JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

לא ממוקד metabolomics מספק השערת יצירת תמונת מצב של פרופיל מטבולי. פרוטוקול זה יהיה להדגים את המיצוי והניתוח של מטבוליטים מתאי, סרום, או רקמות. מגוון המטבוליטים סקר באמצעות מיצוי שלב נוזלי נוזלי, microflow ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית / רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS) מצמידים את תוכנת ניתוח ההפרש.

Abstract

כאן אנו מציגים זרימת עבודה כדי לנתח את הפרופילים המטבוליים לדגימות ביולוגיות של עניין, כולל; תאים, סרום, או רקמה. המדגם מופרד ראשון לשברים קוטביים ולא קוטבי על ידי מיצוי שלב נוזלי נוזלי, ומטוהר באופן חלקי כדי להקל על ניתוח במורד הזרם. שניהם מימיים (מטבוליטים קוטב) ואורגניים (מטבוליטים שאינם קוטביים) שלבי ההפקה הראשונית מעובדים ליסקרו מגוון רחב של מטבוליטים. מטבוליטים מופרדים על ידי שיטות כרומטוגרפיה נוזליות שונות המבוססות על מאפייני החלוקה שלהם. בשיטה זו, אנו מציגים Ultra-ביצועי microflow (UP) שיטות LC, אך הוא ניתן להרחבה לפרוטוקול תזרים גבוה ולחצים נמוכים יותר. מבוא לספקטרומטר המסה יכול להיות דרך או תנאים אופטימליים כלליים מקור או תרכובת. זיהוי של מגוון רחב של יונים מתבצע במצב סריקה מלא במצב חיובי ושלילי על פני טווח מ '/ z רחב ברזולוציה גבוהה תוך שימוש בבאחרונה גalibrated מכשיר. תווית ללא ניתוח ההפרש מתבצע על פלטפורמות ביואינפורמטיקה. יישומים של גישה זו כוללים הקרנת טבולי מסלול, גילוי סמן ביולוגי, ופיתוח תרופות.

Introduction

בשל התקדמות טכנולוגית האחרונה בתחום HRMS, לא ממוקדים, בmetabolomics השערה שהניבו גישות הפכו גישה אפשרית לניתוח של דגימות מורכבות. 1 ספקטרומטרים המוני המסוגלים להקל על חלק 100,000 רזולוציה נמוכה שגרה למ' (חל"מ) דיוק המוני הפכו נרחב זמין של ספקים מרובים. 2,3 דיוק זו מאפשר מסה סגוליות ואמון במשימה ראשונית של זהות אנליטי, זיהוי תבניות איזוטופי, והזדהות adduct גדולים יותר. 4 בשילוב עם הליך מיצוי הולם ו, תערובות מורכבות עתירי ביצועים LC או UPLC ניתן לנתח עם ייחוד נוסף נובע מנתונים בזמן שמירה. 5 UPLC בעל יעילות רבה יותר ומאפשר chromatographic רגישות רבה יותר, רזולוציה וניתוח בזמן ביצוע כיסוי גדול יותר של 6 metabolome אפשרי. במערכי הנתונים הגדולים כתוצאה מכך יכולים להיות משולבים בכלשל תוכנת ניתוח ההפרש מרובה ולכרות לדפוסים שימושיים או analytes הבודדים של עניין. 7,8,9,10,11 להיטים משוער יכולים להיות מזוהים בתחילה באמצעות שילוב של אלגוריתמים לזיהוי שיא, ניבוי המבוסס על נוסחה כימי מסה מדויקת, תחזית פיצול, ו חיפוש כימי מסד הנתונים. גישה זו מאפשרת לתעדוף של מטרות לזמן רב הזדהות מבנית מלאה או לפיתוח של דילול איזוטופ יציב יותר רגיש ויותר ספציפי תגובת UPLC / הנבחר או מרובה ניטור / MS מחקרים שהשיטות הסטנדרטיות הנוכחיות הזהב לכימות. 12

הטבע שונה של דגימות ביולוגיות הוביל לאופטימיזציה של פרוטוקולי חילוץ לשתן 13, 14 תאים, סרום 15, 16 או רקמה. זה פרוטוקול תכונות עקירות לתאים, סרום, ורקמות. במקרה צורך, הערות והפניות נוספות כבר כלולות עבור modifications של ההליך כדי לטפל בהכללתו של איזוטופים יציבים, או להכללה של מטבוליטים לא יציבים במיוחד.

Protocol

1. הפקת דגימה מתאים

  1. לצלחת 10 ס"מ של תאים: לאסוף 1.5 מ"ל של השעיה תא הגבהה מדיה לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית מסומן מראש 10 מ"ל. לשורות חסיד, צריכים להיות הרים תאים עם גירוד עדין ב1.5 מ"ל של תקשורת כל הזמן על קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה.
    הערה: מרווה של חילוף חומרים תאיים חיונית למטבוליטים מסוימים. לניתוח של מטבוליטים זמן רגישים, כגון מיצוי הליכי מתנול קר צריכים להיחשב. 17
  2. הוסף 6 מ"ל של כלורופורם (CHCl 3) / מתנול (CH 3 OH) (2:1, V / V) לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ"ל המכילים את הדגימות. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות. אחרי שלחצתי, דגימות centrifuged עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב 1935 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד את השלבים לגמרי.
    אופציונלי : כדי להימנע מהשימוש בCHCl 3, עקירות יכולות להתנהל עם dichloromethane (CH 2 Cl 2) 18,12.
  3. השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1.
  4. העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן. תמשיך 2.6.2 לdesalting השלב המימית או להמשיך 4.1 לניתוח ישיר.

2. הפקת מדגם מסרום

  1. העבר את 20 μl של סרום לתוך צינור פלסטיק 2 מ"ל אפנדורף אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף aliquot מתאימה בשלב זה.
  2. הוסף 190 μl של CH 3 OH ומערבולת עבור 10 שניות.
  3. הוסף 380 μl של CHCl 3 ו מערבולת עבור 10 שניות.
  4. הוסף 120 μl של H 2 O כדי לגרום להפרדת פאזות. וורטקס הדגימות עבור 10 שניות ומאפשר לאזן על RT במשך 10דקות.
  5. צנטריפוגה הדגימות ב 8000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי להפריד בין השלבים.
  6. מעבירים את השלב האורגני נמוך יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. המשך 4.1.
  7. העבר מימית העליון מאוחר יותר לתוך צינור פלסטיק נקי 2 מיליליטר אפנדורף. להתאדות המדגם תחת גז חנקן.
  8. Re-להשעות מדגם H בμl 200 2 א ' ריאגנטים חומצה או בסיס (0.1% חומצה אצטית, חומצה פורמית או 0.1% אמוניום הידרוקסיד) עשויים לשמש כדי לחלץ מעדיף מטבוליטים רגישים pH. Sonicate במשך 20 דקות על קרח כדי מחדש להשעות המדגם לחלוטין.
  9. הפעל את עמודות ספין C18 עם CH μl 500 3 OH.
  10. לאזן את עמודת הספין עם שני שוטף של H 2 O μl 500 ולאחר מכן לטעון את המדגם. אם נעשה שימוש בחומרים כימי חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף.
  11. לשטוף עם H 2 O μl 500 לdesalt המדגם. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על הריכוז הזה בכביסהצעדים.
  12. Elute עם שני כרכים של 80% μl 200 CH 3 OH בH 2 O לתוך צינור נקי 2 שכותרתו מראש מיליליטר אפנדורף. שוב, אם נמצאים בשימוש חומרים כימיים חומצה / בסיס לשמור על ריכוז זה בשלבים לשטוף. המשך 4.1.

3. הפקת דגימה מהרקמה

  1. בהתאם לרקמות, השתמש בין 10-100 מ"ג של רקמה קפוא. הוסף כל פיסת הרקמה שלכותרתו מראש צינור Eppendorf שייר נמוך מ"ל 2 עם 1 מ"ל של PBS (1 M, pH 6.8) באמבט קרח אופציונלי:. אם נעשה שימוש בסטנדרטים פנימיים, להוסיף אותו למאגר, לפני הוספה הרקמה.
  2. Homogenize הרקמות בקרח עם מטחנת רקמה חשמלית למשך 30 שניות בכל אפנדורף. בין דגימות, לנקות את מטחנת הרקמה בשני צינורות נפרדים המכילים CH 3 OH ו-H 2 O, בהתאמה.
  3. מעבירים את homogenate הרקמות עם טפטפת פלסטיק לתוך צינור צנטריפוגות זכוכית שכותרתו מראש 10 מ"ל. לאחר ההעברה, יש לשטוף את כל צינור Eppendorf2x עם 1 מ"ל של CH 3 OH ולהוסיף את שוטף לhomogenate הרקמות בצינורות הזכוכית.
  4. הוסף 4 מ"ל של CHCl 3 לכל אחד מצינורות זכוכית 10 מ"ל המכילים homogenate הרקמות ו3 שוטף OH CH. הגדר את הדגימות שבייקרו או רב vortexer במהירות נמוכה למשך 30 דקות.
  5. אחרי שלחצתי, צנטריפוגה דגימות עם הגדרת ההאצה / האטה נמוכה ב1,935 XG במשך 10 דקות כדי להפריד את השלבים אופציונלי לחלוטין:. כדי להימנע משימוש בכלורופורם, עקירות פותחו עם CH 2 Cl 2.
  6. השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, להעביר את השכבה האורגנית (תחתון) לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. המשך 4.1.
  7. השימוש בגבעול ארוך פיפטה פסטר, מעביר את השכבה המימית לצינור חדש שכותרתו מראש 10 מיליליטר זכוכית צנטריפוגות. עבור ל2.6.2 לdesalting או להמשיך ל -4.1.

4. השעיה מחדש וסינון של דוגמאות לUPLC

  1. להתאדות SAMPLes תחת גז חנקן.
  2. לשקם ייבש את דגימות בנפח מתאים של הפתרון מוצא לשיטת UPLC הרצויה (ראה טבלה 1). 50-100 μl הוא בדרך כלל נפח השעיה מחדש רצוי. מערבולת בעדינות ו / או פיפטה המדגם למעלה ולמטה כדי לסייע בהמסת analytes.
  3. להעביר את הדגימה למסנן 0.22 מיקרומטר ניילון צינור ספין במהירות של עד 14,000 XG עד המדגם עבר לחלוטין דרך המסנן (~ 5 דקות). ודא שאין משקעים שנותרו גלוי במדגם.
  4. מעבירים את supernatant המדגם המסונן לתוך בקבוקון UPLC שכותרתו מראש עם הוספה. בקבוקון פקק, לאחר מכן קפיצי בקבוקון כדי להסיר בועות מתחתית בקבוקון המדגם. הנח את הדוגמא בautosampler המקורר (4-5 מעלות צלזיוס).

5. התקנת UPLC

  1. שימוש בתוכנת השליטה לכרומטוגרף נוזלי, ליצור ריצה למדגם האורגני המבוססת על הנחה של התנאים המפורטים ב טבלת 1. לאחר מכן ליצור שיטה לשלב המימית את התנאים המפורטים בטבלה 1 אופציונלי:. אם סט ידוע של analytes היעד הוא של ריבית גבוהה, לייעל את תנאי שימוש בUPLC האנלוגי שכותרתו הכבדה של תרכובות אלה, וליצור באמצעות שיטה בתנאים אלה .
  2. לאפשר UPLC לאזן כראוי. זו צריכה לכלול תחול מלא ממסים לפני הצמדת טור, ובעקבות הוראות היצרן עבור נפח איזון של עמודה חדשה (בדרך כלל 3-5 כרכי עמודות). לשמור על יומן של הפעלה לחצים בחזרה כדי לסייע באבחון בעיות בעתיד.

6. התקנת ספקטרומטר מסות

  1. שימוש בתוכנת השליטה לספקטרומטר מסות ברזולוציה גבוהה, ליצור שיטת מצב חיובית תוך שימוש בתנאים המפורטים בטבלה 2. לאחר מכן שימוש באותם תנאים, ליצור שיטת מצב שלילית אופציונלי:. אם סט ידוע של analytes היעד הוא של int הגבוהerest, מקור לייעל ותנאי שימוש באופטיקה האנלוגי שכותרתו כבדה של תרכובות אלה, וליצור באמצעות שיטה בתנאים אלה.
  2. לנקות ולכייל את המכשיר, להקים תרסיס יציב לספקטרומטר, ולאפשר זמן לפתרון הכיול כדי להפיג במידה מספקת מהמקור ואופטיקה. יציבות קביל של תרסיס צריכה לתת 3-5% RSD בעוצמה מעל 100 לפחות סריקות עם הזרקה של תמיסת כיול באותו קצב הזרימה כשיטת LC בשימוש.
  3. להגדיר רצף עבור כל הדגימות, להגדיר את עוצמת זריקה מתאימה, ולהפעיל ריק לפני המדגם הראשון. אם שריד או מטריצת השפעות בין דגימות חשודות, לרוץ החסר / שטיפה נאותים. דגימות צריכה להיות הגדרה באופן אקראי באמצעות מחולל מספרים אקראיים ומפתח כדי למנוע השפעות אצווה שהוצגו על ידי ניתוח.
    הערה: דגימות בקרת איכות לרבות תקני איזוטופ יציבים או סטנדרטים אנליטיות של מטרות סבירות יכולות להיותיקר מאוד בפתרון הבעיות ומבטיחים תוצאות אמינות, לשחזור, וחוקיות. לשכפל טכני של מדגם רק סטנדרטי ואחריו ריק ממס יכול לשמש לכניסות סטייה של עוצמת אות וזמן שמירה, כמו גם שריד לטווח הריק.
  4. להתחיל רצף ולפקח מעת לעת לבעיות, כולל תנודות בלחץ, או אובדן של עוצמת אות על פני הטווח. אם בעיות חמורות מזוהות, להפסיק את הריצה, וחזור מ -6.2.

7. ניתוח ההפרש

  1. שתי זרימות עבודה מוצגות לפרוטוקול זה. הראשון הוא בנפה 2.0, תוכנה לניתוח ההפרש ללא תווית קניינית נמכרת על ידי תרמו פישר. העבודה השנייה היא באמצעות XCMS באינטרנט, פלטפורמה החופשית באמצעות מכון מחקר Scripps. -11 לפני תחילת ניתוח ההפרש, באופן ידני לבדוק את טיקים או להסתכל chromatograms מסונן לכל תרכובת ידועה במדגם כדי להבטיח שחזור של ריצותוהזרקת יציבות / UPLC / ספריי לאורך כל הדגימות.
  2. נפה
    1. להעביר את קבצי הנתונים הגולמיים. מספקטרומטר המסות על הכונן הקשיח של תחנת העבודה שבו נפה מותקנת. (הערה: נפו את הריצה עם הנתונים המאוחסנים על כונן מחובר לרשת או יציאת USB לא מומלצת כפי שהוא יכול להגביל את המהירות של ניתוח.)
    2. נפה את פתוח, ולהתחיל ניסוי חדש.
    3. לטעון את הקבצים המתאימים למסננת.
    4. הקצאת קבוצות השוואה ובחר בקובץ התייחסות אחת כדי לאפשר למסננת כדי ליצור את הפרמטרים לניתוח.
    5. בצע את ההנחיות ולהתאים את כל פרמטרים לדרישות של כל ניסוי בודד. זה בדרך כלל מומלץ להתחיל עם פרמטרים מחמירים ולאחר מכן לחזור ולשחרר את הפרמטרים כהגדרות נדיבות יותר יכולות להאריך את זמן ניתוח.
    6. טען את רשימת adduct הנכונה למצב חיובי או שלילי בפרמטרים.
  3. XCMS המקוון
    1. המר קבציםלפורמט מקובל לXCMS באינטרנט. במקרה שלנו, אנחנו להמיר לפורמט mzXML. 19
    2. XCMS הפתוח באינטרנט, וליצור עבודה.
    3. העלה שם את מערכי נתונים. רק שני מערכי נתונים (לדוגמה, בקרה לעומת טיפול) ניתן להעלות כXCMS עצמאי מוגבל להשוואות ראש בראש.
    4. בחר את הגדרות רצויות מהרשימה הנפתחת. פרמטרים שאוכלסו כבר זמינים עבור setups מכשור שונה, ויכולים להיות שונה אלה נוספים לצרכי ניסוי. במקרה שלנו, אנו משתמשים בהגדרות HPLC-Orbi2.
    5. שלח ולאשר את העבודה.
  4. ניתוח נתונים
    1. למסננת וXCMS רשימה של מסגרות ותכונות, בהתאמה, תהיה מאוכלסת ברגע הניתוח הוא סיים. להבטיח כי כל שכבות יישור LC פסגות ציון דרך. אם כל אחד מריצות LC המעוות מראה סטייה גדולה בפסגות ציון דרך זה עשוי להצביע על בעיה במדגם.
      אופציונלי: למסננת, אם נעשו שימוש בסטנדרטים פנימיים, אתרקבוצת השיא המקבילה ולנרמל למסגרת שנבחרה. לXCMS on-line, ניתן לעשות נורמליזציה בגיליון אלקטרוני לאחר יצוא.
    2. להתוות את הנתונים על ידי מקדם שונה (CV) בתוך אוכלוסיית מדגם כמו (דגימות בקרה למשל). כל ערכי CV גדולים עשויים להצביע על בעיה בדגימה אחת או יותר. למיין את הרשימה המבוססת על תכונות רצויות (p-value <0.05, שינוי פולד> לדוגמא 1.5, סטיית תקן נמוכה בתוך קבוצה, וכו ').
    3. לבחון כל שיא ביישור מתאים לשיא בכל קבוצות, אינטגרציה שיא, שיא צורת גאוס, עוצמת אות, איזוטופים, והמחאת adduct.
    4. יצוא הנתונים המועדפים לניתוח נוסף או ליצור רשימות המוניות ממוקדות על אישור וניסויי n טרשת נפוצה.

תוצאות

התוצאות שהוצגו מראות נתונים נבחרים מטיפול של 6 שעות של תאי glioblastoma SH-SY5Y עם חומרי ההדברה וrotenone מעכב אני מורכב המיטוכונדריה. לשם קיצור, רק את הנתונים החיוביים במצב האורגני השלב מוצגים. הדגימות עובדו ונותחו כמתואר לעיל (איור 1, טבלת 1, טבלת 2) והועמסו על שתי פלטפורמ?...

Discussion

לא ממוקד metabolomics מציע כלי רב עוצמה לחקירת biotransformations אנדוגניים או xenobiotic, או לכידת פרופיל מטבולי ממדגם של ריבית. הפלט של המאזניים הטכניקה עם הרזולוציה והרגישות של הטכנולוגיה המשמשת להפריד ולנתח את הדגימה, את היכולת להתמודד עם מערכי נתונים הגדולים שנוצרו, ואת היכולת שלי...

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מכירים תמיכה של NIH מענקי P30ES013508 ו5T32GM008076. אנו מודים גם תרמו מדעיים לגישה לנפה 2.0 ובני זוג. יוג'ין Ciccimaro ומארק סנדרס של תרמית מדעית לדיונים מועילים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Phosphate Buffered SalineMediatech21-031-CM
Water (H2O)Fisher ScientificW7-4(optima)
Acetonitrile (CH3CN)Fisher ScientificA996-4(optima)
Methanol (CH3OH)Fisher ScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
Chloroform (CH3Cl)Sigma-Aldrich366927Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)Acros Organics61030-1000To replace chloroform
Diethyl EtherSigma-Aldrich346136To replace chloroform
Formic Acid (FA)Fisher Scientific(optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 ColumnsNest Group IncSS18V
Pasteur PipettesFisher Scientific13-678-200
10 ml Glass Centrifuge TubesKimble Chase73785-10
10 ml Plastic Centrifuge TubesCellTreatCLS-4301-015
LC Vials (glass)Waters60000751CV
LC Inserts (glass)WatersWAT094171
LC Vials (plastic)Waters186002640
0.22 μm FiltersCorning8169nylon
2 ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1Low Retention
Equipment
High Resolution Mass SpectrometerThermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC
SourceMichromThermo Advance Source
Differential Analysis SoftwareThermo ScientificSIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8Sigma-Aldrich542622.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm

References

  1. Pluskal, T., Nakamura, T., Villar-Briones, A., Yanagida, M. Metabolic profiling of the fission yeast S. pombe: quantification of compounds under different temperatures and genetic perturbation. Mol. Biosyst. 6 (1), 182-198 (2010).
  2. Makarov, A., Denisov, E., et al. Performance Evaluation of a Hybrid Linear Ion Trap/Orbitrap Mass Spectrometer. Analytical Chemistry. 78 (7), 2113-2120 (2006).
  3. Timischl, B., Dettmer, K., Kaspar, H., Thieme, M., Oefner, P. J. Development of a quantitative, validated capillary electrophoresis-time of flight-mass spectrometry method with integrated high-confidence analyte identification for metabolomics. Electrophoresis. 29 (10), 2203-2214 (2008).
  4. Katajamaa, M., Oresic, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. J. Chromatogr. A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
  5. Katajamaa, M., Oresic, M. Processing methods for differential analysis of LC/MS profile data. BMC Bioinformatics. 6, 179 (2005).
  6. Wilson, I. D., Nicholson, J. K., et al. High resolution ultra performance liquid chromatography coupled to q-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. Journal of Proteome Research. 4 (2), 591-598 (2005).
  7. Benton, H. P., Wong, D. M., Trauger, S. A., Siuzdak, G. XCMS2: processing tandem mass spectrometry data for metabolite identification and structural characterization. Anal. Chem. 80 (16), 6382-6389 (2008).
  8. Katajamaa, M., Miettinen, J., Oresic, M. MZmine: toolbox for processing and visualization of mass spectrometry based molecular profile data. Bioinformatics. 22 (5), 634-636 (2006).
  9. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11 (1), 395 (2010).
  10. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Analytical Chemistry. 78 (3), 779-787 (2006).
  11. Tautenhahn, R., Patti, G. J., Rinehart, D., Siuzdak, G. XCMS Online: A Web-Based Platform to Process Untargeted Metabolomic Data. Analytical Chemistry. 84 (11), 5035-5039 (2012).
  12. Gelhaus, S. L., Mesaros, A. C., Blair, I. A. Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (57), e3399 (2011).
  13. Want, E. J., Wilson, I. D., et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLCGÇôMS. Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).
  14. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nature Protocols. 6 (8), 1241-1249 (2011).
  15. Dunn, W. B., Broadhurst, D., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  16. Masson, P., Alves, A. C., Ebbels, T. M. D., Nicholson, J. K., Want, E. J. Optimization and evaluation of metabolite extraction protocols for untargeted metabolic profiling of liver samples by UPLC-MS. Analytical Chemistry. 82 (18), 7779-7786 (2010).
  17. Shaham, O., Slate, N. G., et al. A plasma signature of human mitochondrial disease revealed through metabolic profiling of spent media from cultured muscle cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (4), 1571-1575 (2010).
  18. Cequier-Saünchez, E., Rodriüguez, C., Ravelo, A. G., Zaürate, R. Dichloromethane as a Solvent for Lipid Extraction and Assessment of Lipid Classes and Fatty Acids from Samples of Different Natures. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (12), 4297-4303 (2008).
  19. Keller, A., Eng, J., Zhang, N., Li, X. J., Aebersold, R. A uniform proteomics MS/MS analysis platform utilizing open XML file formats. Mol. Syst. Biol. 1, (2005).
  20. Cleveland, W. S., Devlin, S. J. Locally weighted regression - an approach to regression-analysis by local fitting. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 596-610 (1988).
  21. Lange, E., Tautenhahn, R., Neumann, S., Gropl, C. Critical assessment of alignment procedures for LC-MS proteomics and metabolomics measurements. BMC Bioinformatics. 9 (1), 375 (2008).
  22. Tautenhahn, R., Bottcher, C., Neumann, S. Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics. 9 (1), 504 (2008).
  23. Kuhl, C., Tautenhahn, R., Bottcher, C., Larson, T. R., Neumann, S. CAMERA: An Integrated Strategy for Compound Spectra Extraction and Annotation of Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry. 84 (1), 283-289 (2012).
  24. Kanehisa, M., Goto, S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 28 (1), 27-30 (2000).
  25. Smith, C. A., O'Maille, G., et al. METLIN: a metabolite mass spectral database. Ther. Drug Monit. 27 (6), 747-751 (2005).
  26. Wang, Y., Xiao, J., Suzek, T. O., Zhang, J., Wang, J., Bryant, S. H. PubChem: a public information system for analyzing bioactivities of small molecules. Nucleic Acids Res. 37 Web Server, W623-W633 (2009).
  27. Wishart, D. S., Knox, C., et al. HMDB: a knowledgebase for the human metabolome. Nucleic Acids Res. 37 Database, D603-D610 (2009).
  28. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  29. Folch, J. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957).
  30. Avery, M. J. Quantitative characterization of differential ion suppression on liquid chromatography/atmospheric pressure ionization mass spectrometric bioanalytical methods. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (3), 197-201 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

75metabolomicsultraperformanceUPLCHRMS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved