ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

要約

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。

要約

心臓の開発を推進したイベントを調査するために、ヒトにおける心筋疾患につながる分子メカニズムを決定するためには、機能的なヒト心筋細胞（CMS）を生成する第不可欠である。薬剤の発見および毒性試験におけるこれらの細胞の使用は、ヒト由来の細胞に対する予備臨床的に検証する心臓障害の治療のための新しい薬理学的分子を可能にする、非常に有益であろう。 CMの発生源のうち、誘導多能性幹（iPS細胞）細胞は、それらが容易にアクセス可能な、患者の組織から直接導出することができるように、最も有望間であり、ボディ¹の全ての細胞型を生じさせるための固有の能力を有する。いくつかの方法は、古典的な胚様体（EB）集約アプローチから化学的に定義されたプロトコル^2,3に至るまでのCMにiPS細胞を区別するために提案されている。この記事では、EBをベースのプロトコルを提案し、表示する方法このメトキシdは効率的にフィーダーフリーiPS細胞からの機能CM-様細胞を生成するために使用することができる。

概要

歴史的には、人間開発や病気を駆動する遺伝的および分子メカニズムの研究は、遺伝子組み換え動物モデルの生成に基づいている。しかし、多数の人間の表現型が正常に主な理由は2種の間に存在する生物学的な違いにより、マウスで複製することに失敗する。一方、ヒト組織へのアクセスが制限される場合があり、しばしば綿密な実験的研究のために得られる十分な材料を許可しない。心臓血管生物学の分野では、これらの両方の制限に苦しんでいる：人間の心の生理機能は、マウスのそれとは大きく異なっており、心臓組織のかなりの量は、事後のみアクセスや心臓手術中です。機能的なヒトCMの差別化のための最適なソースを見つけることは、したがって心臓血管生物学における中心トピックとなっており、多くの努力が、この問題に対処するためになされた。種々の細胞型は、iが提案されているncluding骨格筋芽細胞、局所心臓幹細胞、骨髄単核細胞、内皮前駆細胞、間葉系幹細胞。ただし、データは⁴一貫していない、これらの細胞を用いて得られた。

山中とトムソン^6,7によるヒト胚性幹細胞の誘導（ESC）最初の⁵と人工多能性幹（iPS細胞）の細胞の画期的な発見は、後でソリューションを提供するために見えた：これらの細胞は無限に増殖する能力と与えるために可能性を秘めているCMを含めた3つの胚葉全てのセル誘導体に上昇する。 iPS細胞の使用は、さらなる利点があります自家成体細胞から誘導されるが、それらは、それらが由来する個体または患者と同じゲノムを運ぶ。従って、それらは、ヒトの遺伝疾患および開発メカニズムの検討を容易にするin vitroモデルの開発を可能にする。この特徴のおかげで、iPS細胞はまた、Oすることができ免疫拒絶や倫理的な問題⁸に関連vercome問題。 ESCは、まだ幹細胞生物学の分野で金本位を表す場合でも、これらの理由により、研究者は世界中の現在のiPS細胞技術に対してより動いている。

iPS細胞は現在、先天性心血管疾患^9,10など、さまざまな条件を、in vitroでヒトの疾患モデルに採用されています。最近では、iPS細胞の病気のモデリングの適用は単一遺伝子の心臓疾患のために行われている（ つまり、QT延長症候群、カテコールアミン多形性心室頻拍）と心臓の欠陥が複雑な表現型（ すなわち Leopardとティモシー症候群、拡張型心筋症）の一部であるの病態。これらのレポートは、CMSに分化されている患者固有のiPS細胞は、 生体内での疾患と同様の表現型および機能特性を表示することを確認した。

しかし、心臓系譜へのiPS細胞の誘導の効果を改善するために多くの課題が残っている。胚様体と呼ばれる凝集体形成を介したヒトESCからCMの自発的な世代は（EBS）成功¹⁷実証されています。この発見以来、他の多くの方法が提案されている。多くのグループが大幅に分化プロトコルの効率性を高めており、化学的に定義されており、動物製品を含まない培地試薬（ママリーを参照して、C. らに向かって移動している。、すべての既存のメソッド³の包括的な見直しのために循環研究 （2012） ）。

それにもかかわらず、EB集約に基づいて古典的な方法は、まだほとんどの一般的な機能の研究を行い、病気のメカニズムを調査するために使用さを表しています。提案プロトコルは、心臓分化プロセスを増強することが示されている血清およびアスコルビン酸の存在下でのEBにiPS細胞の集約と文化とPOに基づいていますsitivelyこれらの細胞^18,19の成熟に影響を与える。この記事では、具体的にこの方法論を通過しますと、患者固有のiPS由来のCMを生成するためのフィーダーフリーのiPS細胞株を使用する方法を示します。

プロトコル

1。ヒトiPS細胞株のフィーダーフリーメンテナンスと継

1. マトリゲル被覆された料理を準備します。雪解け一つ一つ時間氷上で人間ESC修飾マトリックスのバイアルと25ミリリットルDMEM-F12培地中で、それを希釈する。氷の上のすべてを維持し、すべてのプレートとチューブが予め冷却されていることを確認しながら、各35ミリプレート（または他の皿が使用される場合、表面積あたりの当量）、1 mlを加える。アルミホイルでプレートをカバーしています。

注：マトリゲル在庫濃度はバッチによって異なります。希釈命令はデータシートに示されている。

2. 晩氷の上のプレートを保持し、次の日に氷から削除します。プレートを使用する前に、1週間冷蔵庫にまで保つことができる。
3. mTESR1完全培地（またはNutristem媒体のバイアルを解凍）し、以下の表に従ってH-ESM（人間ESC媒体）を準備します。

   H-ESM	FINAL CONC	500ミリリットルFOR
   ノックアウト血清交換（KSR）	20％	100ミリリットル
   グルタ100X	2 mMの	5ミリリットル
   MEM非必須アミノ酸	0.1mMの	5ミリリットル
   ペニシリン - ストレプトマイシン	100 U / mlの - 0.1 mg / mlの	5ミリリットル
   2 - メルカプトエタノール	0.1mMの	900μlの
   B27サプリメント - VitaminAなし	1％	10ミリリットル
   N2サプリメント	1％	5ミリリットル
   ノックアウトDMEM	-	370ミリリットル

   
   ストック媒体は、それ以上の2週間以上、4℃で保存することができる。完全増殖培地を調製し、塩基性FGFだけ血友病追加されます20 ngの/ mlの最終濃度までe給餌。

注：H-ESM完全にマウス胚線維芽細胞を条件としては、iPS細胞のためmTESR1またはNutristemの代わりに使用することができる。

4. 継代の前に30分〜2時間37℃でインキュベーター内でコーティングしたプレートを置きます。
5. 細胞は、それらがコンフルエンスに達していない場合でも、約5日ごとに継代されるべきである。コロニーは触れてはいけません。
6. ディスパーゼを1m​​l（1 mg / mlの、PBS中10 mg / mlの在庫からディゾルブ）と成長培地を交換してください。
7. 引っ張らガラスパスツールピペットで差別化の領域を削除します。除去すべき分野は、クレーター状または嚢胞構造コロニーの中心にあり、細胞がコロニーから分離し、扁平になり、外側に移行しているように思われている任意の領域が含まれます。
8. 植民地の境界線が明るくなって、（通常は5-7分程度）デタッチ始めるまで培養フードの下に37℃でインキュベートする。 DiscarDディスパーゼ。 1ミリリットルH-ESMで洗浄し、廃棄します。
9. 1ミリリットルH-ESMでは、収穫のコロニーへのセルリフター（スクレーパーへらのような）を使用し、15ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに集める。 1ミリリットルH-ESMで洗い流し、チューブに加える。 4分間1,000 rcfでスピンし、上清を除去します。
10. 1ミリリットル予め温めておいた増殖培地（どちらmTESR1またはNutristem）でペレットを再懸濁します。あまりにも塊を解体避ける - 上下6-8X未満ピペット。どのように多くの細胞にメッキさ〜1:5で2プレート用など不必要な細胞（通常は午前1時04分または1：05希釈）、削除する必要があります決定し、600μlのを削除し、その後、1.6ミリリットル新鮮培地を追加します。
11. プレートからマトリゲルを削除します。場所細胞は、プレート上に均一に分散、ドロップでドロップします。これは細胞が中心に向かって移動するようになりますように、過度にチューブを振って避ける。
12. 、1mlの培地とプレート間の格差とチューブを洗ってください。各プレートの最終容量は1.5 -2ミリリットルでなければなりません。
13. 継代後の日を除く毎日の媒体を変更します。それはあるが、もう2〜3日以上は、多能性または分化の潜在的影響を与えることなく、最後の通路を経過した場合は培地日常を変更することが理想的な、これは時折回二日の頻度で変更されることがあります。
14. 細胞株を凍結する必要がある場合は、2 mlのピ​​ペットと場所1ミリリットル/クライオバイアルを使用して1〜2ミリリットルmFreSR凍結培地に代わりに再懸濁する。 -80 cryoboxに置きバイアル℃、3〜4日での液体窒素への転送。

注：iPS細胞の顕微解剖マニュアルは実体顕微鏡下で行わなければなりません。彼らは加熱された表面領域に保持されながら、実体顕微鏡と統合で体外受精 （IVF）ワークステーション（KSystemからIVFワークステーションなど ）を無菌条件下で細胞の操作を可能にします。これが利用できない場合、実体顕微鏡は、通常、層流フードの下で移動させることができる。

2。胚様体集約および心臓InductioN

1. 以下の表に従ってEBM-20培地を準備します。

   EBM-20	FINAL CONC	500ミリリットルFOR
   ウシ胎児血清（原産地南米）	20％	100ミリリットル
   MEM非必須アミノ酸	0.1mMの	5ミリリットル
   ペニシリン - ストレプトマイシン	100U/ml - 0.1 mg / mlの	5ミリリットル
   グルタ100X	0.1mMの	5ミリリットル
   2 - メルカプトエタノール	50umの	450μlの
   DMEM/F12	-	385ミリリットル

   
   南アメリカ原産のFBSの使用は分化効率を決定するために重要である：血清の他のタイプの雇用が影響を与える可能性があります分化プロセス。 50μgの/ mlの最終濃度まで、EBM-20完全な追加アスコルビン酸（AA）を調製した。完全増殖培地をして一週間以内に使用し4℃で保存することができます。
2. ハーベストのiPS上記のように植民地を（ステップ1.6から1.9）。
3. 2 mlのピ​​ペットで1ミリリットルEBM-20で軽く懸濁します。あまりにも塊を解体避けるん - ピペット上下に2〜3倍以上のものを、実体顕微鏡下でコロニーのサイズをチェック。 1:1の比率で超低取付板（35mmディッシュ用など 、6ウェルプレートのウェル1を使用）上にプレート。 1ミリリットルEBM-20とチューブを洗浄し、プレートに加える。

注：コロニーのサイズ分化過程に影響を与え、心臓の誘導の効率及びタイミングを制御する。均一の大きさの凝集がEBの分化の間に観察されたばらつきを低減することが示されている。

4. 3日目に、EBM-20は一度再避けるために、顕微鏡を使用して変更のEBS moval。プレートの端に近いピペット、そして培地を除去してください。
5. 7日目、0.1％でコーティングされたプレートにスイッチのEBにゼラチン、以前37に配置℃で30分間。必要に応じて、ゼラチンは、細胞培養フード下で除去し、プレートを残すことができるO / N 35mmディッシュあたり35-40 EBSを追加します。
6. 週2回の地域と変化EBM-20を打つためにEBSをチェックします。実体顕微鏡下でそれらの局在を促進するために、暴行の領域は皿カバーの上に置かれている場所をマーク。締約エリアは約10〜20日後に表示されるはずです。
7. 自発的な収縮に領域は、表示され（代わりに2％FBSで、EBM-20として用意）EBM-2培地を切り替えて、それらを、セクション3に説明分離。とき
8. 鼓動と鼓動領域は​​さらなる実験のために必要とされるまで、週二回の媒体を変更するための他のエリアをチェックし続けています。

注：分化プロセスの効率に大きく依存しているいくつかの要因が、その中で最も重要な特定の細胞系および心臓の分化を誘導するために使用する血清のバッチである。血清心筋電位およびさまざまなバッチの最高効率は、試験細胞株を得ることができる。

3。エリアの分離と文化を破っ

1. コート12ウェルプレート（4 cm ^2の面積）または5μgの/ cm ^2のフィブロネクチンを有する近隣のプレート（12ウェルプレートで、ウェル当たり300μlの合計）が完全に表面全体を覆うに十分な量を作るためにPBSで希釈した。細胞培養フード内で発見保ち、乾燥させます。プレートを4℃で包んで保存することができます°CO / N.
2. 必要に応じて、パスツールピペットやメスを引っ張られたガラスを使用して面積を破って外します。 、1mlのピペットでフィブロネクチン被覆プレートに移す。
3. 1ミリリットルEBM-2を追加します。
4. 細胞が除去された領域を示し、メディアを変更するためにプレートをオフに渡ります。他の地域は、Bを起動することがありますようにプレートを、1ヶ月用に保持することができる後で食べる。

注 ：小さい鼓動塊が必要な場合は、実体顕微鏡下で上下に数回植面積ピペット、それは小さい部分に壊れるまで。これは、（映画の3を参照）、いくつかの拍動細胞のクラスターになります。

5. 分析のための準備ができるまで週二回培地を変更します。

注：このプロトコルから得られた心筋細胞は、胎児のような形態学的および機能的特性を有し、成人の様表現型に向かって成熟さらに、これらの細胞を区別するために、培養時間を増加させることによって得ることができる。

4。シングル打つセルの単離と解析

1. コート2チャンバースライド（4 cm ^2の面積）または全体の培養表面を被覆するのに十分なPBSで希釈した5μgの/ cm ^2のフィブロネクチンを有する他の適切な担体。ガラス支持体が使用される場合、ラミニンおよびフィブロネクチンでコート（5μgの個/ cm <>各2）（商標）。
2. セクション3からのプレートからパスツールピペット/メスでエリアを破って外します。
3. 500μlのコラゲナーゼII（MgおよびCaを含むPBSで480 U / ml）を含む15ミリリットルチューブに1ミリリットルピペット、転送細胞を用い、37℃で15分°C、インキュベーション中に一度チューブを振ってインキュベートする。
4. 200μlのピペットで上下にピペッティング。任意の塊が残っている場合は、新鮮なコラゲナーゼIIに転送し、ステップ4.3を繰り返します。
5. に大きな塊が残っていないまで、ステップ4.4を繰り返します。
6. 3ミリリットルEBM-2（無AA）とコラゲナーゼを不活化する。他のチューブは準備が整うまで、チューブを加熱ラックにボンネットの下におくことができます。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。
7. ペレットを再懸濁し、1 mlの0.25％を5分間37℃でトリプシン/ EDTA（1X PBS中0.5％のストックから希釈）とインキュベートする。同じ初期サンプルから消化の端数を兼ね備えています。
8. 4ミリリットルEBM-2（無AA）とトリプシンを不活性化。もっとトンなし2.5ミリリットル注射器に18G針を通して細胞を渡す藩7倍。 4分間1,000 rcfで遠心分離します。
9. よく、プレート当たり1ミリリットルEBM-2で再懸細胞ペレット。細胞を2〜3日めっき後の機能的および形態学的分析のために使用することができる。

結果

我々の研究では、いくつかのiPS細胞株からのCMを生成した。これらのラインは、最初にMEFフィーダー層上で生成されたが、すぐに定義された媒体（またはいずれかmTESR1 Nutristem）を用いて、マトリゲル上に置いた。種々のアッセイは、形態学的特性、多能性細胞の典型的なマーカーの発現（OCT-4、SSEA4およびTRA1-60）、およびそれらのゲノム安定性（ 図1）の維持を確認するために使?...

ディスカッション

多能性幹細胞は、低効率とラインの間で高い変動性を持つとはいえ、CMSに自発的に分化する可能性を秘めている。新規の誘導方法の開発は、したがって、プロセスの効率を向上させ、より定義されたプロトコルに向かって焦点を当てている。しかし、これらの新しい分化方法の最も精巧な培養条件、タイミングおよび試薬の濃度を微調整し、高価なサイトカインと成長因子を用いた治療を必?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt–thanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon