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Method Article
Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.
Al fine di indagare gli eventi di guida lo sviluppo del cuore e per determinare i meccanismi molecolari responsabili delle malattie del miocardio negli esseri umani, è essenziale prima di generare cardiomiociti umani funzionali (CMS). L'uso di queste cellule in scoperta di farmaci e studi tossicologici sarebbe anche molto vantaggioso, permettendo nuove molecole farmacologici per il trattamento dei disturbi cardiaci essere convalidate preclinicamente su cellule di origine umana. Delle possibili fonti di CMS, staminali pluripotenti (iPS) indotte sono tra i più promettenti, in quanto possono essere ricavati direttamente dal tessuto del paziente prontamente accessibile e possiedono una intrinseca capacità di dare origine a tutti i tipi di cellule del corpo 1. Sono stati proposti diversi metodi per differenziare le cellule iPS in CMS, che vanno dai corpi embrionali classiche (EBS) approccio aggregazione chimica definita protocolli 2,3. In questo articolo vi proponiamo un protocollo EB-based e mostriamo come questa metodologiad può essere impiegato per generare in modo efficiente le cellule CM-come funzionali di cellule iPS alimentatore-Free.
Storicamente, l'indagine dei meccanismi genetici e molecolari che guida lo sviluppo umano e la malattia si è basata sulla generazione di modelli animali geneticamente modificati. Tuttavia, numerosi fenotipi umani non riescono ad essere replicato correttamente nei topi, soprattutto a causa delle differenze biologiche esistenti tra le due specie. D'altra parte, l'accesso ai tessuti umani può essere limitata e spesso non permettono abbastanza materiale da ottenere per studi sperimentali approfonditi. Il campo della biologia cardiovascolare soffre di entrambe queste limitazioni: la fisiologia del cuore umano è significativamente diversa da quella del topo, e una quantità significativa di tessuto cardiaco è accessibile solo post mortem o durante la chirurgia cardiaca. Trovare una fonte ottimale per la differenziazione delle funzionale umana CM è quindi diventato un tema centrale in biologia cardiovascolare, ed è stato fatto molto sforzo per risolvere questo problema. Sono stati proposti vari tipi di cellule, including mioblasti scheletrici, cellule locali cardiache staminali del midollo osseo, cellule mononucleari, progenitori endoteliali e cellule staminali mesenchimali. Tuttavia, i dati ottenuti utilizzando queste cellule non sia stato coerente 4.
La derivazione di cellule staminali embrionali umane (ESC) prima 5 e la scoperta rivoluzionaria di staminali pluripotenti (iPS), cellule indotte da Yamanaka e Thomson 6,7 poi sembrava fornire soluzioni: queste cellule hanno la capacità di crescere indefinitamente e il potenziale per dare salire a tutti i derivati delle cellule dei tre foglietti embrionali, tra cui il CMS. L'uso di cellule iPS offre ulteriori vantaggi: essendo derivati da cellule adulte autologhe, portano lo stesso genoma come l'individuo o paziente da cui sono derivati. Essi consentono quindi lo sviluppo di modelli in vitro che facilitano l'indagine di malattie genetiche umane e meccanismi di sviluppo. In virtù di questa caratteristica, le cellule iPS possono anche Oproblemi legati alla vercome rigetto immunitario e questioni etiche 8. Per queste ragioni, anche se i CES rappresentano ancora il gold standard nel campo della biologia delle cellule staminali, i ricercatori in tutto il mondo si stanno ora orientando più verso la tecnologia delle cellule iPS.
cellule iPS vengono ora impiegati per modellare la malattia umana in vitro per le varie condizioni, tra cui disturbi cardiovascolari congenite 9,10. Recentemente, l'applicazione di modelli di malattia delle cellule iPS è stata eseguita per i disturbi cardiaci monogeniche (cioè lunghe sindromi del QT, tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica) e patologie nelle quali difetti cardiaci fanno parte di un fenotipo complesso (cioè Leopard e Timothy sindromi, cardiomiopatia dilatativa). Questi rapporti hanno confermato che le cellule iPS specifiche per ogni paziente che si differenziano in CM presentano caratteristiche fenotipiche e funzionali simili, come la malattia in vivo.
Tuttavia, cisono ancora molte sfide per migliorare l'efficacia di indurre le cellule iPS nella discendenza cardiaco. Spontanea generazione di CMS dalla CES umane attraverso la formazione di aggregati chiamati corpi embrionali (EBS) si sono dimostrati di successo 17. Dopo questa scoperta, sono stati proposti molti altri metodi. Molti gruppi hanno notevolmente migliorato l'efficienza del protocollo di differenziazione e si sono spostati verso i reagenti di coltura chimicamente definite e animale-prodotto-libero (vedi Mummery, C., et al., Ricerca Circolazione (2012) per una rassegna completa di tutti i metodi esistenti 3 ).
Tuttavia, il metodo classico basato su EB aggregazione rappresenta ancora il più comunemente impiegato per l'esecuzione di studi funzionali e di indagare i meccanismi di malattia. La nostra proposta di protocollo si basa sull'aggregazione di cellule iPS in EBs e cultura in presenza di acido ascorbico e di siero, che ha dimostrato di migliorare il processo di differenziazione cardiaca e di Positively influenzare la maturazione di queste cellule 18,19. In questo articolo andremo attraverso questa metodologia in dettaglio e vi mostreremo come utilizzare alimentatore-Free linee di cellule iPS per la generazione di paziente-specifici iPS derivate CMS.
1. Manutenzione alimentatore-Free e Passaging delle iPS umane Cell Lines
Nota: le concentrazioni di magazzino Matrigel variano a seconda del lotto. Istruzioni per la diluizione sono indicati sulla scheda tecnica.
H-ESM | FINALE CONC | Per 500 ml |
Knockout Serum Replacement (KSR) | 20% | 100 ml |
Glutamax 100X | 2 mM | 5 ml |
MEM non essenziali aminoacidi | 0,1 mM | 5 ml |
Penicillina-streptomicina | 100 U / ml - 0,1 mg / ml | 5 ml |
2-mercaptoetanolo | 0,1 mM | 900 microlitri |
B27 Supplemento - senza Vitamina | 1% | 10 ml |
N2 Supplement | 1% | 5 ml |
Knockout DMEM | - | 370 ml |
Nota: Complete H-ESM condizionato su fibroblasti embrionali di topo può essere utilizzato al posto di mTESR1 o Nutristem per le cellule iPS.
Nota: microdissezione manuale delle cellule iPS deve essere effettuata allo stereomicroscopio. Una fecondazione in vitro (IVF) workstation (ad esempio una workstation IVF da KSystem) integrato con uno stereomicroscopio permette la manipolazione delle cellule in condizioni sterili mentre sono tenuti su una superficie riscaldata. Se questo non è disponibile, uno stereomicroscopio può essere spostata sotto una cappa a flusso laminare regolare.
2. Corpi embrionali Aggregazione e Cardiac Induction
EBM-20 | FINALE CONC | Per 500 ml |
Di siero fetale bovino (provenienza Sud America) | 20% | 100 ml |
MEM aminoacidi non essenziali | 0,1 mM | 5 ml |
Penicillina - streptomicina | 100U/ml - 0,1 mg / ml | 5 ml |
Glutamax 100X | 0,1 mM | 5 ml |
2-mercaptoetanolo | 50um | 450 microlitri |
DMEM/F12 | - | 385 ml |
Nota: La dimensione delle colonie influenzano il processo di differenziazione, controllando l'efficienza e la tempistica di induzione cardiaco. Aggregazione di omogeneamente dimensioni EBs hanno dimostrato di ridurre la variabilità osservata durante la differenziazione.
Nota: L'efficienza del processo di differenziazione è fortemente dipendentediversi fattori, il più critico dei quali sono le linee cellulari specifici e il lotto del siero usati per indurre differenziazione cardiaca. Per ottenere la massima efficienza, linee cellulari di prova per potenziale cardiomyogenic e vari lotti di siero.
3. Battere aree di isolamento e di cultura
Nota: Se sono necessari più piccoli ciuffi battendo, pipettare l'area espiantato su e giù diverse volte con lo stereomicroscopio, finché non si rompe in piccoli pezzi. Questo si tradurrà in gruppi di poche cellule battente (vedi film 3).
Nota: Cardiomyocytes ottenuti da questo protocollo possiedono caratteristiche morfologiche e funzionali fetale-simili; maturazione verso un fenotipo adulto-simile può essere ottenuto aumentando il tempo di coltura per differenziare ulteriormente queste cellule.
4. Singolo Battere celle di isolamento e di analisi
Nei nostri studi abbiamo generato CM da diverse linee di cellule iPS. Queste linee sono state inizialmente generate su uno strato di alimentatore MEF ma sono stati immediatamente immessi sul Matrigel usando un terreno specifico (sia mTESR1 o Nutristem). Vari metodi sono stati utilizzati per verificare mantenimento delle proprietà morfologiche, l'espressione di marcatori tipici di cellule pluripotenti (OCT-4, SSEA4 e TRA1-60) e la loro stabilità genoma (Figura 1).
Induz...
Cellule staminali pluripotenti hanno la potenzialità di differenziarsi spontaneamente in CMS, anche se con bassa efficienza ed elevata variabilità tra le linee. Lo sviluppo di nuovi metodi di induzione è quindi concentrata sul miglioramento dell'efficienza del processo e muoversi verso protocolli più definiti. Tuttavia, la maggior parte di questi nuovi metodi di differenziazione sono piuttosto complessi, che richiedono condizioni elaborate cultura, controllo fine dei tempi e la concentrazione dei reagenti, e il ...
Non ci sono interessi finanziari a divulgare.
BS è stato sostenuto da Università degli Studi di Milano-Bicocca Summer Student Programma di formazione alla ricerca; ricerca è stata sostenuta da fondi del Ministero della Salute italiano e dal Ministero italiano dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca e la Fondazione Humanitas per GC, si ringraziano Michael VG Latronico per criticamente la lettura del manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Media and Reagents | |||
Human ESC-qualified Matrix | BD Biosciences | 354277 | Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C . |
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution | Sigma | F0896-2MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
Laminin | Sigma | L2020-1MG | Working concentration: 5 μg/cm2 |
PBS (no Mg and Ca), 10X | Lonza | BE17-515F | |
PBS (with Mg and Ca), 10X | Bio Sera | XC-S2067/500 | |
Dispase II, neutral protease, grade II | Roche | 4942078001 | Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca) |
Trypsin/EDTA, 0.5% | Sigma | T3924 | |
Collagenase type 2 | Worthington | 4176 | Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca |
DMEM-F12 | Life Technologies | 21331-020 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C |
Foetal Bovine Serum (origin South America) | Invitrogen | 10270-106 | Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C |
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X | Life Technologies | 15140-122 | |
GlutaMAX, 100X | Life Technologies | 35050-038 | |
MEM NEAA, 100X | Invitrogen | 11140-135 | |
N2 supplement, 100X | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 supplement, 50X | Life Technologies | 12587-010 | |
2-mercaptoethanol | Invitrogen | 31350-010 | |
Gelatin, from porcine skin | Sigma | G1890-100G | Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C |
mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week |
Nutristem hESC XF | Stemgent from Biological Industries | 05-100-1A | Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week. |
mFreSR | Stem Cell Technologies | 5853 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544-25G | Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X) |
Plasticware | |||
35 mm culture dishes | Becton Dickinson | 353001 | |
Cell scraper | Corning Incorporated | 3008 | |
12-well plates | Becton Dickinson | 353043 | |
Permanox 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177437 | |
Glass 2-well chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 177380 | |
6-well plates, ultra-low-attachment surface | Corning Incorporated | 3471 | |
18G needle | Becton Dickinson | 304622 | |
Glass pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
2.5 ml syringe | Becton Dickinson | 300188 | |
Equipments | |||
IVF Workstation | KSystem, by Nikon | ||
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope | Nikon |
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