דור של cardiomyocytes אדם: פרוטוקול בידול מתאי גזע מושרה pluripotent אדם ללא מזין

Summary

תאי גזע pluripotent, או גזע pluripotent (שב"ס) תאים עובריים או מושרה, מהווים מקור חשוב של תאים מובחנים אדם, כוללים שריר לב. כאן, אנו נתמקד באינדוקצית לב של תאי iPS, מראים כיצד להשתמש בם כדי להשיג cardiomyocytes האנושי מתפקד באמצעות פרוטוקול המבוסס על גופי embryoid.

Abstract

על מנת לחקור את אירועי נהיגה לב ופיתוח כדי לקבוע את המנגנונים המולקולריים המובילים למחלות שריר הלב בבני אדם, זה חיוני ראשון ליצירת cardiomyocytes האנושי מתפקד (CMS). השימוש בתאים אלה בגילוי תרופות ומחקרי רעלים היינו גם להיות מועילים מאוד, המאפשרים מולקולות תרופתיות חדשות לטיפול בהפרעות בלב להיות מאומת טרום קליני בתאים ממקור אנושי. המקורות האפשריים של CMS, המושרה גזע pluripotent (שב"ס) תאים הם בין המבטיח ביותר, כפי שהם יכולים להיגזר מרקמת מטופל נגישה ובעלי יכולת פנימית כדי להצמיח את כל סוגי התאים בגוף ^1. מספר שיטות הוצעו להפרדת תאי iPS למערכת ניהול תוכן, הנעות בין גופי embryoid הקלסיים (EBS) גישה לפרוטוקולי צבירת הגדרה כימית ^2,3. במאמר זה אנו מציעים פרוטוקול מבוסס EBS ולהראות איך זה methoיכול להיות מועסק ד כדי לייצר ביעילות תאים דמויי CM פונקציונליים מתאי iPS מזין ללא.

Introduction

מבחינה היסטורית, החקירה של המנגנונים הגנטיים ומולקולריים הנהיגה פיתוח ומחלות של בני אדם הייתה מבוססת על הדור של מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטי. עם זאת, פנוטיפים אדם רבים אינם מצליח להיות משוכפלים בהצלחה בעכברים, בעיקר בגלל ההבדלים הביולוגיים הקיימים בין שני המינים. מצד השני, גישה לרקמות אדם עשוי להיות מוגבל, ולעתים קרובות אינו מאפשר מספיק חומר כדי להתקבל ללימודים ניסיוניים לעומק. תחום הביולוגיה לב וכלי דם סובל משתי המגבלות האלה: הפיסיולוגיה של הלב האנושי היא שונה באופן משמעותי מזה של העכבר, וכמות משמעותית של רקמת לב היא נגישה רק נתיחה שלאחר מוות או במהלך ניתוח לב. מציאת מקור אופטימלי לבידול של תפקודי האנושי CMS לכן הפכה נושא מרכזי בביולוגיה לב וכלי דם, והרבה מאמץ נעשה כדי לטפל בבעיה זו. סוגי תאים שונים הוצעו, אניncluding myoblasts שלד, תאים מקומיים לב גזע, תאי mononuclear מח עצם, תאי אב אנדותל, ותאי גזע mesenchymal. עם זאת, נתונים שהושגו באמצעות תאים אלה לא היו עקבי ^4.

הגזירה של תאי גזע עובריים אנושיים (ESC) ⁵ והגילוי פורץ של (IPS) תאי גזע pluripotent מושרה על ידי יאמאנאקה ותומסון ^6,7 נראו תחילה מאוחר יותר כדי לספק פתרונות: התאים הללו יש את היכולת לגדול ללא הגבלת זמן ואת הפוטנציאל לתת תעלה לכל נגזרי התא של שלוש השכבות הנבט, כולל מערכת ניהול התוכן. השימוש בתאי iPS מציע יתרונות נוספים: הנגזרים מתאי בוגרים אוטולוגי, הם נושאים את אותו הגנום כפרט או המטופל שממנו הם נובעים. לכן הם מאפשרים פיתוח של מודלים במבחנה המאפשרים החקירה של מחלות גנטיות באדם ובמנגנונים של התפתחות. בכוחו של מאפיין זה, תאי iPS יכולים גם oבעיות הקשורות לvercome דחייה חיסונית וסוגיות אתיות ^8. מסיבות אלה, למרות שESCs עדיין מייצג את תקן הזהב בתחום הביולוגיה של תאי גזע, בכל העולם חוקרים כיום נעים יותר לכיוון טכנולוגיית תאי iPS.

תאי iPS כעת מועסקים למודל מחלה אנושית במבחנה לתנאים שונים, כולל הפרעות מולדות ^9,10 לב וכלי דם. לאחרונה, יישום של מודלים מחלה תא iPS נעשה להפרעות בלב monogenic (תסמונות QT ארוכות, טכיקרדיה חדרית כלומר פולימורפית catecholaminergic) ומוזרויות שבו מומי לב הם חלק מהפנוטיפ מורכב (כלומר Leopard ותסמונות טימותי, קרדיומיופתיה מורחבת). דוחות אלה אישר כי תאי iPS מטופל ספציפי הנבדלים לCMS להציג מאפיינים פנוטיפי ופונקציונליים דומים כמו המחלה בגוף חי.

עם זאת, ישאתגרים עדיין רבים לשפר את היעילות של תאי iPS גרימת לשושלת לב. דור הספונטני של CMS מESCs אדם דרך היווצרות המצרפי נקרא גופי embryoid (EBS) הוכיחו ¹⁷ מוצלחים. מאז הגילוי הזה, שיטות רבות אחרות שהוצעו. קבוצות רבות הגבירו מאוד את היעילות של פרוטוקול הבידול ועברה לפעול בריאגנטים תרבות הגדרה כימית וללא בעלי החיים מוצר (ראה Mummery, ג, et al., מחקר מחזור (2012) לסקירה מקיפה של כל השיטות הקיימות ³ ).

עם זאת, השיטה הקלסית המבוססת על צבירת EB עדיין מייצגת מועסק הנפוצה ביותר לביצוע מחקרים תפקודיים וחוקר מנגנוני מחלה. הפרוטוקול המוצע שלנו מבוסס על הצבירה של תאי iPS לEBS והתרבות בנוכחות חומצה אסקורבית וסרום, אשר הוכח כדי לשפר את תהליך בידול הלב ולפוsitively להשפיע על ההבשלה של תאים אלה ^18,19. במאמר זה אנו נעבור על מתודולוגיה זו בפירוט ונראים כיצד להשתמש בשורות תאי iPS מזין ללא ליצירת מטופל ספציפי CMS IPS-נגזר.

Protocol

1. תחזוקה ללא מזין וPassaging של שורות תאי iPS אדם

1. הכן את מנות Matrigel מצופים. הפשירו בקבוקון אחד של מטריקס ESC-מוסמך האנושי על קרח למשך שעה אחת ולדלל אותו ב25 מדיום DMEM-F12 מ"ל. הוסף 1 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ (או כמויות מקבילות לשטח פנים אם נעשו שימוש במנות אחרות), שמירה על כל מה שעל קרח ולהבטיח כי כל הצלחות והצינורות הם מראש מקוררים. אטמים ברדיד אלומיניום.

הערה: ריכוזי מניות Matrigel משתנות בהתאם למנה. הוראות דילול מצוינות בגיליון נתונים.

2. שמור על צלחות על קרח בלילה ולהסיר מקרח ביום שלמחרת. יכולות להישמר במקרר צלחות עד שבוע לפני השימוש.
3. הכן בינוני המלא mTESR1 (או להפשיר בקבוקון של מדיום Nutristem) וH-ESM (בינונית ESC אנושי) בהתאם לטבלה שלהלן.

   H-ESM	קונצרט כלשהו סופי	עבור 500 מ"ל
   החלפת סרום נוקאאוט (KSR)	20%	100 מ"ל
   Glutamax 100X	2 מ"מ	5 מ"ל
   חומצות אמינו לא חיוני ממ	0.1 מ"מ	5 מ"ל
   פניצילין, סטרפטומיצין	100 U / מ"ל ​​- 0.1 מ"ג / מ"ל	5 מ"ל
   2-mercaptoethanol	0.1 מ"מ	900 μl
   תוסף B27 - בלי Vitamina	1%	10 מ"ל
   מוסף N2	1%	5 מ"ל
   נוק DMEM	-	370 מ"ל

   
   ניתן לאחסן בינוני מניית ב 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מ 2 שבועות. כדי להכין מדיום גידול מלא, FGF הבסיסי הוסיף רק beforהאכלת דואר בריכוז סופי של 20 ng / ml.

הערה: שלם H-ESM מותנה בfibroblasts העכבר העוברי יכול לשמש במקום mTESR1 או Nutristem לתאי iPS.

4. הנח צלחות מצופים באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לשעת 2 ​​לפני passaging.
5. תאים צריכים להיות passaged בערך כל 5 ימים, גם אם הם לא הגיעו לנקודת מפגש. מושבות לא צריכים להיות נוגעות ללב.
6. החלפת מדיום גידול עם 1 מ"ל של dispase (1 מ"ג / מ"ל, לפזר ממניות מ"ג / מ"ל ​​10 PBS).
7. הסר הבחנה אזורים עם pipettes משך פסטרו זכוכית. אזורים כי יש להסיר כוללים מבנים דמויי מכתש או פיברוזיס במרכז מושבות, וכל התחום שבו תאים הפכו הופרדו ממושבות ושטוחות ונראה שנודדים החוצה.
8. לדגור על 37 מעלות צלזיוס מתחת למכסת מנוע התרבות עד גבולות מושבה הפכו בהירים יותר ולהתחיל לנתק (בדרך כלל סביב דקות 5-7). Discarד dispase. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM וזורקים.
9. ב1 מ"ל H-ESM, השתמש מרים תא (דמוי מרית מגרד) למושבות קציר ולאסוף בצינור 15 מיליליטר אפנדורף. לשטוף עם 1 מיליליטר H-ESM ולהוסיף לצינור. ספין ב 1000 RCF למשך 4 דקות ולהסיר את supernatant.
10. Resuspend גלולה ב1 מדיום גידול מחומם מראש מ"ל (או mTESR1 או Nutristem). הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה פחות מ 6-8x. לקבוע כמה תאים צריכים להיות מצופה ולהסיר תאים מיותרים (בדרך כלל 01:04 או 01:05 דילול), למשל עבור 2 צלחות ב1:5, להסיר 600 μl, ולאחר מכן להוסיף 1.6 מיליליטר מדיום טרי.
11. הסר Matrigel מצלחות. תאי מקום טיפה אחרים טיפה, הפצה באופן שווה על הצלחת. הימנע מטלטול הצינור באופן מוגזם, כמו זה יגרום לתאים לעבור לכיוון המרכז.
12. לשטוף עם צינור בינוני 1 מ"ל ופער בין צלחות. נפח סופי בכל צלחת צריך להיות 1.5 -2 מ"ל.
13. שנה בינונית כל יום, פרט ליום שאחרי passaging. למרות זאת הואאידיאלי לשינוי היומיומי בינונית, זה עשוי להשתנות מדי פעם בתדירות של אחת לימים, אם לא יותר מ 2-3 ימים עברו מאז המעבר האחרון מבלי להשפיע על פוטנציאל pluripotency או בידול.
14. אם יש להקפיא שורת התאים, מחדש להשעות במקום ב1-2 מדיום הקפאת mFreSR מ"ל באמצעות פיפטה 2 מ"ל ומקום 1 מ"ל / cryovial. בקבוקוני מקום בcryobox ב -80 מעלות צלזיוס והעברה לחנקן נוזלי בתוך 3-4 ימים.

הערה: microdissection הידני של תאי iPS חייב להתבצע תחת stereomicroscope. (IVF) תחנת עבודה בהפריה חוץ גופית (IVF מתחנת עבודת KSystem למשל) משולבת עם stereomicroscope מאפשרת מניפולציה של התאים בתנאים סטריליים בזמן שהם שמרו על שטח פנים מחוממים. אם זה לא זמין, ניתן להעביר stereomicroscope מתחת למכסת מנוע זרימה למינרית קבועה.

2. גופי Embryoid צבירה והלב Induction

1. להכין מדיום EBM-20 על פי הטבלה שלהלן.

   EBM-20	קונצרט כלשהו סופי	עבור 500 מ"ל
   סרום שור העובר (מוצא דרום אמריקה)	20%	100 מ"ל
   חומצות אמינו לא חיוני ממ	0.1 מ"מ	5 מ"ל
   פניצילין - סטרפטומיצין	100U/ml - 0.1 מ"ג / מ"ל	5 מ"ל
   Glutamax 100X	0.1 מ"מ	5 מ"ל
   2-mercaptoethanol	50uM	450 μl
   DMEM/F12	-	385 מ"ל

   
   השימוש בFBS ממוצא דרום אמריקה הוא קריטית לקביעת יעילות הבידול: תעסוקה של סוגים אחרים של סרה עלולה להשפיעתהליך ההתמיינות. כדי להכין EBM-20, חומצה אסקורבית תוספת מלאה (AA) לריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל. ניתן לאחסן את מדיום גידול שלם על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר מפעם אחת בשבוע.
2. מושבות iPS קציר כפי שתוארו לעיל (שלבים 1.6-1.9).
3. Resuspend עדינות ב1 מיליליטר EBM-20 עם טפטפת מיליליטר 2. הימנע מפירוק גושים יותר מדי - פיפטה מעלה ומטה לא יותר מ 2-3x, בודק את הגודל של המושבות תחת stereomicroscope. צלחת על צלחות התקשרות נמוכות במיוחד ביחס 1:1 (למשל לצלחת 35 מ"מ, השתמש 1 גם צלחת 6 היטב). יש לשטוף את הצינור עם 1 מיליליטר EBM-20 ולהוסיף לצלחת.

הערה: הגודל של המושבות להשפיע על תהליך ההתמיינות, שליטה יעילות ועיתוי של אינדוקציה לב. צבירה של EBS הומוגנית בגודל הוכח כדי להפחית את השונות שנצפו במהלך בידול.

4. ביום 3, לשנות EBM-20 פעם אחת באמצעות מיקרוסקופ כדי למנוע מחדשmoval של EBS. שמור פיפטה הקרובה לקצה של צלחת, ולהסיר את המדיום.
5. ב -7 ביום, מתג EBS לצלחות מצופות 0.1% ג'לטין והניח בעבר על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. במידת צורך, ניתן להסיר ג'לטין וצלחות יצאו מתחת למכסת מנוע תרבית תאי O / נ הוסף 35-40 EBS לכל צלחת 35 מ"מ.
6. בדקו EBS על הכאה ושינוי אזורי EBM-20 פעמיים בשבוע. לסמן את האזורים שבו מכים נמצאים בחלק העליון של כיסוי המנה, כדי להקל עליהם לוקליזציה תחת stereomicroscope. אזורים המתקשרים אמורים להופיע לאחר כ 10-20 ימים.
7. כאשר אזורים עם התכווצות ספונטנית מופיעים, לעבור למדיום EBM-2 (להכין כEBM-20, עם 2% FBS במקום) ולבודד אותם כמתואר להלן בסעיף 3.
8. תמשיך לבדוק תחומים אחרים למכות ולשנות בינוני פעמיים בשבוע עד שאזורי מכים נדרשים לניסויים נוספים.

הערה: יעילות של תהליך הבידול תלויה מאוד במספר גורמים, קריטיים ביותר שלו הם הקווים הספציפיים הסלולריים ויצווה של סרום המשמשים כדי לגרום לבידול לב. כדי להשיג היעילות הגבוהה ביותר, שורות תאי בדיקה עבור פוטנציאל cardiomyogenic וקבוצות שונות של סרום.

3. מכות בידוד והתרבות תחומי

1. צלחות מעיל 12 גם (4 ס"מ אזור ²⁾ או את הצלחות של עניין עם פיברונקטין 5 מיקרוגרם / ² ס"מ, בדילול מלא PBS לעשות מספיק נפח כדי לכסות את כל פני השטח לחלוטין (300 סך הכל μl לכל גם ב12 גם צלחות). שמור נחשף במכסת מנוע בתרבית תאים ולאפשר לו להתייבש. יכולות להיות עטופות צלחות ומאוחסנות על 4 מעלות CO / נ
2. הסר להכות אזור באמצעות זכוכית משך פיפטה פסטר ואזמל, במידת צורך. מעבירים לצלחות פיברונקטין מצופים עם טפטפת 1 מ"ל.
3. הוסף 1 מ"ל EBM-2.
4. לחצות את הצלחת כדי לציין את האזורים שבם הוסרו תאים ולשנות את המדיום. יכולות להיות כל הזמן צלחות לתקופה של עד חודש 1, כפי שאזורים אחרים עשויים להתחיל באכילה בשלב מאוחר יותר.

הערה: אם גושי מכות קטנים יותר יש צורך, פיפטה אזור explanted מעלה ומטה מספר פעמים תחת stereomicroscope, עד שהוא נשבר לחתיכות קטנות יותר. זה יגרום אשכולות של כמה תאי מכות (ראה סרט 3).

5. שנה בינונית פעמיים בשבוע עד מוכן לניתוחים.

הערה: cardiomyocytes מתקבל מפרוטוקול זה יש מאפיינים מורפולוגיים ופונקציונליים דמוי עוברי; התבגרות כלפי פנוטיפ כמו מבוגר ניתן לקבל על ידי הגדלת הזמן בתרבות להבדיל עוד יותר תאים אלה.

4. בידוד תאי מכות בודד וניתוח

1. שקופיות של 2 ס"מ (הקאמריות מעיל אזור 4 ²⁾ או תומך מתאים אחרים עם פיברונקטין ² מיקרוגרם / 5 ס"מ מדולל PBS מספיק כדי לכסות את פני השטח כולו התרבות. אם נעשה שימוש בתמיכת זכוכית, מעיל עם laminin ופיברונקטין (5 מיקרוגרם / ס"מ ^{2 כל אחד).}
2. הסר להכות אזור עם טפטפת / אזמל פסטר מהצלחות מהסעיף 3.
3. באמצעות 1 מ"ל פיפטה, תאים מעבירים צינור 15 מ"ל המכיל 500 collagenase השני μl (480 U / מ"ל ​​PBS עם Mg ו Ca) ודגירה 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מנער את צינור פעם אחת במהלך הדגירה.
4. פיפטה מעלה ומטה עם טפטפת μl 200. אם כל גושים יישארו, להעביר לטרי collagenase השני וחזור על שלב 4.3.
5. חזור על שלב 4.4 עד אין גושים גדולים נשארים.
6. להשבית collagenase עם 3 מ"ל EBM-2 (לא AA). לאחר מכן ניתן להשאיר את הצינור מתחת למכסת המנוע במעמד מחומם עד צינורות אחרים מוכנים. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
7. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל 0.25% טריפסין / EDTA (בדילול ממנייה 0.5% ב1X PBS) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. שלב את השברים של digestions מאותה הדגימה ראשונית.
8. להשבית טריפסין עם 4 מ"ל EBM-2 (לא AA). תאים עוברים דרך מחט 18G במזרק 2.5 מ"ל אין לא יותרהאן 7x. צנטריפוגה ב RCF 1000 במשך 4 דקות.
9. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל EBM-2 לכל טוב וצלחת. תאים יכולים לשמש לניתוח פונקציונלי ומורפולוגי 2-3 ימים לאחר ציפוי.

תוצאות

במחקרים שלנו אנחנו נוצרו CMS מכמה שורות תאי iPS. קווים אלו נוצרו בתחילה על שכבת מזין MEF אבל הונחו מייד על Matrigel באמצעות מדיום מוגדר (או mTESR1 או Nutristem). מבחני שונים שמשמשים לאימות תחזוקה של נכסים מורפולוגיים, הביטוי של סמנים אופייניים לתאי pluripotent (OCT-4, וSSEA4 TRA1-60) ויציבות הגנום ש?...

Discussion

יש תאי גזע pluripotent פוטנציאל להבחין באופן ספונטני לCMS, אם כי ביעילות נמוכה ושונות גבוהה בין שורות. פיתוח שיטות אינדוקציה רומן ולכן התמקד בשיפור היעילות של התהליך ונע לעבר פרוטוקולים יותר מוגדרים. עם זאת, רוב שיטות הבידול החדשות אלה הם מורכבים למדי, הדורשים תנאים מורכבים...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt–thanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon