Génération de cardiomyocytes humains: Un protocole de différenciation des induits des cellules souches pluripotentes humaines chargeur sans

Résumé

Les cellules souches pluripotentes, cellules embryonnaires ou soit souches pluripotentes induites (iPS), constituent une précieuse source de cellules différenciées humaines, y compris les cardiomyocytes. Ici, nous allons nous concentrer sur l'induction de cellules iPS cardiaque, en montrant comment les utiliser pour obtenir des cardiomyocytes humains fonctionnels à travers un protocole corps à base embryoïde.

Résumé

Afin d'enquêter sur les événements de conduite développement du cœur et de déterminer les mécanismes moléculaires conduisant à des maladies du myocarde chez l'homme, il est essentiel d'abord de générer des cardiomyocytes humains fonctionnels (CMS). L'utilisation de ces cellules dans la découverte de médicaments et les études de toxicologie serait également très bénéfique, en permettant de nouvelles molécules pharmacologiques pour le traitement des troubles cardiaques être validées au stade clinique sur les cellules d'origine humaine. Parmi les sources possibles de la CMS, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont parmi les plus prometteurs, car ils peuvent être directement dérivées de tissus du patient facilement accessibles et possèdent une capacité intrinsèque pour donner naissance à tous les types cellulaires de l'organisme ^1. Plusieurs méthodes ont été proposées pour la différenciation des cellules iPS en GC, allant des classiques des corps embryoïdes (EBS) approche agrégation des protocoles définis chimiquement ^2,3. Dans cet article, nous proposons un protocole EBS-base et montrons comment cette méthoD peut être utilisé pour générer efficacement des cellules CM-comme fonctionnels à partir de cellules iPS sans chargeur.

Introduction

Historiquement, l'étude des mécanismes génétiques et moléculaires de conduire le développement humain et la maladie a été basée sur la production de modèles de recherche génétiquement modifiés. Cependant, de nombreux phénotypes humains ne parviennent pas à être reproduit avec succès chez la souris, principalement en raison des différences biologiques existant entre les deux espèces. D'autre part, l'accès aux tissus humains peuvent être limitées et souvent ne permettent pas suffisamment de matière pour être obtenue pour des études expérimentales en profondeur. Le domaine de la biologie cardiovasculaire souffre de ces deux limites: la physiologie du cœur de l'homme est nettement différente de celle de la souris, et une quantité importante de tissu cardiaque est uniquement accessible post-mortem ou pendant la chirurgie cardiaque. Trouver une source optimale pour la différenciation fonctionnelle de CMS Human est donc devenue un sujet central en biologie cardiovasculaire, et beaucoup d'efforts ont été faits pour résoudre ce problème. Différents types de cellules ont été proposées, including myoblastes squelettiques, cellules cardiaques locaux souches de moelle osseuse, des cellules mononucléaires, des progéniteurs endothéliales et les cellules souches mésenchymateuses. Toutefois, les données obtenues en utilisant ces cellules n'ont pas été conforme ^4.

La dérivation de cellules souches embryonnaires humaines (ESC) ⁵ et la découverte révolutionnaire de cellules induites souches pluripotentes (iPS) par Yamanaka et Thomson ^6,7 semblé première tard pour apporter des solutions: ces cellules ont la capacité de croître indéfiniment et le potentiel de donner augmenter à tous les dérivés de cellules des trois feuillets embryonnaires, dont les GC. L'utilisation de cellules iPS offre d'autres avantages: être dérivées de cellules autologues adultes, ils portent le même génome que l'individu ou le patient dont ils sont issus. Ils permettent donc le développement de modèles in vitro qui facilitent la recherche sur les maladies et les mécanismes de développement génétiques humaines. En vertu de cette caractéristique, les cellules iPS peuvent également overcome problèmes liés au rejet immunitaire et les questions éthiques ^8. Pour ces raisons, même si les CES représentent toujours l'étalon-or dans le domaine de la biologie des cellules souches, les chercheurs du monde entier sont en train de passer plus vers la technologie des cellules iPS.

Les cellules iPS sont maintenant utilisés pour modéliser les maladies humaines in vitro pour diverses conditions, y compris les troubles cardio-vasculaires congénitales ^9,10. Récemment, l'application de la modélisation des maladies des cellules iPS a été effectuée pour des troubles cardiaques monogéniques (par exemple syndrome du QT long, catecholaminergic tachycardie ventriculaire polymorphe) et les pathologies dans lesquelles les malformations cardiaques font partie d'un phénotype complexe (ie Leopard et Timothy syndromes, cardiomyopathie dilatée). Ces rapports ont confirmé que les cellules iPS spécifiques au patient qui se différencient en GC présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles similaires à celles de la maladie in vivo.

Cependant, ilya encore de nombreux défis pour améliorer l'efficacité de l'induction des cellules iPS dans la lignée cardiaque. La génération spontanée de la CMS à partir de CSE humaines par la formation d'agrégats appelé corps embryoïdes (EBS) ont fait leurs preuves ^17. Depuis cette découverte, de nombreuses autres méthodes ont été proposées. De nombreux groupes ont grandement amélioré l'efficacité du protocole de différenciation et se sont déplacés vers les réactifs de culture chimiquement définis et animale produits frais (voir Mummery, C., et al., De la recherche de Circulation (2012) pour un examen complet de toutes les méthodes ³ existants ).

Néanmoins, la méthode classique basée sur EB agrégation représente toujours le plus couramment utilisé pour réaliser des études fonctionnelles et d'enquêter sur les mécanismes de la maladie. Notre protocole proposé est fondé sur l'agrégation des cellules iPS dans EBS et de la culture en présence d'acide ascorbique et de sérum, qui a été montré pour améliorer le processus de différenciation cardiaque et de poincidence sitively la maturation de ces cellules ^18,19. Dans cet article, nous allons passer par cette méthode en détail et nous allons montrer comment utiliser des lignées de cellules iPS chargeur sans pour générer spécifique au patient CM iPS dérivées.

Protocole

1. Entretien chargeur et sans repiquage des iPS humaines lignées cellulaires

1. Préparer les plats Matrigel revêtus. Décongeler une fiole de Matrix ESC qualifié humaine sur la glace pendant une heure et diluer dans 25 ml de milieu DMEM-F12. Ajouter 1 ml de chaque plaque de 35 mm (ou des quantités équivalentes par unité de surface si d'autres plats sont utilisés), tout garder sur la glace et faire en sorte que toutes les plaques et tubes sont pré-refroidi. Couvrir les plaques avec du papier d'aluminium.

Note: actions concentrations de Matrigel varient selon le lot. instructions de dilution sont indiqués sur la feuille de données.

2. Conserver les plaques sur de la glace pendant la nuit et de retirer de la glace le lendemain. Les plaques peuvent être conservés au réfrigérateur jusqu'à une semaine avant de l'utiliser.
3. Préparer le milieu complet mTESR1 (ou décongeler un flacon de milieu Nutristem) et le H-ESM (Moyen CSE humaines), selon le tableau ci-dessous.

   H-ESM	Concentration finale	Pour 500 ml
   Knockout remplacement Serum (KSR)	20%	100 ml
   GlutaMAX 100X	2 mM	5 ml
   MEM acides aminés non essentiels	0,1 mM	5 ml
   Pénicilline-streptomycine	100 U / ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   2-mercaptoéthanol	0,1 mM	900 pi
   B27 supplément - sans VitaminA	1%	10 ml
   Supplément N2	1%	5 ml
   Knockout DMEM	-	370 ml

   
   moyen d'actions peut être conservé à 4 ° C pendant plus de 2 semaines. Pour préparer un milieu de croissance complet, le FGF basique est ajouté juste before alimentation à une concentration finale de 20 ng / ml.

Note: Complete H-ESM conditionnés sur des fibroblastes embryonnaires de souris peut être utilisée à la place de mTESR1 ou Nutristem pour les cellules iPS.

4. Placez plaques enduites dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min à 2 h avant repiquage.
5. Les cellules doivent être repiquées environ tous les 5 jours, même si elles n'ont pas atteint la confluence. Colonies ne doivent pas se toucher.
6. Remplacez le milieu de croissance avec 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissoudre à partir d'un mg / ml de bouillon dans 10 PBS).
7. Retirer différencier les zones où tiré Pipettes Pasteur en verre. Domaines qui devraient être supprimés incluent des structures en forme de cratères ou kystique dans le centre de colonies, et les zones où les cellules ont été séparés de colonies et aplaties et semblent être la migration vers l'extérieur.
8. Incuber à 37 ° C sous une hotte de culture jusqu'à ce que les frontières de la colonie deviennent plus lumineux et commencent à se détacher (généralement autour de 5-7 min). Discard dispase. Laver avec 1 ml H-ESM et le jeter.
9. Dans 1 ml de H-ESM, utilisez un levier de cellule (en forme de spatule grattoir) aux colonies de récolte et de rassembler dans un tube Eppendorf 15 ml. Rincer avec 1 ml H-ESM et d'ajouter au tube. Tourner à 1.000 rcf pendant 4 min et éliminer le surnageant.
10. Remettre le culot dans 1 milieu de croissance préchauffé ml (soit mTESR1 ou Nutristem). Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en baisse de moins de 6-8x. Déterminez le nombre de cellules doit être plaqué et éliminer les cellules inutiles (généralement 01h04 ou 01h05 dilution), par exemple pour 2 plaques à 1:5, supprimer 600 ul, puis ajouter 1,6 ml de milieu frais.
11. Retirer Matrigel à partir de plaques. cellules de lieu goutte à goutte, répartissant uniformément sur la plaque. Evitez de secouer le tube trop, car cela va amener les cellules à se déplacer vers le centre.
12. Lavez tube avec 1 ml de milieu et fracture entre les plaques. Le volume final dans chaque assiette devrait être de 1,5 -2 ml.
13. Changer le milieu tous les jours, sauf le jour après repiquage. Bien qu'il soitidéal pour changer le support de tous les jours, cela peut être parfois modifié à une fréquence d'une fois tous les deux jours si pas plus de 2-3 jours se sont écoulés depuis le dernier passage sans affecter le potentiel pluripotence ou de différenciation.
14. Si la ligne de la cellule doit être congelée, remettre en suspension au lieu de 1-2 ml de milieu de congélation mFreSR utilisant une pipette de 2 ml et placer 1 ml / cryovial. Placer les flacons dans un Cryobox à -80 ° C et le transfert de l'azote liquide dans les 3-4 jours.

Note: Manuel microdissection de cellules iPS doit être effectuée sous une loupe binoculaire. Une fécondation in vitro (FIV), poste de travail (par exemple, une station de travail à partir de la FIV KSystem) intégré avec un microscope stéréoscopique permet la manipulation des cellules dans des conditions stériles pendant qu'ils sont maintenus sur une surface chauffée. Si ce n'est pas disponible, une loupe binoculaire peut être déplacé sous une hotte à flux laminaire régulier.

2. Embryoïde organismes Agrégation et cardiaque induction

1. Préparez-20 EBM moyen selon le tableau ci-dessous.

   EBM-20	Concentration finale	Pour 500 ml
   Sérum de veau fœtal (origine Amérique du Sud)	20%	100 ml
   MEM acides aminés non essentiels	0,1 mM	5 ml
   Pénicilline - streptomycine	100U/ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   GlutaMAX 100X	0,1 mM	5 ml
   2-mercaptoéthanol	50 pM	450 ul
   DMEM/F12	-	385 ml

   
   Utilisation de FBS d'origine Amérique du Sud est essentiel pour déterminer l'efficacité de différenciation: l'emploi d'autres types de sérums peuvent affecterle processus de différenciation. Pour préparer EBM-20, l'acide ascorbique module complet (AA) à une concentration finale de 50 ng / ml. Un milieu de croissance complet peut être conservé à 4 ° C pendant pas plus d'une semaine.
2. iPS colonies de récolte telles que décrites ci-dessus (étapes 1.6 à 1.9).
3. Reprendre doucement dans 1 ml EBM-20 avec une pipette de 2 ml. Éviter de casser les mottes trop - pipette de haut en bas pas plus de 2 à 3 fois, vérifier la taille des colonies sous la loupe binoculaire. Plaque sur des plaques ultra-faible attachement au rapport 1:1 (par exemple pour un plat de 35 mm, utiliser 1 puits d'une plaque à 6 puits). Rincer le tube avec 1 ml EBM-20 et ajouter à la plaque.

Note: La taille des colonies affectent le processus de différenciation, de contrôler l'efficacité et le moment de l'induction cardiaque. Agrégation de façon homogène taille EB ont été montré pour réduire la variabilité observée au cours de la différenciation.

4. Au jour 3, changer EBM-20 une fois en utilisant un microscope à éviter à nouveauDépose d'EBS. Gardez la pipette contre bord de la plaque, et éliminer le milieu.
5. Au jour 7, le commutateur à EB plaques revêtues de 0,1% de gélatine et placé précédemment à 37 ° C pendant 30 min. Si nécessaire, la gélatine peut être retirée et des plaques laissé sous hotte de culture cellulaire S / N. Ajouter 35-40 EB par boîte de 35 mm.
6. Vérifiez EB pour battre les zones et les changements EBM-20 deux fois par semaine. Marquez où zones battantes sont situés sur le dessus du couvercle du plat, afin de faciliter leur localisation sous la loupe binoculaire. Zones contractantes devraient apparaître après environ 10-20 jours.
7. Lorsque les zones où la contraction spontanée apparaissent, passez à moyen et EBM-2 (préparer comme EBM-20, avec 2% de FBS place) et les isoler comme décrit ci-dessous dans la section 3.
8. Continuez à vérifier d'autres domaines pour battre et changer moyenne deux fois par semaine jusqu'à zones battantes sont nécessaires pour d'autres expériences.

Note: l'efficacité du processus de différenciation est très dépendanteplusieurs facteurs, le plus important dont les lignées cellulaires spécifiques et le lot de sérum utilisé pour induire la différenciation cardiaque. Pour obtenir le rendement le plus élevé, des lignées de cellules de test pour le potentiel cardiomyogénique et divers lots de sérum.

3. Battre les zones d'isolement et de la culture

1. Plaques à 12 puits manteau (4 cm zone ²⁾ ou les plaques d'intérêt avec 5 ug / cm ² fibronectine, dilués dans du PBS pour faire un volume suffisant pour couvrir toute la surface complètement (300 totale par puits dans des plaques à 12 puits). Gardez découvert dans la hotte de culture cellulaire et laisser sécher. Les plaques peuvent être conditionnés et conservés à 4 ° CO / N.
2. Retirez zone à l'aide d'un verre battre tiré pipette Pasteur et scalpel, selon les besoins. Transfert à plaques revêtues de fibronectine avec une pipette de 1 ml.
3. Ajouter 1 ml EBM-2.
4. Rayez la plaque pour indiquer les zones où les cellules ont été enlevés et changer le milieu. Les plaques peuvent être conservés jusqu'à 1 mois, comme d'autres secteurs peuvent commencer bmanger plus tard.

Remarque: Si les petites touffes battant sont nécessaires, une pipette la zone explanté monter et descendre plusieurs fois sous la loupe binoculaire, jusqu'à ce qu'il casse en petits morceaux. Cela se traduira par des groupes de quelques cellules de battage (voir film 3).

5. Changer le milieu deux fois par semaine avant d'être prêt pour les analyses.

Note: cardiomyocytes obtenus à partir de ce protocole possèdent des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles du fœtus ressemblant; maturation vers un phénotype adulte comme peut être obtenu en augmentant le temps de la culture afin de mieux différencier ces cellules.

4. Simple Battre cellules d'isolement et de l'analyse

1. Manteau de diapositives 2 chambre (4 cm zone ²⁾ ou autres supports appropriés avec 5 ug / cm ² fibronectine dilué dans PBS suffisante pour couvrir la surface de culture entier. Si un support de verre est utilisé, manteau avec la laminine et la fibronectine (5 ug / cm ^{2 chacun).}
2. Retirez zone battre avec une pipette Pasteur / scalpel à partir des plaques de la section 3.
3. En utilisant une pipette de 1 ml, transférer les cellules sur un tube de 15 ml contenant 500 ul collagénase II (480 U / ml dans PBS avec Mg et Ca) et incuber 15 min à 37 ° C, en agitant le tube une fois au cours de l'incubation.
4. Introduire à la pipette de haut en bas avec une pipette 200 pl. Si les grumeaux restent, transfert à frais collagénase II et répétez l'étape 4.3.
5. Répétez l'étape 4.4 jusqu'à ce qu'aucun de grosses touffes sont laissés.
6. Inactiver collagénase avec 3 ml EBM-2 (sans AA). Le tube peut alors être laissée sous le capot dans un rack chauffée jusqu'à ce que d'autres tubes sont prêts. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min.
7. Remettre le culot dans 1 ml de trypsine à 0,25% / EDTA (dilué à partir d'un stock de 0,5% dans du PBS 1X) et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Combiner les fractions de digestions du même échantillon initial.
8. Inactiver la trypsine avec 4 ml EBM-2 (sans AA). Passez cellules à travers une aiguille 18G sur une seringue de 2,5 pas plus than 7x. Centrifugeuse à 1000 rcf pendant 4 min.
9. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml EBM-2 par puits et la plaque. Les cellules peuvent être utilisées pour des analyses morphologiques et fonctionnelles 2-3 jours après placage.

Résultats

Dans nos études, nous avons généré CM de plusieurs lignées de cellules iPS. Ces lignes ont d'abord été générées sur une couche nourricière MEF mais ont été immédiatement placés sur Matrigel utilisant un milieu défini (soit mTESR1 ou Nutristem). Différents tests ont permis de vérifier l'entretien des propriétés morphologiques, l'expression de marqueurs typiques des cellules pluripotentes (Oct-4, SSEA4 et TRA1-60) et leur stabilité du génome (Figure 1).

Discussion

Les cellules souches pluripotentes ont le potentiel de se différencier spontanément en GC, mais avec une faible efficacité et une forte variabilité entre les lignes. Le développement de nouvelles méthodes d'induction a donc mis l'accent sur l'amélioration de l'efficacité du processus et se déplaçant vers des protocoles plus définis. Cependant, la plupart de ces nouvelles méthodes de différenciation sont assez complexes, nécessitant des conditions complexes de la culture, le contrôle préci...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon