Cuantificación de la permeabilidad glomerular de macromoléculas fluorescentes mediante microscopía 2-Photon en Munich Ratas Wistar

Resumen

Una técnica de la utilización de alta resolución intavital 2 fotones microscopía de visualizar directamente y cuantificar la filtración gloemrular en los glomérulos superficie. Este método permite la determinación directa de las características de permeabilidad de macromoléculas tanto en estados normales y enfermos.

Resumen

Enfermedades renales que implican la pérdida urinaria de grandes macromoléculas esenciales, tales como albúmina de suero, durante mucho tiempo han sido pensado para ser causada por alteraciones en la barrera de permeabilidad compuesta de podocitos, células endoteliales vasculares, y una membrana basal de trabajo al unísono. Los datos de nuestro laboratorio utilizando microscopía intravital 2 fotones revelaron una barrera más permeable filtración glomerular (GFB) que se creía en condiciones fisiológicas, con la recuperación de la albúmina filtrada que ocurre en un subconjunto inicial de células llamadas células de los túbulos proximales (PTC) ^{1,2, 3.}

Las técnicas anteriores han usado para estudiar la filtración renal y el establecimiento de la característica de la barrera de filtración involucrados micropunción del lumen de estos primeros segmentos tubulares con el muestreo de los contenidos y el análisis de fluido ^4. Estos estudios determinaron la concentración de albúmina en el fluido luminal de ser prácticamente inexistente; corresponde estrechamentea lo que se detecta normalmente en la orina. Sin embargo, la caracterización de los polímeros de dextrano con tamaños definidos por esta técnica reveló los de un tamaño similar a la albúmina sérica tenían niveles más altos en el lumen tubular y la orina, sugiriendo aumento de la permeabilidad ^5.

En esto es un esquema detallado de la técnica utilizada para visualizar y cuantificar directamente glomerular fluorescente permeabilidad a la albúmina in vivo. Este método permite la detección de la albúmina filtrada a través de la barrera de filtración en el espacio de Bowman (la cámara inicial de la filtración urinaria), y también permite la cuantificación de la albúmina por la reabsorción de los túbulos proximales y la visualización posterior de transcitosis albúmina ^6. La ausencia de albúmina fluorescente a lo largo de los segmentos tubulares posteriores en la ruta a la vejiga pone de relieve la eficacia de la vía de recuperación en los segmentos proximales antes del túbulo. Por otra parte, cuando se aplica esta técnica para determinar la permeabilidadSe informó de dextranos que tienen un tamaño similar a los valores de permeabilidad virtualmente idénticos albúmina ^2. Estas observaciones apoyan directamente la necesidad de ampliar el foco de muchas enfermedades renales proteinúricas a modificaciones incluidas en la recuperación de células del túbulo proximal.

Protocolo

1. Conjugación de albúmina de suero de rata Sulfo-rodamina 101 cloruro de sulfonilo (Rojo Texas)

1. Disolver 100 mg de albúmina de suero de rata (RSA) en 6.667 ml de 100 mM de bicarbonato de sodio pH 9,0; concentración final 15 mg / ml en un tubo de 50 ml cónico.
2. Solución Colocar en hielo / agua vaso de precipitados y se enfría a entre 0 y 4 ° C.
3. Añadir 200 l de formamida dimetil alta calidad anhidra (DMF) a un vial de 10 mg de cloruro de sulfonilo Texas Red (TRSC); vórtice en el medio durante 15 segundos.
4. Solución RSA Vortex en medio y añadir el TRSC disuelto.
5. Resumen 50 ml cónica en papel de aluminio (Parafilm se puede utilizar para asegurar un sello hermético se forma), lugar horizontalmente w / hielo y el lugar sólo en eje de balancín para agitar la solución lentamente (evitar la formación de burbujas) en el cubo de hielo, permitir la reacción continúe a 0 a 4 ° C durante 1 hora.
6. Hacer 5 L de solución salina al 0,9%, y mojar un peso molecular de 50 kDa cortar cámara que puede ser o bien una membrana) de diálisis con clips, b) ditubería de estudio de carácter como en un flotador-un-Lyzer, o c) casete de diapositiva-a-Lyzer (especialmente adecuada para la eliminación de TRSC no conjugada).
7. Lugar mezcla de reacción en la cámara de diálisis y el lugar en el recipiente de 5 L w / la solución salina al 0,9%, dializa durante la noche a 4 ° C con una agitación suave usando una barra de agitación.
8. Cambiar la solución de diálisis 5 L en la mañana y en la tarde hasta una incubación durante la noche resultados en prácticamente ningún cambio de color (Esto suele tardar ~ 48 horas con al menos 4 intercambios). Además, con la MWCO de 50 kDa estar tan cerca de la MW de RSA, 66 kDa, es posible nunca producir una solución transparente, lo que será dependiente de la distribución en el tamaño de los poros de la membrana; 60 hr y 5 es intercambios tiempo más que suficiente.
9. Medir el volumen y dividir el peso inicial de 100 mg por el volumen para obtener una concentración aproximada de TR-RSA; típicamente gama concentraciones del 10-13 mg / ml. El colorante final: cociente albúmina debe ser ~ 04:01, 1 fluoróforo por 15,000 Daltons MW de proteína. Almacenar a 4 ° C; Nunca congele la solución TR-RSA, como resultado la fragmentación que puede ocurrir va a alterar los valores de permeabilidad.

2. Preparación de la platina del microscopio invertido para Ajustes de imagen / Microscopio

1. Lugar ~ 4-7 piezas de cinta de autoclave (aproximadamente ¾ "de largo) perfectamente apilados uno sobre el otro en el interior de un plato de 50 mm con un cubreobjetos de 40 mm de la parte inferior (cubreobjetos plato inferior). Estos se deben colocar más cerca de uno de los bordes de modo que el borde de la cinta hará contacto con el borde de curvatura del riñón pero no bloquear la trayectoria de luz objetivo (Figuras 1A y 1B); ratas más grandes requerirán más espacio entre la cinta y el borde del plato.
2. Coloque 2 toallas Repti-Therm próximos al escenario junto con el plato de 50 mm (Figura 1). Coloque una manta camisa de agua de calentamiento sobre el escenario.
3. Maximizar la eficiencia en la recogida de imágenes, asegurando la torreta objetivo tiene un 10x de aire or 20x (aire o agua de inmersión) objetivo y un objetivo de inmersión en agua de mayor potencia para recopilar imágenes para la cuantificación.
4. Durante la proyección de imagen de la forma más eficaz de añadir agua a los objetivos consiste en hacer girar a un lado y agregar el agua con una jeringa de 1 cc con un pedazo largo de tubería de PE-200 que se puede llegar a la cima de los objetivos.
5. Ajuste la intensidad de excitación del láser de 10 vatios ~ 15-20% utilizando los filtros de densidad neutra en el software. El galio-arseniuro fosfuro fotodetectores no descanned se establecen en 750 para recoger el verde, emisiones y 625 para recoger las emisiones rojas. Azul de emisión (por ejemplo, el tinte nuclear Hoechst 33342) se recogió mediante un detector de multialkaline nondescanned estándar con un valor entre 750-800.
6. Para asegurar la recolección adecuada de las emisiones de baja intensidad dentro del espacio de Bowman, asegurarse de que los límites inferiores de los detectores se establecen a fin de no excluir estos valores. Marcadores de alarma visuales indicarán si la sensibilidadajuste es demasiado bajo y estos valores se les está dando un valor de intensidad de cero.
7. Cargue una jeringa de 1 cc con ~ 5-8 mg de la solución de albúmina fluorescente diluido con 0,9% de solución salina estéril para criar a un volumen total de 1 cc.

3. La exposición del riñón en una rata Wistar Munich por intravital 2-Photon imágenes

1. Comience con una rata de pre-anestesiados utilizando Pentabarbitol (50 mg / ml de solución, μl/100 120 g de peso corporal), inactina (130 mg / ml de solución, μ/100 120 g de peso corporal), o isofluorano (5% de inducción, 1.5 al mantenimiento 2,5%), una línea morada venosa acceso (ya sea venosa yugular o femoral), y el flanco izquierdo afeitado desde justo debajo de la caja torácica hasta justo por encima del muslo izquierdo.
2. Coloque la rata plana en su lado derecho para que el lado izquierdo afeitado quede hacia arriba, asegúrese de que está sobre la mesa, con su postura alargada y no se agachó, con las patas delanteras tocando entre sí y con las patas traseras toquen entre sí (Figura 2A).
3. Muy palpar suavemente para sentir el riñón para determinar donde naturalmente se establecen en el retroperitoneo y trace una línea recta paralela al cuerpo (de la caja torácica hasta el muslo) con un Sharpie (Figura 2A).
4. Recoge la piel con un par de pinzas dentadas y pellizcar la piel a lo largo de la línea trazada con un par de pinzas hemostáticas para aplastar el tejido y evitar el sangrado. Corte a lo largo de la incisión usando un par de tijeras quirúrgicas. Aplastar la piel exterior y las capas de músculo antes de la de corte se reducirá dramáticamente y típicamente eliminar el sangrado.
5. Repita este procedimiento para la capa muscular externa, que es delgada.
6. Para la incisión en la capa muscular interna, que se exponga el peritoneo, re-palpar el riñón para estimar el tamaño. Apriete una línea de incisión más pequeña que el riñón; asegurando la incisión es sólo sobre el riñón. Lo mejor es hacer la incisión muy pequeña y hacerlo más grande si es necesario. Si esto se hace demasiado grande, se requiere sutura.Esta última incisión es crítica; demasiado en uno u otro sentido afectará la estabilidad en el escenario e inducir ya sea artefactos de movimiento de la respiración (el mejor de los casos) o va a estirar la perfusión renal pedículo renal y reducir negativamente (en el peor de los casos).
7. Localice el riñón (como se muestra en la Figura 2B) y agarre la grasa que rodea el uso de fórceps, trabajando hacia el polo inferior del riñón en una mano sobre mano de la moda.
8. Una vez que se alcanza el polo inferior del riñón, tire suavemente del riñón a través de la incisión al momento de apretar suavemente por debajo del riñón para exteriorizar. Si la incisión es demasiado pequeño, aplastar la capa muscular y cortar para ensancharlo; repetir el procedimiento para exteriorizar riñón.

4. Colocación de la rata Wistar Munich en el escenario de la Imagen

1. Coloque el riñón hacia el borde del plato cubreobjetos con el riñón ligeramente girada hacia el (lado posterior) dorsal de la rata por lo que el lado ventral del riñón is de hacer contacto con el plato inferior cubreobjetos (Figura 1A). Añadir un 09. Solución calentada,% de solución salina estéril al plato.
2. Mire a través del objetivo de 10x o 20x y comprobar el movimiento. Si se detecta movimiento, gire la rata sobre un poco para el tórax es más lejos del plato inferior cubreobjetos, asegúrese de que el riñón está tan cerca del borde del plato sin estirar el pedículo renal (fig. 1B).

5. Adquisición de imágenes para cuantificar la permeabilidad renal de albúmina

1. Cálculo de la permeabilidad glomerular (Glomeruluar coeficiente de tamizado; SGC) de cualquier macromolécula será necesario tomar imágenes de fondo de referencia glomérulos individuales antes de la infusión de la molécula fluorescente. Si su microscopio está equipado con una platina motorizada capaz de posiciones de marcación, encontrar y centro de glomérulos individuales con el objetivo de menor potencia y marque cada ubicación. Un pase doble fluoresceína / rodamina epifluorescencia filter es ideal para este procedimiento, aunque cualquier filtro de emisión funcionará (contraste de fase o de otras fuentes no fluorescentes de iluminación no funciona). Los glomérulos aparecerá como estructuras circulares vacíos rodeados por túbulos proximales tienen un autoflourescence amarillo-naranja inherente cuando se ve a través del filtro de doble paso.
2. Si su microscopio no tiene una etapa motorizada, escanear el riñón en un patrón de trama con el objetivo de baja potencia y hacer un mapa rudimentario de donde están situados los glomérulos individuales, basándose en puntos de referencia naturales tales como grandes vasos sanguíneos superficiales situadas por encima de la cápsula renal o manchas de grasa.
3. Cambie la torreta con el objetivo de inmersión en agua mayor potencia y tomar conjuntos de datos 3D de cada glomérulos asegurándose de que las asas capilares y el espacio de Bowman son claramente visibles. Utilizando una paleta de pseudocolor (algo que no sea B / W) ayudará a visualizar estas estructuras.
4. Centrarse en un vaso sanguíneo superficial lentamente infundir en tél fluorescente albúmina toma tiempo que se da para permitir la distribución sistémica. Para las moléculas con baja SGC es esencial para maximizar los valores de intensidad en el plasma pero no para llegar a niveles que saturar los fotodetectores en el microscopio. Esto aumenta la detectabilidad de las moléculas de filtrados. Nota: por lo general hay un lapso de 5-7 segundos entre el momento de la albúmina fluorescente se introduce a la vez que aparece en la pantalla (la adquisición de imágenes completas en ~ 1 fotograma / segundo).
5. Deje aproximadamente 10 minutos para que los pequeños fragmentos posibles peso molecular se desvanezcan antes de la adquisición de volúmenes 3D a intervalos de 1 micras que se utilizarán en el cálculo de GSC albúmina. Por lo general, la tensión de Munich ratas Wistar del Simonsen tiene muchos menos glomérulos superficiales, por lo que todo lo que se puede visualizar son imágenes y cuantificados. La cepa Frömter tiene un número mucho mayor de lo que se limita el número cuantificado de ~ 10.
6. Al final del estudio, la rata se sacrificó a través de una sobredosis de la anestésicosCI utilizado en el estudio. Un doble pneumothoracotamy se lleva a cabo para asegurar la eutanasia.

6. Cálculo de GSC para fluorescente albúmina de volúmenes 3D

1. El uso de software de procesamiento de imágenes Metamorph cargar los conjuntos de datos 3D para cada glomérulos, tanto en el conjunto de antecedentes y establecer tomada después de la infusión de albúmina fluorescente.
2. En el volumen que contiene la albúmina fluorescente localizar un bucle capilar superficial con espacio suficiente espacio vacío entre sus márgenes definidos y el borde de la cápsula de Bowman.
3. En el volumen de fondo localizar el mismo plano focal que debe contener todas las señales visuales de la imagen que contiene albúmina. Seleccione una región dentro del loop capilar de interés y anote la lectura de intensidad media. A continuación, seleccione una región en el espacio de Bowman y anote la lectura de intensidad media. Estos serán utilizados como los valores de fondo.
4. Para la cuantificación, seleccione la región similar en el espacio de Bowman en el c albúminaontaining imagen. Haga esto por lo menos otras dos regiones a un valor medio de la intensidad media en el espacio de Bowman.
5. Seleccione el loop capilar con la intensidad plasma brillante y dibujar una región que lo rodea. Siguiente con la función de umbral, resalte los valores brillantes dentro del plasma circulante, evitando las rayas oscuras que circulan glóbulos rojos. Tenga en cuenta los valores medios de intensidad del plasma del espacio seleccionado. Es importante seleccionar preferentemente las zonas brillantes del plasma debido a factores dentro de la sangre sólo servirá para provocar y la subestimación de los niveles de fluorescencia de plasma.
6. Usando una hoja de cálculo de Microsoft Excel introducir los valores para calcular el GSC donde:

Resultados

La Figura 3 muestra un ejemplo de una imagen tomada de una superficie de un glomérulo Múnich Frömter rata Wistar y las medidas adoptadas para determinar la permeabilidad de la albúmina fluorescente. El valor GSC para la albúmina de 0.0111 deriva de este otoño glomérulo individual dentro del rango observado en esta cepa de ratas Wistar Munich cuando en el estado alimentado ^3. La estabilidad se ve en estas imágenes es debido a la planificación y ejecución de las instrucciones represen...

Discusión

Los pasos que destacamos a continuación representan lo que sentimos al ser los que van a producir los valores de permeabilidad consistentes y precisos, ya que eludir las trampas siguientes:

1. Dispersión: El uso de un rojo fluoróforos que emiten permite una mayor eficiencia recaudatoria de la luz ya que los fotones de longitud de onda más largas son menos propensos a la dispersión. Utilizando cualquiera de fluoróforos que emiten verde o azul introducirá una mayor variación en el GSC de debido a la mayo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope	Olympus America		Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser	Spectra-Physics		Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors	Hamamatsu Corp		Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software	Molecular Dynamics		Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel	Microsoft Corportation		2007 version
Handling Forceps	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300	Electron Microscopy Sciences	Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad	Gaymar		T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater	ZooMed		RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride	Invitrogen/Molecular Probes	Cat# T-353
Rat Serum Albumin	Sigma Aldrich	Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF	Sigma Aldrich	Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape	Fisher Scientific	Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)	Electron Microscopy Sciences	Cat# 70665-07