Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

Resumo

Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Resumo

A fim de investigar os eventos de promoção do desenvolvimento do coração e para determinar os mecanismos moleculares que conduzem a doenças do miocárdio em seres humanos, é necessário, antes de gerar cardiomiócitos humanos funcionais (CMS). A utilização destas células na descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia é também altamente benéfico, permitindo novas moléculas farmacológicas para o tratamento de desordens cardíacas a ser pré-clinicamente validado em células de origem humana. Dos possíveis fontes de CMS, células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) estão entre os mais promissores, como elas podem ser derivadas directamente a partir de tecido do paciente facilmente acessíveis e possuir uma capacidade intrínseca para dar origem a todos os tipos de células do corpo ^1. Foram propostos vários métodos para diferenciar as células iPS em CMs, desde os corpos embrióides clássicos (EBS) abordagem de agregação de protocolos de constituição química definida ^2,3. Neste artigo, propomos um protocolo baseado em EBs e mostrar como este metodod podem ser empregues para gerar eficientemente células CM-funcionais, como a partir de células iPS alimentador livres.

Introdução

Historicamente, a investigação dos mecanismos genéticos e moleculares de promoção do desenvolvimento humano e da doença tem sido baseados na geração de modelos animais geneticamente modificados. No entanto, vários fenótipos humanos não ser replicado com sucesso em ratos, principalmente por causa das diferenças biológicas existentes entre as duas espécies. Por outro lado, o acesso aos tecidos humanos podem ser limitados e muitas vezes não o suficiente para permitir que o material seja obtido em estudos experimentais em profundidade. O campo da biologia cardiovascular sofre de ambas as seguintes limitações: a fisiologia do coração humano é significativamente diferente da do rato, e uma quantidade significativa de tecido do coração é acessível apenas post-mortem ou durante a cirurgia cardíaca. Encontrar uma fonte ideal para a diferenciação funcional CMs humana tornou-se assim um tópico central na biologia cardiovascular, e tem sido feito muito esforço para resolver este problema. Têm sido propostos vários tipos de células, imioblastos esqueléticos ncluding, células cardíacas locais estaminais, células mononucleares de medula óssea, células progenitoras endoteliais, e de células estaminais mesenquimais. No entanto, os dados obtidos usando estas células não foram consistentes ^4.

A derivação de células estaminais embrionárias humanas (ESC) ⁵ primeiros ea descoberta inovadora de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) por Yamanaka e Thomson ^6,7 tarde parecia fornecer soluções: estas células têm a capacidade de crescer indefinidamente e o potencial para dar subir a todos os derivados de células de as três camadas germinais, incluindo o MC. A utilização de células iPS oferece ainda outras vantagens: sendo derivadas de células adultas autólogas, que carregam o mesmo genoma que o indivíduo ou paciente a partir do qual eles são derivados. Por conseguinte, permitem o desenvolvimento de modelos in vitro que facilitam a investigação de doenças e dos mecanismos de desenvolvimento genéticas humanas. Em virtude dessa característica, as células iPS também pode overcome problemas relacionados à rejeição imunológica e questões éticas ^8. Por estas razões, embora CES ainda representam o padrão ouro no campo da biologia de células-tronco, pesquisadores do mundo inteiro estão agora movendo-se mais para a tecnologia de células iPS.

iPS estão agora a ser utilizados para modelar doenças humanas in vitro para várias condições, incluindo desordens cardiovasculares congénitos ^9,10. Recentemente, a aplicação da modelagem de doença das células iPS foi realizado para doenças cardíacas monogênicas (ou seja, longos síndromes do QT, taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgico) e patologias em que os defeitos cardíacos fazem parte de um fenótipo complexo (ie Leopard e síndromes Timóteo, cardiomiopatia dilatada). Estes relatórios confirmaram que as células iPS específicas do paciente, que são diferenciadas em CMs apresentam características fenotípicas e funcionais semelhantes como a doença in vivo.

No entanto, existemainda muitos desafios para melhorar a eficácia de induzir as células iPS na linhagem cardíaca. Geração espontânea de CMs do CES humanos através de formação de agregados chamados corpos embrióides (EBS) provaram ¹⁷ bem-sucedida. Desde esta descoberta, têm sido propostos muitos outros métodos. Muitos grupos têm melhorado muito a eficiência do protocolo de diferenciação e deslocaram-se para os reagentes cultura quimicamente definidos e produtos de origem animal-free (veja Mummery, C., et al., Circulation Research (2012) para uma revisão completa de todos os métodos existentes ³ ).

No entanto, o método clássico baseado na EB agregação ainda representa o mais comumente empregado para a realização de estudos funcionais e investigar os mecanismos da doença. Nosso protocolo proposto é baseado na agregação de células iPS em EB e da cultura, na presença de soro e de ácido ascórbico, a qual foi mostrada para aumentar o processo de diferenciação cardíaca e positively impactar a maturação destas células ^18,19. Neste artigo, vamos passar por essa metodologia em detalhe e vai mostrar como usar linhas de células iPS alimentador livres para gerar paciente específico CMs iPS derivadas.

Protocolo

1. Manutenção Feeder livre e Passaging de linhagens de células iPS humanas

1. Preparar os pratos Matrigel revestidos. Descongelar um frasco de Matriz CES qualificado humano em gelo durante uma hora e dilua em 25 ml de meio DMEM-F12. Adicionar 1 ml de cada uma das placas 35 mm (ou quantidades equivalentes por unidade de área de superfície, se são utilizados outros pratos), mantendo-se tudo em gelo e assegurando que todas as placas e tubos são pré-arrefecida. Cubra as placas com papel alumínio.

Nota: As concentrações variam de acordo com imagens de Matrigel do lote. Instruções de diluição são indicados na folha de dados.

2. Manter as placas em gelo durante a noite e remover o gelo no dia seguinte. As placas podem ser mantidas no frigorífico até uma semana antes da utilização.
3. Preparar o meio completo mTESR1 (ou descongelar um frasco de meio de Nutristem) e o H-ESM (médio CES humana), de acordo com a tabela abaixo.

   H-ESM	CONC FINAL	Por 500 ml
   Knockout Serum Replacement (KSR)	20%	100 ml
   GlutaMAX 100X	2mM	5 ml
   Não essenciais MEM aminoácidos	0,1 mM	5 ml
   Penicilina-estreptomicina	100 U / mL - 0,1 mg / mL	5 ml
   2-mercaptoetanol	0,1 mM	900 mL
   B27 Suplemento - sem Vitamina	1%	10 ml
   N2 Supplement	1%	5 ml
   Knockout DMEM	-	370 ml

   
   Banco de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais de 2 semanas. Para preparar o meio de crescimento completo, o FGF básico é adicionado imediatamente antes da suaalimentação e numa concentração final de 20 ng / ml.

Nota: Complete H-ESM condicionado em fibroblastos de rato embrionárias podem ser usados ​​em vez de mTESR1 ou Nutristem para as células iPS.

4. Colocar as placas revestidas em uma incubadora a 37 ° C durante 30 minutos a 2 horas antes da passaging.
5. As células devem ser passadas aproximadamente a cada 5 dias, ainda que não tenham atingido a confluência. Colônias não devem tocar.
6. Substituir o meio de crescimento com 1 ml de dispase (1 mg / ml, dissolver de um mg / ml de stock 10 em PBS).
7. Remover diferenciar áreas com puxados pipetas Pasteur de vidro. As áreas que devem ser removidos incluem estruturas em cratera cística ou no centro de colónias, e quaisquer áreas onde as células foram separadas a partir de colónias e achatada e parecem estar a migrar para fora.
8. Incubar a 37 ° C, sob uma capa de cultura até as fronteiras de colónias tornam-se mais brilhante e começar a separar (normalmente cerca de 5-7 minutos). Discard dispase. Lavar com 1 ml H-ESM e descartar.
9. Em 1 ml H-ESM, use um levantador de celular (espátula como raspador) para colônias de colheita e recolher em um tubo Eppendorf de 15 ml. Lavar com 1 ml de H-AGE e adicionar ao tubo. Girar a 1,000 rcf durante 4 min e remover o sobrenadante.
10. Ressuspender o sedimento em 1 ml de meio de crescimento pré-aquecido (ou mTESR1 ou Nutristem). Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, com menos de 6-8x. Determine quantas células deve ser banhado e remover as células desnecessárias (geralmente 1:04 ou 1:05 diluição), por exemplo, para duas placas de 1:5, remover 600 mL, em seguida, adicionar 1,6 ml de meio fresco.
11. Remover Matrigel a partir de placas. Células lugar gota a gota, distribuindo uniformemente sobre a placa. Evite apertar o tubo em excesso, pois isso fará com que as células a se mover em direção ao centro.
12. Lave tubo com 1 ml de meio e dividir entre as placas. O volume final em cada uma das placas deve ser de 1,5 -2 mL.
13. Alterar meio todos os dias, exceto no dia seguinte passaging. Embora sejaideal para mudar o meio de todos os dias, isso pode ser mudado ocasionalmente com uma freqüência de uma vez a cada dois dias, se não mais de 2-3 dias se passaram desde a última passagem sem afetar o potencial de pluripotência e diferenciação.
14. Se a linha de célula deve ser congelado, voltar a suspender em vez em 1-2 ml de meio de congelação mFreSR usando uma pipeta de 2 ml e colocar 1 ml / cryovial. Colocar os frascos num cryobox a -80 ° C e a transferência de azoto líquido em 3-4 dias.

Nota: microdissecção manual de células iPS deve ser realizada sob um microscópio estereoscópico. A fertilização in vitro (FIV) da estação de trabalho (por exemplo uma estação de trabalho de FIV KSystem) integrado com um estereomicroscópio permite a manipulação das células em condições estéreis, enquanto que eles são mantidos em uma área de superfície aquecida. Se este não está disponível, um estereomicroscópio pode ser transportada sob uma capa habitual de fluxo laminar.

2. Embryoid Corpos Agregação e Cardiac Induction

1. Prepara EBM-20 meio de acordo com a tabela abaixo.

   EBM-20	CONC FINAL	Por 500 ml
   Soro fetal bovino (origem América do Sul)	20%	100 ml
   Aminoácidos não essenciais MEM	0,1 mM	5 ml
   Penicilina - estreptomicina	100U/ml - 0,1 mg / mL	5 ml
   GlutaMAX 100X	0,1 mM	5 ml
   2-mercaptoetanol	50um	450 mL
   DMEM/F12	-	385 ml

   
   Utilização de FBS da América do Sul origem é crítico para a determinação da eficiência de diferenciação: o emprego de outros tipos de soros podem afectaro processo de diferenciação. Para preparar EBM-20, ácido ascórbico complemento completo (AA), a uma concentração final de 50 ug / ml. Meio de crescimento completo pode ser armazenado a 4 ° C durante não mais do que uma semana.
2. Colheita iPS colónias tal como descrito acima (etapas 1,6-1,9).
3. Ressuspender suavemente em 1 ml de EBM-20 com uma pipeta de 2 ml. Evite quebrar pedaços muito - pipeta cima e para baixo, não mais do que 2 a 3 vezes, verificar o tamanho das colônias sob o microscópio estereoscópico. Placa em placas ultra-baixas de fixação na proporção de 1:1 (por exemplo, por um prato de 35 mm, utilizar um poço de uma placa de 6 poços). Enxaguar tubo com 1 mL de EBM-20 e adicionar ao prato.

Nota: O tamanho das colónias de afectar o processo de diferenciação, controlar a eficiência e tempo de indução cardíaca. Agregação de homogeneamente médias EB foram mostrados para reduzir a variabilidade observada durante a diferenciação.

4. No dia 3, alterar EBM-20 uma vez usando um microscópio para evitar removal da EBS. Mantenha pipeta junto da borda do prato e retire médio.
5. Nos dias 7, interruptor EBS para placas revestidas com gelatina a 0,1% e previamente colocada a 37 ° C durante 30 min. Se necessário, a gelatina pode ser removido e as placas deixada sob um capuz de cultura de células S / N. Adicionar 35-40 EBs por 35 milímetros prato.
6. Verifique EBs para bater áreas e mudança EBM-20 duas vezes por semana. Marque áreas onde batendo estão localizados na parte superior da tampa do prato, para facilitar a localização em que o microscópio estereoscópico. Áreas contratantes deve aparecer após cerca de 10-20 dias.
7. Quando as áreas com contração espontânea aparecer, mude de médio a EBM-2 (como preparar EBM-20, com 2% de FBS vez) e isolá-los, conforme descrito abaixo na seção 3.
8. Continue a verificar outras áreas para bater e mudar média duas vezes por semana até áreas batendo são necessários para novas experiências.

Nota: A eficiência do processo de diferenciação é altamente dependentevários factores, o mais importante dos quais são as linhas de células específicas e o lote de soro usado para induzir a diferenciação cardíaca. Para se obter a máxima eficiência, as linhas celulares de teste para potencial cardiomiogênica e vários lotes de soro.

3. Batendo áreas de isolamento e Cultura

1. Casaco placas de 12 poços (4 cm ² de área) ou as placas de interesse com 5 ug / cm ^2, fibronectina diluída em PBS para perfazer o volume suficiente para cobrir toda a superfície completamente (total de 300 ul por poço em placas de 12 poços). Mantenha descoberto na capa de cultura de células e deixe secar. As placas podem ser embalados e armazenados a 4 ° CO / N.
2. Remover área utilizando um copo de bater puxado pipeta Pasteur e bisturi, conforme necessário. Transfira para placas revestidas com fibronectina com um pipeta de 1 ml.
3. Adicionar 1 mL de EBM-2.
4. Atravessar fora da placa para indicar as áreas onde as células foram removidas e mudar o meio. As placas podem ser mantidos por até 1 mês, como outras áreas podem começar bcomer mais tarde.

Nota: Se forem necessários pedaços menores batendo, pipetar a área explantada cima e para baixo várias vezes sob a lupa, até que quebre em pedaços menores. Isto irá resultar em aglomerados de algumas células batimento (ver o filme 3).

5. Mudar meio duas vezes por semana até que esteja pronto para as análises.

Nota: Os cardiomiócitos obtidos com este protocolo, possuem características morfológicas e funcionais semelhantes fetal; maturação para um adulto fenótipo semelhante pode ser obtido através do aumento do tempo em cultura para diferenciar ainda mais essas células.

4. Único batendo celas de isolamento e Análise

1. Casaco lâminas 2-câmara (4 cm ² de área) ou outros suportes apropriados, com 5 ug / cm ² fibronectina diluído em PBS suficiente para cobrir toda a superfície de cultura. Se for usado um suporte de vidro, revestimento com laminina e fibronectina (5 ug / cm ^{2 cada).}
2. Remover área batendo com uma pipeta de Pasteur / bisturi a partir das placas da secção 3.
3. Utilizando uma pipeta de 1 ml, transferir as células para um tubo de 15 ml contendo 500 ul de colagenase II (480 U / ml em PBS com Ca e Mg) e incubar 15 min a 37 ° C, agitando o tubo, uma vez durante a incubação.
4. Pipeta cima e para baixo com uma pipeta de 200 mL. Se qualquer aglomerados permanecer, a transferência para novo colagenase II e repita o passo 4.3.
5. Repita o passo 4.4 até que não haja grandes aglomerações são deixados.
6. Inativar colagenase com 3 ml de EBM-2 (sem AA). O tubo pode ser deixado sob o capô em um rack aquecida até outros tubos estão prontos. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
7. Ressuspender o sedimento em 1 ml de 0,25% de tripsina / EDTA (diluído a partir de um estoque a 0,5% em PBS 1X) e incubar a 37 ° C durante 5 min. Combinar as fracções a partir de digestões com a mesma amostra inicial.
8. Inativar tripsina com 4 ml de EBM-2 (sem AA). Passe as células através de uma agulha de 18G em uma seringa de 2,5 ml não mais than 7x. Centrifugar a 1000 rcf durante 4 min.
9. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de EBM-2 por poço e a placa. As células podem ser usadas para análises funcionais e morfológicas de 2-3 dias após o plaqueamento.

Resultados

Em nossos estudos geramos CMs de várias linhagens de células iPS. Estas linhas foram geradas inicialmente numa camada alimentadora MEF mas foram imediatamente colocadas em Matrigel utilizando um meio quimicamente definido (ou mTESR1 ou Nutristem). Vários ensaios foram usados ​​para verificar a manutenção das propriedades morfológicas, a expressão de marcadores típicos de células pluripotentes (OCT-4, e SSEA4 TRA1-60) e à sua estabilidade do genoma (figura 1).

I...

Discussão

As células estaminais pluripotentes têm o potencial para se diferenciar espontaneamente em CMs, embora com eficiência baixa e alta variabilidade entre linhas. O desenvolvimento de novos métodos de indução tem, portanto, destinado a melhorar a eficiência do processo e movendo-se para mais protocolos definidos. No entanto, a maioria destes novos métodos de diferenciação são bastante complexas, exigindo condições de elaborar a cultura, um bom controle de tempo e concentração de reagentes e tratamento com cit...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon