먼의 공간에 유사한 지역을 선택이미지를 ontaining. 보먼의 공간 내에서의 평균 강도에 대한 평균 값을 적어도 두 개의 다른 지역에 대해이 작업을 수행합니다.
5. 밝은 플라즈마 강도 모세관 루프를 선택하고 주변 지역을 그립니다. 임계 값 기능을 사용하여 다음 RBC의 순환하는 어두운 줄무늬를 피하고, 순환 혈장 내에서 밝은 값을 강조 표시합니다. 선택한 플라즈마 공간의 평균 강도 값을 기록합니다. 혈액 내 요소는 원인이 플라즈마 형광 수준을 과소 평가하는 역할을하기 때문에 그것은 우선적으로 플라즈마의 밝은 영역을 선택하는 것이 중요합니다.
6. Microsoft Excel 스프레드 시트 어디 GSC를 계산하는 값을 입력하여 :

결과

그림 3은 뮌헨의 Wistar Frömter 쥐와 형광 알부민 투과성을 결정하기 위해 수행하는 단계의 표면 사구체에서 촬영 한 이미지의 예를 보여줍니다. 0.0111의 알부민 GSC 값은 뮌헨의 Wistar 쥐 때 공급 조건 ^3이 변형에서 볼 수있는 범위 내에서이 개별 사구체 가을을위한 것. 이 이미지에서 볼 수있는 안정성은 신중한 계획과 그림 1과 2에 묘사 된 명령어의 실행 때문이다. ?...

토론

여기에서 강조하는 단계는 우리가들은 다음과 같은 함정을 피할 수 있기 때문에 일관되고 정확한 투자율 값을 생성 할 것 느끼는 것을 나타냅니다 :

1. 산란 : 긴 파장의 광자가 산란 적은 경향이 있기 때문에 적색 발광 형광체의 사용은 빛을보다 효율적으로 수집을 할 수 있습니다. 하나 녹색 또는 청색 발광 형광체를 사용하기 때문에 모세관 루프와 보먼의 공간 ^3에서 강도 값의 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07