Поколению прав кардиомиоцитов: Дифференциация Протокол от Ф-свободной человеческой индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

Плюрипотентных стволовых клеток, или эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных), клетки представляют собой ценный источник человеческого дифференцированных клеток, в том числе кардиомиоциты. Здесь мы сосредоточимся на сердечную индукции клеток IPS, показывающий, как использовать их, чтобы получить функциональные человеческие кардиомиоциты через эмбриональные тельца-протоколу.

Аннотация

Для того, чтобы расследовать события вождения развития сердца и определить молекулярные механизмы, приводящие к инфаркту заболеваний у людей, очень важно для создания первого человека функциональные кардиомиоциты (CMS). Использование этих клеток в лекарств и токсикологических исследований также было бы весьма полезным, позволяя новых фармакологических молекул для лечения нарушений сердечного быть подтверждено предварительно клинически на клетки человеческого происхождения. Из возможных источников КМ, индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клетки являются одним из наиболее перспективных, так как они могут быть получены непосредственно из легкодоступных ткани пациента и имеют внутреннюю способность давать начало всем типам клеток тела ^1. Некоторые методы были предложены для дифференциации плюрипотентных клеток в КМ, от классического эмбриональных телец (ЕВ) агрегирование подход к определенным химическим протоколы ^2,3. В этой статье мы предлагаем ЭТ-протоколу и показать, как это метод может быть использована для эффективной генерации функциональных CM-подобные клетки из без фидерного слоя плюрипотентных клеток.

Введение

Исторически сложилось, что исследование генетических и молекулярных механизмов вождения человеческого развития и болезни было основано на поколение генетически модифицированных животных моделях. Тем не менее, многочисленные человеческие фенотипы не могут быть успешно воспроизведена в мышах, в основном из-за биологических различий, существующих между двумя видами. С другой стороны, доступ к ткани человека может быть ограничен и зачастую не обеспечивают достаточное количество материала должно быть получено для углубленных экспериментальных исследований. Области сердечно-сосудистой биологии и страдает от этих ограничений: физиология человеческого сердца значительно отличается от мыши, и значительное количество ткани сердца доступна только посмертные или во время операции на сердце. Поиск оптимального источника для разграничения функциональных человека КМ Таким образом, становится центральной темой в сердечно-сосудистой биологии и много усилий было сделано для решения этой проблемы. Различные типы клетки были предложены, яncluding скелетных миобластами, местные сердечных стволовых клеток, мононуклеарных клеток костного мозга, эндотелиальные предшественники, и мезенхимальных стволовых клеток. Однако данные, полученные с использованием этих клеток не была последовательной ^4.

Вывод человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) первые ⁵ и новаторские открытия индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток Яманака и Thomson ^6,7 позже, видимо, обеспечивает решения: эти клетки обладают способностью расти бесконечно, и потенциал, чтобы дать подняться на все клетки производные трех зародышевых листков, в том числе КМ. Применение плюрипотентных клетках предлагает дополнительные преимущества: были построены на основе аутологичных клеток взрослой, они обладают таким же генома человека или пациента, из которых они получены. Поэтому они позволяют развитие в пробирке моделей, способ исследования человеческих генетических заболеваний и механизмы развития. В силу этой особенности плюрипотентных клеток также может Øvercome проблемы, связанные с иммунным отторжением и этические вопросы ^8. По этим причинам, хотя ЭСК все еще представляют собой золотой стандарт в области биологии стволовых клеток, исследователи по всему миру в настоящее время переход к более клеточной технологии IP-адресов.

плюрипотентных клеток в настоящее время используются для моделирования болезней человека в пробирке при различных условиях, включая врожденные сердечно-сосудистых расстройств ^9,10. В последнее время применение плюрипотентных моделирования заболевании клетки была выполнена для моногенных расстройств сердечного (то есть задолго синдрома QT, катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия) и патологий, в котором пороки сердца являются частью сложного фенотипа (т.е. Leopard и Тимоти синдромов, дилатационная кардиомиопатия). Эти отчеты подтвердили, что пациент-специфические плюрипотентных клеток, которые дифференцируются в КМ экран как фенотипические и функциональные характеристики, как и болезнь в естественных условиях.

Однако существуетпо-прежнему много проблем для повышения эффективности индукции плюрипотентных клеток в сердечной линии. Спонтанное возникновение сервера почтовых ящиков из ЭСК человека через образование агрегатов называют эмбриональные тельца (ЭТ) оказались успешными ^17. После этого открытия, многие другие методы были предложены. Многие группы значительно повысить эффективность дифференциации протокола и перешли к определенным химическим и животных, свободных от произведений культуры реагентов (см. лицедейство, К., и др.., Circulation исследований (2012) для всеобъемлющего обзора всех существующих методов ³ ).

Тем не менее, классический метод, основанный на EB агрегации еще представляет чаще всего используются для выполнения функциональных исследований и исследования механизмов болезни. Предлагаемый протокол основан на агрегацию клеток плюрипотентных в ЭТ и культуры в присутствии сыворотки и аскорбиновая кислота, которая была показана для повышения сердечной процесс дифференциации и роsitively повлиять на созревание этих клеток ^18,19. В этой статье мы рассмотрим эту методику в деталях и покажет, как использовать без фидерного слоя линий плюрипотентных ячейки для создания конкретного пациента полученных ИПС-CMS.

протокол

1. Без фидерного слоя Техническое обслуживание и пассажи клеток человека плюрипотентных Линии

1. Подготовьте Матригель покрытием блюд. Оттепели один флакон человека ESC-квалифицированный матрицы на льду в течение одного часа и разбавить его в 25 мл среды DMEM-F12 среду. Добавить 1 мл до 35 мм каждая пластина (или эквивалентное количество на единицу площади поверхности, если других блюд используются), сохраняя все на льду и обеспечение того, чтобы все плиты и трубы предварительно охлажденные. Накладки с алюминиевой фольгой.

Примечание: Концентрации Матригель акции различаются в зависимости от партии. Разведение инструкции указаны в техническом паспорте.

2. Держите пластины на льду в течение ночи и удалить из льда на следующий день. Плиты можно хранить в холодильнике до одной недели перед использованием.
3. Подготовьте mTESR1 полной среде (или размораживание флаконе средне Nutristem) и H-ESM (человека средних ESC) в соответствии с приведенной ниже таблицей.

   HESM-	Конечная концентрация	За 500 мл
   Нокаут Serum Replacement (КСР)	20%	100 мл
   GlutaMAX 100X	2 мМ	5 мл
   MEM несущественных аминокислот	0,1 мМ	5 мл
   Пенициллин-стрептомицина	100 ед / мл - 0,1 мг / мл	5 мл
   2-меркаптоэтанол	0,1 мМ	900 мкл
   Дополнение B27 - без Vitamina	1%	10 мл
   Дополнение N2	1%	5 мл
   Нокаут DMEM	-	370 мл

   
   Со средним можно хранить при температуре 4 ° С в течение не более 2 недель. Для подготовки полного среднего роста, основной FGF добавляется только ДОэлектронной кормления в конечной концентрации 20 нг / мл.

Примечание: Полное H-ЕСМ обусловлено эмбриональных фибробластов мыши могут быть использованы вместо mTESR1 или Nutristem для плюрипотентных клетках.

4. Поместите планшеты, покрытые в инкубаторе при 37 ° С в течение 30 мин до 2 ч до пассирования.
5. Клетки должны быть пассировать примерно каждые 5 дней, даже если они еще не достигли слияния. Колонии не должны соприкасаться.
6. Заменить питательной среде с 1 мл диспаза (1 мг / мл, растворить с концентрацией 10 мг / мл исходного в PBS).
7. Удалить дифференциации районов с вытащил стеклянные пипетки Пастера. Областей, которые должны быть удалены: кратер типа или кистозный структур в центре колонии, и все области, где клетки стали отделены от колоний и плоскими и, кажется, мигрирующие наружу.
8. Инкубировать при 37 ° С в культуре капот, пока колонии границы не становится ярче и начинают отделяться (обычно около 5-7 мин). DiscarD диспазы. Промыть 1 мл H-ESM и выбросить.
9. В 1 мл H-ESM, использовать мобильный подъемник (шпателем, как скребок) для сбора урожая колоний и собрать в 15 мл трубки Эппендорф. Промыть 1 мл H-ESM и добавить к трубе. Спиновые при 1000 RCF в течение 4 минут и удалить супернатант.
10. Ресуспендируют осадок в 1 мл предварительно нагретой среде роста (или mTESR1 или Nutristem). Не должно быть разрывов комков слишком много - пипетку вверх и вниз менее 6-8x. Определите, сколько клетки должны быть покрытием и удалить ненужные клетки (обычно 1:04 или 1:5 разведение), например, для 2 пластины в 1:05, удалите 600 мкл, затем добавьте 1,6 мл свежей среды.
11. Удалить Матригель из плит. Место клетки по капле, распределяя равномерно на тарелку. Избегайте встряхивания пробки чрезмерно, так как это вызовет клетки двигаться в сторону центра.
12. Вымойте трубка с 1 мл среды и разделите между пластинами. Конечный объем в каждой пластины должна быть 1,5 -2 мл.
13. Изменение средних каждый день, за исключением дня после пассажей. Хотя этоидеальная Для изменения носителя каждый день, это может быть иногда изменена с частотой раз в два дня, если не более 2-3 дней прошло с момента последнего прохода, не затрагивая плюрипотентностью или дифференциацию потенциал.
14. Если клеточной линии должны быть заморожены, вновь приостановить, а не в 1-2 мл среды замораживания mFreSR использованием 2 мл пипетки и место 1 мл / криопробирку. Место флаконов в cryobox при -80 ° С и передачи в жидком азоте в течение 3-4 дней.

Примечание: Руководство микродиссекции плюрипотентных клеток должны быть выполнены под стереомикроскопом. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) рабочей станции (например, ЭКО рабочих станций из KSystem) интегрирован с стереомикроскоп Возможность управления клеток в стерильных условиях в то время как они хранятся на нагретой поверхности. Если это не доступен, стереомикроскопа может быть перемещен при регулярном ламинарном боксе.

2. Эмбриональные тельца агрегации и кардиохирургии InductioN

1. Подготовка EBM-20 среды согласно приведенной ниже таблице.

   EBM-20	Конечная концентрация	За 500 мл
   Фетальной бычьей сывороткой (происхождение Южной Америки)	20%	100 мл
   MEM несущественных аминокислот	0,1 мМ	5 мл
   Пенициллин - стрептомицин	100U/ml - 0,1 мг / мл	5 мл
   GlutaMAX 100X	0,1 мМ	5 мл
   2-меркаптоэтанол	50 мкм	450 мкл
   DMEM/F12	-	385 мл

   
   Использование FBS происхождения Южной Америки имеет решающее значение для определения эффективности дифференциации: занятость других видов сыворотки могут повлиятьпроцесс дифференциации. Чтобы подготовить полный EBM-20, добавить аскорбиновую кислоту (АА) до конечной концентрации 50 мкг / мл. Полная среда роста можно хранить при температуре 4 ° С не более чем на одну неделю.
2. Урожай плюрипотентных колонии, как описано выше (шаги 1.6 до 1.9).
3. Ресуспендируйте аккуратно в 1 мл EBM-20 с 2 мл пипетки. Избежать разрушения сгустков слишком много - в пипетку вверх и вниз, не более 2-3х, проверка размера колоний под стереомикроскопа. Пластины на сверхнизких крепежных пластин в соотношении 1:1 (например, для 35 мм блюдо, используйте 1 лунку 6-луночный планшет). Промойте трубку с 1 мл ДМ-20 и добавить в тарелку.

Примечание: Размер колоний влияет на процесс дифференциации, контроль эффективности и сроков сердечной индукции. Агрегация гомогенного размера ЭТ было показано, снижает изменчивость наблюдается при дифференцировке.

4. На 3 день изменить EBM-20 один раз с помощью микроскопа, чтобы избежать повторногоСнятие ЭТ. Держите пипетку близко к краю пластины и снимите среды.
5. На 7 день переключателя ЭТ на планшетах, покрытых 0,1% желатином и ранее при 37 ° С в течение 30 мин. Если необходимо, желатин может быть удален и тарелки, оставленные под капот культуре клеток O / N. Добавить 35-40 ЭТ в 35 мм блюдо.
6. Проверьте ЭТ за избиение региона и меняться EBM-20 два раза в неделю. Отметьте, где биение участки расположены на верхней части тарелки крышкой, чтобы облегчить их локализации под стереомикроскопа. Договаривающиеся области должны появиться примерно через 10-20 дней.
7. Когда районах с самопроизвольное сокращение появляются, переключитесь средних ДМ-2 (подготовьтесь EBM-20, с 2% FBS вместо этого) и изолировать их, как описано ниже в разделе 3.
8. Продолжайте проверять другие области за избиение и изменить среду два раза в неделю до избиения областей не необходимы для дальнейших экспериментов.

Примечание: Эффективность процесса дифференцировки в значительной степени зависитнескольких факторов, наиболее важным из которых являются конкретные клеточные линии и партию сыворотки используется, чтобы вызвать сердечный дифференциации. Чтобы получить максимальную эффективность, тест клеточных линий для cardiomyogenic потенциал и различных партий сыворотки.

3. Избиение районов Выделение и культивирование

1. Coat 12-луночные планшеты (4 см ²⁾ или пластин интерес с 5 мкг / см ² фибронектин, разведенного в PBS, чтобы достаточный объем, чтобы покрыть всю поверхность полностью (300 мкл общего на лунку в 12-луночных планшетах). Держите обнаружены в клеточных капот культуре и дать высохнуть. Пластины могут быть обернуты и хранили при 4 ° CO / N.
2. Удалить биение область с помощью стеклянной вытащили пипетки Пастера и скальпель, по мере необходимости. Трансфер в фибронектина покрытием пластин с 1 мл пипетки.
3. Добавить 1 мл ДМ-2.
4. Вычеркните пластины для указания области, где клетки удаляли и изменить среду. Плиты можно хранить до 1 месяца, в других областях может начаться Bедят позже.

Примечание: Если меньше избиении сгустки необходимы, пипетка эксплантированной области вверх и вниз несколько раз под стереомикроскоп, пока он не распадается на более мелкие куски. Это приведет к кластеры несколько клеток избиение (см. фильм 3).

5. не изменят средне два раза в неделю, пока готовы для анализа.

Примечание: кардиомиоциты, полученные из этого протокола обладают плода, как морфологические и функциональные характеристики; созревание к взрослым фенотип может быть получен путем увеличения времени в культуре к дальнейшей дифференциации этих клеток.

4. Одноместный Избиение Клетки выделения и анализа

1. Coat 2-камерные слайдов (4 см ²⁾ или других соответствующих опорах с 5 мкг / см ² фибронектина разводили в PBS достаточным, чтобы покрыть всю поверхность культуры. Если стеклянной подложки используется, пальто с ламинин и фибронектин (5 мкг / см <вир> 2 каждый).
2. Удалить биение области с пипетки Пастера / скальпель из пластин из раздела 3.
3. С помощью 1 мл пипетки, передача клетки в 15 мл пробирку, содержащую 500 мкл коллагеназы II (480 ЕД / мл в PBS с Mg и Са) и инкубируют 15 мин при 37 ° С, встряхивая трубка один раз в течение инкубации.
4. Внесите вверх и вниз с 200 мкл пипетки. Если остаются сгустки, трансфер в свежем коллагеназы II и повторите шаг 4.3.
5. Повторите шаг 4,4 до исчезновения крупных комков не осталось.
6. Деактивировать коллагеназы 3 мл ДМ-2 (без AA). Трубка может быть оставил под капотом в горячую стойку, пока другие трубы не готовы. Центрифуга при 1000 RCF в течение 4 мин.
7. Ресуспендируют осадок в 1 мл 0,25% трипсина / EDTA (разбавленный от 0,5% акции в 1X PBS) и инкубировали при 37 ° С в течение 5 мин. Объединение фракций переваривание из того же исходного образца.
8. Деактивировать трипсина с 4 мл ДМ-2 (без AA). Передайте клетки через 18G иглу на шприц 2,5 мл не более тХан 7x. Центрифуга при 1000 RCF в течение 4 мин.
9. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл EBM-2 на лунку и пластины. Клетки могут быть использованы для функционального и морфологического анализа 2-3 дня после посева.

Результаты

В наших исследованиях мы сгенерировали КМ от нескольких линий плюрипотентных ячейки. Эти строки были изначально формируется на слое подачи MEF, но были немедленно помещены на матригеле использованием определенной среде (либо mTESR1 или Nutristem). Различные анализы были использованы для прове...

Обсуждение

Плюрипотентных стволовых клеток есть потенциал, чтобы дифференцировать спонтанно в КМ, хотя и с низкой эффективностью и высокой вариабельности линий. Разработку новых методов индукции сконцентрировала свое внимание на повышении эффективности процесса и движется в сторону более опр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution	Sigma	F0896-2MG	Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin	Sigma	L2020-1MG	Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5%	Sigma	T3924
Collagenase type 2	Worthington	4176	Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America)	Invitrogen	10270-106	Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2 supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27 supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapt–thanol	Invitrogen	31350-010
Gelatin, from porcine skin	Sigma	G1890-100G	Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF	Stemgent from Biological Industries	05-100-1A	Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbic acid	Sigma	A4544-25G	Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes	Becton Dickinson	353001
Cell scraper	Corning Incorporated	3008
12-well plates	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177437
Glass 2-well chamber slides	Thermo Fisher Scientific	177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface	Corning Incorporated	3471
18G needle	Becton Dickinson	304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm	VWR International	612-1702
2.5 ml syringe	Becton Dickinson	300188
Equipments
IVF Workstation	KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope	Nikon