Generazione di cardiomiociti umani: Un protocollo di differenziazione da alimentatore-Free umani cellule staminali pluripotenti indotte

Riepilogo

Le cellule staminali pluripotenti, sia staminali (iPS), le cellule embrionali pluripotenti o indotto, costituiscono una preziosa fonte di cellule differenziate umani, tra cardiomiociti. Qui, ci si concentrerà sulla induzione cardiaco di cellule iPS, che mostra come usarli per ottenere cardiomiociti umani funzionali attraverso un protocollo embryoid corpi-based.

Abstract

Al fine di indagare gli eventi di guida lo sviluppo del cuore e per determinare i meccanismi molecolari responsabili delle malattie del miocardio negli esseri umani, è essenziale prima di generare cardiomiociti umani funzionali (CMS). L'uso di queste cellule in scoperta di farmaci e studi tossicologici sarebbe anche molto vantaggioso, permettendo nuove molecole farmacologici per il trattamento dei disturbi cardiaci essere convalidate preclinicamente su cellule di origine umana. Delle possibili fonti di CMS, staminali pluripotenti (iPS) indotte sono tra i più promettenti, in quanto possono essere ricavati direttamente dal tessuto del paziente prontamente accessibile e possiedono una intrinseca capacità di dare origine a tutti i tipi di cellule del corpo ^1. Sono stati proposti diversi metodi per differenziare le cellule iPS in CMS, che vanno dai corpi embrionali classiche (EBS) approccio aggregazione chimica definita protocolli ^2,3. In questo articolo vi proponiamo un protocollo EB-based e mostriamo come questa metodologiad può essere impiegato per generare in modo efficiente le cellule CM-come funzionali di cellule iPS alimentatore-Free.

Introduzione

Storicamente, l'indagine dei meccanismi genetici e molecolari che guida lo sviluppo umano e la malattia si è basata sulla generazione di modelli animali geneticamente modificati. Tuttavia, numerosi fenotipi umani non riescono ad essere replicato correttamente nei topi, soprattutto a causa delle differenze biologiche esistenti tra le due specie. D'altra parte, l'accesso ai tessuti umani può essere limitata e spesso non permettono abbastanza materiale da ottenere per studi sperimentali approfonditi. Il campo della biologia cardiovascolare soffre di entrambe queste limitazioni: la fisiologia del cuore umano è significativamente diversa da quella del topo, e una quantità significativa di tessuto cardiaco è accessibile solo post mortem o durante la chirurgia cardiaca. Trovare una fonte ottimale per la differenziazione delle funzionale umana CM è quindi diventato un tema centrale in biologia cardiovascolare, ed è stato fatto molto sforzo per risolvere questo problema. Sono stati proposti vari tipi di cellule, including mioblasti scheletrici, cellule locali cardiache staminali del midollo osseo, cellule mononucleari, progenitori endoteliali e cellule staminali mesenchimali. Tuttavia, i dati ottenuti utilizzando queste cellule non sia stato coerente ^4.

La derivazione di cellule staminali embrionali umane (ESC) prima ⁵ e la scoperta rivoluzionaria di staminali pluripotenti (iPS), cellule indotte da Yamanaka e Thomson ^6,7 poi sembrava fornire soluzioni: queste cellule hanno la capacità di crescere indefinitamente e il potenziale per dare salire a tutti i derivati ​​delle cellule dei tre foglietti embrionali, tra cui il CMS. L'uso di cellule iPS offre ulteriori vantaggi: essendo derivati ​​da cellule adulte autologhe, portano lo stesso genoma come l'individuo o paziente da cui sono derivati. Essi consentono quindi lo sviluppo di modelli in vitro che facilitano l'indagine di malattie genetiche umane e meccanismi di sviluppo. In virtù di questa caratteristica, le cellule iPS possono anche Oproblemi legati alla vercome rigetto immunitario e questioni etiche ^8. Per queste ragioni, anche se i CES rappresentano ancora il gold standard nel campo della biologia delle cellule staminali, i ricercatori in tutto il mondo si stanno ora orientando più verso la tecnologia delle cellule iPS.

cellule iPS vengono ora impiegati per modellare la malattia umana in vitro per le varie condizioni, tra cui disturbi cardiovascolari congenite ^9,10. Recentemente, l'applicazione di modelli di malattia delle cellule iPS è stata eseguita per i disturbi cardiaci monogeniche (cioè lunghe sindromi del QT, tachicardia ventricolare polimorfa catecolaminergica) e patologie nelle quali difetti cardiaci fanno parte di un fenotipo complesso (cioè Leopard e Timothy sindromi, cardiomiopatia dilatativa). Questi rapporti hanno confermato che le cellule iPS specifiche per ogni paziente che si differenziano in CM presentano caratteristiche fenotipiche e funzionali simili, come la malattia in vivo.

Tuttavia, cisono ancora molte sfide per migliorare l'efficacia di indurre le cellule iPS nella discendenza cardiaco. Spontanea generazione di CMS dalla CES umane attraverso la formazione di aggregati chiamati corpi embrionali (EBS) si sono dimostrati di successo ^17. Dopo questa scoperta, sono stati proposti molti altri metodi. Molti gruppi hanno notevolmente migliorato l'efficienza del protocollo di differenziazione e si sono spostati verso i reagenti di coltura chimicamente definite e animale-prodotto-libero (vedi Mummery, C., et al., Ricerca Circolazione (2012) per una rassegna completa di tutti i metodi esistenti ³ ).

Tuttavia, il metodo classico basato su EB aggregazione rappresenta ancora il più comunemente impiegato per l'esecuzione di studi funzionali e di indagare i meccanismi di malattia. La nostra proposta di protocollo si basa sull'aggregazione di cellule iPS in EBs e cultura in presenza di acido ascorbico e di siero, che ha dimostrato di migliorare il processo di differenziazione cardiaca e di Positively influenzare la maturazione di queste cellule ^18,19. In questo articolo andremo attraverso questa metodologia in dettaglio e vi mostreremo come utilizzare alimentatore-Free linee di cellule iPS per la generazione di paziente-specifici iPS derivate CMS.

Protocollo

1. Manutenzione alimentatore-Free e Passaging delle iPS umane Cell Lines

1. Preparare i piatti Matrigel rivestite. Scongelare una fiala di Matrix ESC-umano qualificato in ghiaccio per un'ora e diluirlo in 25 ml di DMEM-F12 medium. Aggiungere 1 ml di ciascuna piastra 35 mm (o importi equivalenti per superficie, se sono utilizzati altri piatti), mantenendo tutto il ghiaccio e la garanzia che tutte le lastre e tubi sono pre-raffreddata. Coprire le piastre con un foglio di alluminio.

Nota: le concentrazioni di magazzino Matrigel variano a seconda del lotto. Istruzioni per la diluizione sono indicati sulla scheda tecnica.

2. Mantenere le piastre in ghiaccio durante la notte e rimuovere dal ghiaccio il giorno successivo. Le piastre possono essere conservate in frigorifero fino ad una settimana prima di utilizzare.
3. Preparare il terreno completo mTESR1 (o scongelare una fiala di Nutristem media) e l'H-ESM (medio ESC umane) in base alla tabella sottostante.

   H-ESM	FINALE CONC	Per 500 ml
   Knockout Serum Replacement (KSR)	20%	100 ml
   Glutamax 100X	2 mM	5 ml
   MEM non essenziali aminoacidi	0,1 mM	5 ml
   Penicillina-streptomicina	100 U / ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   2-mercaptoetanolo	0,1 mM	900 microlitri
   B27 Supplemento - senza Vitamina	1%	10 ml
   N2 Supplement	1%	5 ml
   Knockout DMEM	-	370 ml

   
   Archivio mezzo può essere conservato a 4 ° C per non più di 2 settimane. Per preparare il terreno di coltura completo, FGF di base viene aggiunto solo before l'alimentazione ad una concentrazione finale di 20 ng / ml.

Nota: Complete H-ESM condizionato su fibroblasti embrionali di topo può essere utilizzato al posto di mTESR1 o Nutristem per le cellule iPS.

4. Posizionare le piastre rivestite in un incubatore a 37 ° C per 30 min a 2 ore prima della passaging.
5. Le cellule devono essere diversi passaggi circa ogni 5 giorni, anche se non hanno raggiunto la confluenza. Le colonie non dovrebbero toccare.
6. Sostituire mezzo di crescita con 1 ml di dispasi (1 mg / ml, sciogliere da 10 mg / ml di brodo in PBS).
7. Rimuovere differenziare le aree con tirato vetro pipette Pasteur. Le aree che dovrebbero essere rimossi comprendono strutture a cratere o cistica nel centro di colonie, e le aree in cui le cellule si sono separati dalle colonie e appiattiti e sembrano essere la migrazione verso l'esterno.
8. Incubare a 37 ° C sotto una cappa di coltura fino al confine colonie diventano più luminose e cominciano a staccarsi (di solito circa 5-7 min). Discard dispasi. Lavare con 1 ml di H-ESM e scartare.
9. In 1 ml di H-ESM, utilizzare un sollevatore di cellulare (spatola-come raschietto) per colonie raccolto e raccogliere in una provetta Eppendorf 15. Risciacquare con 1 ml di H-ESM e aggiungere al tubo. Spin a 1.000 rcf per 4 minuti e rimuovere il surnatante.
10. Risospendere il pellet in 1 ml di terreno di crescita pre-riscaldato (sia mTESR1 o Nutristem). Evitare di rompere i grumi troppo - pipetta su e giù per meno di 6-8x. Determinare quante cellule devono essere placcato e rimuovere le cellule non necessarie (di solito 1:04 o 1:5 di diluizione), ad esempio per 2 piatti a 1:05, togliere 600 ml, aggiungere 1,6 ml di mezzo fresco.
11. Rimuovere Matrigel dalle piastre. Cellule posto goccia a goccia, distribuendo in modo uniforme sul piatto. Evitare di scuotere il tubo di troppo, in modo da indurre le cellule a muoversi verso il centro.
12. Lavare tubo con 1 ml di mezzo e di divisione tra le piastre. Volume finale in ogni piastra deve essere 1,5 -2 ml.
13. Cambiare medio di tutti i giorni, tranne il giorno dopo passaging. Sebbene siaideale per cambiare il mezzo quotidiana, puo essere cambiata occasionalmente ad una frequenza di una volta ogni due giorni se sono passati più di 2-3 giorni dall'ultimo passaggio senza influenzare potenziale pluripotenza o differenziazione.
14. Se la linea cellulare deve essere congelato, risospendere invece in 1-2 ml mFreSR congelamento media utilizzando una pipetta ml 2 e posto 1 ml / esageratamente. Posto flaconi in un CRYOBOX a -80 ° C e trasferimento azoto liquido in 3-4 giorni.

Nota: microdissezione manuale delle cellule iPS deve essere effettuata allo stereomicroscopio. Una fecondazione in vitro (IVF) workstation (ad esempio una workstation IVF da KSystem) integrato con uno stereomicroscopio permette la manipolazione delle cellule in condizioni sterili mentre sono tenuti su una superficie riscaldata. Se questo non è disponibile, uno stereomicroscopio può essere spostata sotto una cappa a flusso laminare regolare.

2. Corpi embrionali Aggregazione e Cardiac Induction

1. Preparare EBM-20 medio secondo la tabella sottostante.

   EBM-20	FINALE CONC	Per 500 ml
   Di siero fetale bovino (provenienza Sud America)	20%	100 ml
   MEM aminoacidi non essenziali	0,1 mM	5 ml
   Penicillina - streptomicina	100U/ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   Glutamax 100X	0,1 mM	5 ml
   2-mercaptoetanolo	50um	450 microlitri
   DMEM/F12	-	385 ml

   
   Uso di FBS di origine Sud America è fondamentale per determinare l'efficienza di differenziazione: l'occupazione di altri tipi di sieri possono influireil processo di differenziazione. Per preparare EBM-20, acido ascorbico lista completa (AA) ad una concentrazione finale di 50 pg / ml. Terreno di crescita completo può essere conservato a 4 ° C per non più di una settimana.
2. Harvest iPS colonie come descritto sopra (passi 1,6-1,9).
3. Risospendere delicatamente in 1 ml EBM-20 con una pipetta ml 2. Evitare di rompere i grumi troppo - pipetta su e giù per non più di 2-3x, controllando la dimensione delle colonie allo stereomicroscopio. Piastra su piastre di fissaggio ultra-bassi in rapporto 1:1 (per esempio per un piatto di 35 mm, utilizzare 1 pozzetto di un 6-pozzetti). Sciacquare provetta con 1 ml di EBM-20 e di aggiungere al piatto.

Nota: La dimensione delle colonie influenzano il processo di differenziazione, controllando l'efficienza e la tempistica di induzione cardiaco. Aggregazione di omogeneamente dimensioni EBs hanno dimostrato di ridurre la variabilità osservata durante la differenziazione.

4. Il giorno 3, cambiare EBM-20 una volta utilizzando un microscopio per evitare di ririmozione di EBS. Mantenere pipetta vicino a bordo del piatto, e togliere medie.
5. Il giorno 7, interruttore EBs alle piastre rivestite con 0,1% di gelatina e precedentemente posizionato a 37 ° C per 30 min. Se necessario, la gelatina può essere rimosso e piastre lasciato sotto una cappa di coltura cellulare O / N. Aggiungere 35-40 EBs per piastra da 35 mm.
6. Controllare EBs per battere le zone e cambiamento EBM-20 due volte a settimana. Delimitare le zone dove battono sono situati sulla parte superiore del coperchio piatto, per facilitare la loro localizzazione con lo stereomicroscopio. Aree contraenti dovrebbero comparire dopo circa 10-20 giorni.
7. Quando le aree con contrazione spontanea appaiono, passare medio EBM-2 (preparare come EBM-20, con il 2% di FBS, invece) e isolano come descritto di seguito nella sezione 3.
8. Continuare a controllare altre zone per aver picchiato e cambiare media due volte a settimana fino a quando sono necessarie aree battendo per ulteriori esperimenti.

Nota: L'efficienza del processo di differenziazione è fortemente dipendentediversi fattori, il più critico dei quali sono le linee cellulari specifici e il lotto del siero usati per indurre differenziazione cardiaca. Per ottenere la massima efficienza, linee cellulari di prova per potenziale cardiomyogenic e vari lotti di siero.

3. Battere aree di isolamento e di cultura

1. Cappotto piastre da 12 pozzetti (4 cm ² di area) e le piastre di interesse con 5 pg / cm ² fibronectina, diluiti in PBS per fare un volume sufficiente a coprire completamente l'intera superficie (totale 300 pl per pozzetto in piastre da 12 pozzetti). Tenere scoperto in cappuccio di coltura cellulare e lasciare asciugare. Le piastre possono essere confezionati e conservati a 4 ° CO / N.
2. Rimuovere area utilizzando un bicchiere battendo tirato pipetta Pasteur e bisturi, come necessario. Trasferimento alla fibronectina piastre rivestite con una pipetta da 1 ml.
3. Aggiungere 1 ml di EBM-2.
4. Attraversare fuori la piastra per indicare le aree dove sono stati rimossi e le cellule cambiare il mezzo. Le piastre possono essere conservate per un massimo di 1 mese, come altre aree possono iniziare bmangiare in seguito.

Nota: Se sono necessari più piccoli ciuffi battendo, pipettare l'area espiantato su e giù diverse volte con lo stereomicroscopio, finché non si rompe in piccoli pezzi. Questo si tradurrà in gruppi di poche cellule battente (vedi film 3).

5. Cambiare media due volte a settimana fino al momento delle analisi.

Nota: Cardiomyocytes ottenuti da questo protocollo possiedono caratteristiche morfologiche e funzionali fetale-simili; maturazione verso un fenotipo adulto-simile può essere ottenuto aumentando il tempo di coltura per differenziare ulteriormente queste cellule.

4. Singolo Battere celle di isolamento e di analisi

1. Cappotto vetrini 2-camera (4 cm ² area) o altri supporti appropriati con 5 pg / cm ² fibronectina diluito in PBS sufficiente a coprire l'intera superficie cultura. Se viene utilizzato un supporto di vetro, cappotto con laminina e fibronectina (5 mcg / cm ^{2 ciascuno).}
2. Rimuovere zona battendo con una pipetta Pasteur / bisturi dalle tavole della sezione 3.
3. Usando una pipetta 1 ml, trasferire le cellule su una provetta 15 ml contenente 500 microlitri collagenasi II (480 U / ml in PBS con Mg e Ca) e incubare 15 minuti a 37 ° C, agitando il tubo una volta durante l'incubazione.
4. Pipetta su e giù con una pipetta 200 microlitri. Se eventuali grumi rimangono, trasferimento a fresco collagenasi II e ripetere il punto 4.3.
5. Ripetere il punto 4.4 fino a quando non ha grandi ciuffi sono lasciati.
6. Inattivare collagenasi con 3 ml di EBM-2 (no AA). Il tubo può quindi essere lasciato sotto il cofano in un rack riscaldata finché altri tubi sono pronti. Centrifugare a 1000 rcf per 4 min.
7. Risospendere pellet in 1 ml di 0,25% tripsina / EDTA (diluito da uno stock di 0,5% in 1X PBS) e incubare a 37 ° C per 5 min. Combina frazioni di digestioni dallo stesso campione iniziale.
8. Inattivare la tripsina con 4 ml EBM-2 (no AA). Passare cellule attraverso un ago 18G in una siringa da 2,5 ml non più than 7x. Centrifugare a 1000 rcf per 4 min.
9. Risospendere il pellet di cellule in 1 ml di EBM-2 per pozzetto e la piastra. Cellule possono essere utilizzati per analisi funzionali e morfologiche 2-3 giorni dopo la placcatura.

Risultati

Nei nostri studi abbiamo generato CM da diverse linee di cellule iPS. Queste linee sono state inizialmente generate su uno strato di alimentatore MEF ma sono stati immediatamente immessi sul Matrigel usando un terreno specifico (sia mTESR1 o Nutristem). Vari metodi sono stati utilizzati per verificare mantenimento delle proprietà morfologiche, l'espressione di marcatori tipici di cellule pluripotenti (OCT-4, SSEA4 e TRA1-60) e la loro stabilità genoma (Figura 1).

Induz...

Discussione

Cellule staminali pluripotenti hanno la potenzialità di differenziarsi spontaneamente in CMS, anche se con bassa efficienza ed elevata variabilità tra le linee. Lo sviluppo di nuovi metodi di induzione è quindi concentrata sul miglioramento dell'efficienza del processo e muoversi verso protocolli più definiti. Tuttavia, la maggior parte di questi nuovi metodi di differenziazione sono piuttosto complessi, che richiedono condizioni elaborate cultura, controllo fine dei tempi e la concentrazione dei reagenti, e il ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt–thanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon