인간의 Cardiomyocytes의 생성 : 피더없는 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 프로토콜

요약

만능 줄기 세포는 배아 또는 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포 중 하나는 심근을 포함한 인간의 차별화 된 세포의 중요한 소스를 구성합니다. 여기, 우리는 배아 체 기반 프로토콜을 통해 기능적 인간의 심근을 얻기 위해 그들을 사용하는 방법을 보여주는, IPS 세포의 심장 유도에 초점을 맞출 것이다.

초록

심장 개발을 운전 사건을 조사하고, 인간의 심근 질환에 이르는 분자 메커니즘을 결정하기 위해 기능적 인간의 심근 (CMS)를 생성하는 첫 번째 필수입니다. 약물 발견 및 독성학 연구에서 이러한 세포의 사용은 또한 인간의 기원 세포 사전 임상 적 유효성을 검사 할 심장 질환의 치료를위한 새로운 약물 분자를 허용, 매우 도움이 될 것입니다. CMS를 수있는 소스, 유도 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포들이 쉽게 접근 환자의 조직에서 직접 파생 될 수있는, 가장 유망한 사이이며, 본체 ^(1)의 모든 세포 유형을 야기 할 수있는 고유의 능력을 가지고있다. 여러 가지 방법이 화학적으로 정의 된 프로토콜 ^2,3에 고전 배아 체에서 (사채) 집계 방식에 이르기까지, CM을에 IPS 세포 차별화를 위해 제안되었다. 이 문서에서 우리는 사채 기반 프로토콜을 제안하고 보여주는 방법이 METHOD를 효율적으로 장치가없는 IPS 세포의 기능 CM과 같은 세포를 생성하기 위해 사용 할 수 있습니다.

서문

역사적으로, 인간 발달과 질병을 운전 유전 및 분자 메커니즘 연구는 유전자 변형 동물 모델의 생성에 기초하고있다. 그러나 수많은 인간의 표현형이 성공적으로 주로하기 때문에 두 종족 사이에 존재하는 생물학적 차이, 생쥐 복제에 실패합니다. 반면에, 인간의 조직에 대한 액세스를 제한 할 수 있으며, 자주 자료가 심도있는 실험 연구를 취득 할 수 없습니다. 심장 혈관 생물학 분야는 이러한 제한을 모두 앓고 : 인간의 마음의 생리는 마우스의 그것과 크게 다르고, 심장 조직의 상당한 수량은 사후 또는 심장 수술 동안 액세스 할 수 있습니다. 기능 인간의 CMS 분화 최적의 소스를 찾기 때문에 심장 혈관 생물학의 중심 화제가되고 있으며, 많은 노력이 문제를 해결하기 위해 만들어졌다. 다양한 세포 유형은 내가 제안되었다ncluding 골격 근모, 지역 심장 줄기 세포, 골수 단핵 세포, 내피 전구 세포와 중간 엽 줄기 세포. 그러나 데이터는 ⁴ 일치되지 않은 이러한 세포를 사용하여 얻었다.

인간 배아 줄기 세포 (ESC)의 유도는 처음 ⁵ 야마나카와 톰슨 ^6,7에 의해 유도 된 pluripotent 줄기 (IPS의) 세포의 획기적인 발견은 나중에 솔루션을 제공 할 듯 : 이러한 세포주기 위하여 무한정 성장 능력과 잠재력을 가지고 CMS를 포함한 세 가지 배엽의 세포 파생 상품에 상승. IPS 세포의 사용이 더 장점을 제공합니다 :자가 성인 세포에서 파생 된을, 그들은이 파생되는 개인 또는 환자와 같은 게놈을 가지고 다니십시오. 그러므로 그들은 인간의 유전 질환 및 개발 메커니즘의 조사를 용이하게 체외 모델의 개발을 할 수 있습니다. 이러한 특성 덕분에, IPS 세포는 O를 할 수 있습니다면역 거부 및 윤리적 문제 ^8에 관한 vercome 문제. 줄이고 ESCs는 여전히 줄기 세포 생물학 분야의 황금 표준을 표현하더라도 이러한 이유로 들어, 연구자들은 전세계는 이제 만능 줄기 세포 기술쪽으로 더 이동하고있다.

IPS 세포는 현재 선천성 심장 질환 ^9,10 등 다양한 조건에 대한 체외에서 인간의 질병을 모델로 채택되고있다. 최근의 IPS 세포 질병 모델링 응용 프로그램은 단일 유전자 심장 질환 (즉, 긴 QT 증후군, 카테콜아민 다형성 심실 빈맥)과 심장 결함이 복잡한 표현형 (예 : 레오파드와 티모시 증후군, 확장 성 심근증)의 일부가되는 병리에 대해 수행되었다. 이 보고서는 CM을로 분화되어 환자 특정 만능 줄기 세포가 생체 내에서 질병으로 유사한 표현형과 기능적 특성을 표시 함을 확인 하였다.

그러나,심장 계통에 만능 줄기 세포를 유도 효능을 개선하기 위해 여전히 많은 도전이 있습니다. 골재 형성을 통해 인간 줄이고 ESCs에서 CMS를 자연 발생은 배아 체는 (사채) 성공 ¹⁷ 입증했다. 이 발견 이후, 많은 다른 방법이 제안되었다. 여러 그룹이 크게 분화 프로토콜의 효율성을 향상하고 (무언극을 참조 C., 외., 기존의 모든 방법 ^3의 종합적인 검토를위한 순환 연구 (2012) 화학적 및 동물 제품 무료 문화 시약쪽으로 이동 한 ).

그럼에도 불구하고, EB 집계에 따라 고전적인 방법은 여전히​​ 가장 일반적으로 기능 연구를 수행하고 질병의 메커니즘을 조사에 대한 고용을 나타냅니다. 제안 프로토콜은 심장 분화 과정을 개선하기 위해 표시되었습니다 혈청 아스 코르 빈산의 존재 사채에 IPS 세포의 집단 문화와 포에 근거sitively 이러한 세포 ^18,19의 성숙에 영향을 미칠. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 방법을 통해 이동하고 환자 특정 IPS-파생 CM을 생성을위한 장치가없는 만능 줄기 세포 라인을 사용하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 인간의 IPS 세포 라인 피더 무료 유지 보수 및과 Passaging

1. 마트 리젤 코팅 접시를 준비합니다. 해동 한 한 시간 얼음에 인간의 ESC 자격을 갖춘 매트릭스의 유리 병 25 ML DMEM-F12 배지에 희석. 얼음에 모든 것을 유지하고 모든 접시와 튜브 사전 냉각되도록 각 35mm 플레이트 (또는 다른 접시를 사용할 경우 면적 당 상응하는 금액)에 1 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 커버.

참고 : Matrigel의 재고 농도 배치에 따라 다릅니다. 희석 지침은 데이터 시트에 표시됩니다.

2. 밤새 얼음 접시를 유지하고 다음날 얼음 제거합니다. 플레이트는 사용하기 전에 1 주일 냉장고에 보관하실 수 있습니다.
3. mTESR1 완전 배지 (또는 Nutristem 매체의 병을 해동) 아래 표에 따라 H-ESM을 (인간의 ESC 매체)를 준비.

   H- ESM	최종 CONC	500 ML에 대한
   녹아웃 혈청 교체 (KSR)	20 %	100 ML
   GlutaMAX 100X	2 개 mm	5 ML
   MEM 비 필수 아미노산	0.1 mM의	5 ML
   페니실린 - 스트렙토 마이신	100 U / ㎖ - 0.1 MG / ML	5 ML
   2 머 캅토 에탄올	0.1 mM의	900 μL
   B27 보충 - VitaminA없이	1 %	10 ㎖
   N2 보충	1 %	5 ML
   녹아웃 DMEM	-	370 ML

   
   주식 매체는 더 이상 2보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 전체 성장 매체를 준비하려면, 기본 FGF 그냥 befor에 추가됩니다20 NG / ML의 최종 농도에서 전자 먹이.

참고 : 마우스 배아 섬유 아세포 조건으로 H-ESM 전체가 IPS 세포 대신에 mTESR1 또는 Nutristem의 사용할 수 있습니다.

4. 과 Passaging 전에 30 분 ~ 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에있는 코팅 접시를 놓습니다.
5. 세포들은 합류에 도달하지 않은 경우에도 약 5 일마다 계대해야합니다. 식민지 감동 할 수 없습니다.
6. 디스 파제 (dispase) 1 ㎖ (1 ㎎ / ml의 PBS에서 10 MG / ML 주식에서 분해)와 함께 성장 매체를 교체하십시오.
7. 뽑아 유리 파스퇴르 피펫과 지역을 차별화 제거합니다. 제거해야 지역은 식민지의 중앙에 분화구처럼 또는 낭성 구조를 포함하고, 세포가 한 모든 영역 식민지로부터 분리 평평하게 바깥쪽으로 마이그레이션 될 것으로 보인다.
8. 식민지 테두리가 밝게되고 (보통 5-7 분 정도) 분리 시작할 때까지 문화 후드 아래 37 ° C에서 알을 품다. DiscarD 디스 파제 (dispase). 1 ML H-ESM, 세척 버린다.
9. 1 ML H-ESM에서 수확 식민지 세포 기중기 (스크레이퍼 주걱 등)를 사용하고 15 ML 에펜 도르프 튜브에 수집합니다. 1 ML H-ESM 헹군 후 튜브에 추가합니다. 4 분 1,000 RCF에서 회전 및 뜨는을 제거합니다.
10. 1 ML 미리 예열 성장 매체 (중 mTESR1 또는 Nutristem)에서 펠렛을 Resuspend. 너무 많은 덩어리를 깨는 방지 - 피펫 아래 적은 6 배속보다. 얼마나 많은 세포가 도금 수 있으며 1:5 2 판에 대한 예를 들어 불필요한 세포를 (보통 1:4 1시 5분 희석) 제거해야 결정, 600 μl를 제거한 다음 1.6 ML 신선한 매체를 추가합니다.
11. 접시에서 Matrigel을 제거합니다. 장소 세포는 접시에 고르게 배포, 드롭 들러. 이 세포는 중심을 향해 이동하게되므로, 지나치게 튜브를 흔들어 마십시오.
12. 판 사이 1 ML 매체 및 분할에 관을 씻으십시오. 각 판의 최종 부피는 1.5 -2 ML해야합니다.
13. 과 Passaging 이후 하루를 제외하고 매일 매체를 변경합니다. 그것은 있지만더 이상 2 ~ 3 일 이상은 능성 또는 분화 가능성에 영향을주지 않고 마지막 구절 경과 한 경우 매체 일상을 변경할 이상이 때때로 한 번씩 이틀 주파수에서 변경 될 수 있습니다.
14. 세포주 동결해야하는 경우, 2 ㎖ 피펫과 장소 1 ML / cryovial을 사용하여 1-2 ML mFreSR 동결 매체 대신에 다시 일시 중지합니다. -80 cryobox에서 개최 튜브 ° C ~ 4 일 액체 질소로 전송.

참고 : IPS 세포의 수동 microdissection을이 입체 현미경 하에서 수행되어야합니다. 그들은 가열 면적에 보관하는 동안 입체 현미경과 통합 체외 수정 (IVF) 워크 스테이션 (예 KSystem에서 IVF 워크 스테이션) 무균 상태에서 세포의 조작을 할 수 있습니다. 이 사용할 수없는 경우, 입체 현미경은 정기적 층류 후드 아래로 이동 할 수 있습니다.

2. 배아 체 집계 및 심장 InductioN

1. 아래의 표에 따라 EBM-20 매체를 준비합니다.

   EBM-20	최종 CONC	500 ML에 대한
   태아 소 혈청 (원산지 남미)	20 %	100 ML
   MEM은 비 필수 아미노산	0.1 mM의	5 ML
   페니실린 - 스트렙토 마이신	100U/ml - 0.1 MG / ML	5 ML
   GlutaMAX 100X	0.1 mM의	5 ML
   2 머 캅토 에탄올	50 ㎛	450 μL
   DMEM/F12	-	385 ML

   
   남미 출신의 FBS의 사용은 분화 효율을 결정하는 중요 : 세라의 다른 유형의 고용에 영향을 미칠 수 있습니다분화 과정. 50 μg / ML의 최종 농도에 완전한 EBM-20, 추가 아스 코르 빈산 (AA)를 준비합니다. 전체 성장 매체는 더 이상보다 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 수확의 IPS 식민지는 (단계 1.6-1.9) 위 설명했다.
3. 2 ML의 피펫 1 ML EBM-20에 부드럽게 resuspend을. 너무 많은 수풀을 파괴 방지 - 입체 현미경 하에서 식민지의 크기를 검사 더 2 배 이상을 피펫하지 않고. 1:1 비율에서 매우 낮은 부착 플레이트에 플레이트 (35mm 요리에 대한 예는 6 잘 플레이트 잘 사용 1). 1 ML EBM-20와 튜브를 세척하고 플레이트에 추가 할 수 있습니다.

참고 : 식민지의 크기는 효율성과 심장 유도 타이밍을 조절, 분화 과정에 영향을 미칩니다. 균일 크기 사채의 집계 분화 동안 관찰 변동성을 줄이기 위해 표시되었습니다.

4. 3 일에 다시 방지하기 위해 현미경을 사용하여 EBM-20 번 변경사채의 제거율. 접시의 가장자리에 가까운 피펫, 그리고 매체를 제거하십시오.
5. 하루에 7 스위치 사채에 0.1 % 젤라틴 이전에 30 분 동안 37 ° C에서 배치로 코팅 접시에. 필요한 경우, 젤라틴은 세포 배양 후드를 제거하고 접시 남아있을 수 있습니다 O / N. 35mm 접시 당 35-40 사채를 추가합니다.
6. 일주일에 두 번 영역 및 변경 EBM-20을 상회을 위해 사채를 확인합니다. 입체 현미경 하에서 그들이 현지화를 촉진하기 위하여 박동 영역이 접시 덮개의 상단에있는 위치를 표시합니다. 계약 지역은 대략 10-20 일 후에 나타납니다.
7. 자연 수축을 가진 지역이 나타납니다 (대신 2 % FBS와 EBM-20과 같이 준비) EBM-2 배지를 전환하고 그들과 같은 제 3의 아래에 설명 격리합니다. 때
8. 치고 치고 지역은 추가 실험을 위해 필요할 때까지 일주일에 두 번 매체 변화에 대한 다른 영역을 확인하기 위해 계속합니다.

참고 : 분화 과정의 효율성에 크게 의존여러 가지 요인, 그 중 가장 중요한이 심장 분화를 유도하는 데 사용되는 특정 세포 라인과 혈청의 배치입니다. 가장 높은 효율을 얻으려면, cardiomyogenic 잠재력과 혈청의 다양한 배치에 대한 테스트 셀 라인.

3. 지역 분리 및 문화를 치고

1. 코트 12 - 웰 플레이트 (4cm ² 영역) 또는 5 ㎍ / cm ² 피브로넥틴과 관심의 플레이트 (12 잘 접시에 잘 당 300 μL 총) 완전히 전체 표면을 커버하기에 충분한 볼륨을 만들기 위해 PBS에 희석. 세포 배양 후드에서 발견 유지하고 건조 할 수 있습니다. 플레이트는 4시에 싸여 저장할 수 있습니다 ° CO / N.
2. 필요에 따라 유리를 사용하여 영역을 치고 제거는 파스퇴르 피펫과 메스를 당겼다. 1 ML의 피펫과 fibronectin의 코팅 플레이트로 전송합니다.
3. 1 ML EBM-2를 추가합니다.
4. 세포가 제거 된 영​​역을 표시하고 매체를 변경하는 접시를 교차. 다른 지역은 B를 시작할 수 있으므로 플레이트는 1 개월로 유지 될 수나중에 먹는.

참고 : 작은 치는 덩어리가 필요한 경우는 작은 조각으로 분해 될 때까지, 실체 현미경 아래에서 몇 시간을 explanted 영역을 피펫. 이 작업은 몇 박동 세포 (동영상 3 참조)의 클러스터가 발생합니다.

5. 분석을위한 준비가 될 때까지 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.

참고 :이 프로토콜에서 얻은의 Cardiomyocytes는 태아와 같은 형태 및 기능적 특성을 가지고, 어른 표현형으로 성숙은 더욱 이러한 세포를 차별화하는 문화에 시간을 증가시켜 얻을 수있다.

4. 한 잔 세포 분리 및 분석

1. 코트 2 챔버 슬라이드 (4cm ² 영역) 또는 전체 문화 표면을 커버하기에 충분한 PBS에 희석 5 ㎍ / cm ² 피브로넥틴과 다른 적절한 지원합니다. 유리 지원을 사용하는 경우, 라미닌 및 피브로넥틴과 코트 (5 ㎍ / cm <> 2에게 각)을 먹다.
2. 제 3의 플레이트에서 파스퇴르 피펫 / 메스 지역을 치고 제거합니다.
3. 1 ML 피펫, 부화 기간 동안 한 번 튜브를 흔들어 500 μL 콜라 II (MG와 CA와 PBS에서 480 U / ㎖) 37 부화 15 분 ° C를 포함하는 15 ML 튜브로 전송 세포를 사용.
4. 200 μL 피펫 아래로 피펫. 어떤 덩어리가 남아있는 경우, 신선한 콜라 II에 전송하고 4.3 단계를 반복합니다.
5. 더 큰 덩어리가 남아 없을 때까지 단계 4.4를 반복합니다.
6. 3 ML EBM-2 (없음 AA)과 콜라를 비활성화합니다. 다른 튜브는 준비가 될 때까지 튜브는 다음 가열 랙의 후드 아래에 남아있을 수 있습니다. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기.
7. 을 Resuspend 펠릿 1 ML 0.25 % 5 분 동안 37 ° C에서 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (1X PBS에 0.​​5 % 주식에서 희석) 등을 배양한다. 같은 초기 샘플에서 digestions의 분수를 결합합니다.
8. 4 ML EBM-2 (없음 AA)와 트립신을 비활성화. 더 t없는 2.5 ML의 주사기에 18G 바늘을 통해 세포를 통과한 7X. 4 분 1,000 RCF에서 원심 분리기.
9. 을 Resuspend 세포 펠렛 당 잘 플레이트 1 ML EBM-2인치 세포는 2-3 일 도금 후 기능적, 형태 학적 분석을 위해 사용될 수있다.

결과

우리의 연구에서 우리는 몇 가지 만능 줄기 세포 라인에서 CM을 생성. 이 라인은 처음 MEF 피더 레이어에서 생성되었지만 바로 정의 매체 (mTESR1 또는 Nutristem 중 하나)을 사용하여 리겔에 배치했다. 다양한 분석은 형태 학적 특성, 만능 세포의 일반적인 마커의 발현 (10 월 4 SSEA4 및 TRA1-60)과 유전체의 안정성 (그림 1)의 유지를 확인하는 데 사용되었다.

심장 계통에 유...

토론

pluripotent 줄기 세포 라인 사이에 낮은 효율과 높은 변동성이기는하지만, CM을에 자발적으로 분화 할 수있는 잠재력이있다. 새로운 유도 방법의 개발은 따라서 프로세스의 효율성을 개선하고 더 많은 정의 된 프로토콜을 향해 이동에 초점을 맞추고있다. 그러나, 이러한 새로운 차별화 방법의 대부분은 정교한 배양 조건, 타이밍 및 시약의 농도의 미세 조정, 고가의 사이토 카인과 성장 인자 치료를 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
			Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
Foetal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercaptoethanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
			Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
			Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon