Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Resumo

Irrelevantes metabolômica fornece uma hipótese gerando instantâneo de um perfil metabólico. Este protocolo irá demonstrar a extracção e análise de metabolitos a partir de células, soro ou tecido. Uma gama de metabolitos são pesquisadas utilizando extracção de fase líquido-líquido, cromatografia líquida de microfluxo UltraPerformance /-espectrometria de massa de alta resolução (UPLC-HRMS), acoplado ao software de análise diferencial.

Resumo

Apresentamos aqui um fluxo de trabalho para analisar os perfis metabólicos para amostras biológicas de interesse, incluindo: as células, soro ou tecido. A amostra é primeiro separado em fracções polares e não polares por uma extracção de fase líquido-líquido, e parcialmente purificada para facilitar a análise a jusante. Ambos aquosas (metabolitos polares) e orgânicos fases (metabólitos não-polares) da extracção inicial são processados ​​para pesquisar uma ampla variedade de metabolitos. Os metabolitos são separados por diferentes métodos de cromatografia líquida com base em suas propriedades de partição. Neste método, apresentamos microfluxo ultra eficiência (UP), os métodos de LC, mas o protocolo é adaptar a fluxos mais elevados e pressões mais baixas. Introdução no espectrômetro de massa pode ser, quer através de condições de origem optimizado gerais ou composto. A detecção de uma ampla gama de iões é efectuada em modo de varrimento completo no modo positivo e negativo numa larga gama m / z usando alta resolução num recentemente cinstrumento alibrated. Etiqueta livre de análise diferencial é realizada em plataformas de bioinformática. Aplicações dessa abordagem incluem triagem metabólica caminho, descoberta de biomarcadores e desenvolvimento de medicamentos.

Introdução

Devido aos recentes avanços tecnológicos no campo da HRMS, irrelevantes, hipótese de geração de metabolômica abordagens tornaram-se uma abordagem viável para análise de amostras complexas. ^Uma espectrômetros de massa, capazes de facilitar a resolução de 100.000 rotina baixa parte por milhão (ppm) de precisão em massa tornaram-se amplamente disponível a partir de vários fornecedores. ^2,3 Esta precisão massa permite uma maior especificidade e confiança em um trabalho preliminar de identidade analito, reconhecimento de padrões de isótopos, e identificação aduto. ⁴ Quando acoplado com um procedimento de extracção apropriado e de alto desempenho LC ou UPLC, misturas complexas podem ser analisados ​​com especificidade adicional derivado a partir de dados de tempo de retenção. UPLC ⁵ possui uma maior eficiência cromatográfica e permite uma maior sensibilidade, resolução e análise do tempo fazendo uma maior cobertura do metaboloma possível. ⁶ As grandes conjuntos de dados resultantes pode ser integrado em qualquerde software de análise diferencial múltiplo e minado para os padrões úteis ou analitos de interesse individuais. ^7,8,9,10,11 sucessos putativos podem ser identificados inicialmente usando uma combinação de algoritmos de detecção de pico, a previsão fórmula exata massa base química, a previsão de fragmentação e pesquisa de banco de dados de produtos químicos. Esta abordagem permite a priorização de metas para demorado identificação estrutural completa ou para o desenvolvimento de mais sensível e mais específico de diluição isotópica estável reação UPLC / selecionada ou múltipla monitoramento / MS estudos que são os métodos padrão ouro atual para a quantificação de ^12.

A natureza variável das amostras biológicas tem levado a optimização de protocolos para extracção de urina ^13, as células ^{14, 15 de} soro, ou de tecido ^16. Este protocolo características extracções de células, soro e tecido. Sempre que necessário, comentários e referências adicionais foram incluídas para modificaçãoções do processo para tratar a inclusão de isótopos estáveis, ou pela inclusão de metabolitos especialmente instáveis.

Protocolo

1. Exemplo de Extração de Células

1. Para uma placa de células cm 10: recolha de 1,5 ml de suspensão de células em meio erguido num tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Para as linhas de aderentes, as células devem ser levantadas com raspagem suave em 1,5 ml de meio mantidas em gelo Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicione uma aliquota adequada nesta etapa.
   Comentário: Têmpera do metabolismo celular é crucial para determinados metabolitos. Para análise de metabolitos sensíveis ao tempo, os procedimentos tais como a extracção de metanol frio deve ser considerada. ¹⁷
2. Adicionar 6 ml de clorofórmio _(CHCI3) / metanol (CH ₃ OH) (2:1, v / v) a cada um dos tubos de vidro de 10 ml contendo as amostras. Defina as amostras em um shaker ou multi-vortexer em velocidade baixa por 30 min. Após agitação, as amostras são centrifugadas com uma configuração de baixa aceleração / desaceleração em 1935 xg durante 10 min a 4 ° C para separar completamente as fases.
   Opcional : Para evitar o uso de _CHCI3, a extracção pode ser realizada com diclorometano (CH ₂ Cl ₂₎ ^18,12.
3. Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a camada orgânica (inferior) para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Continue a 4.1.
4. Transferir a fase aquosa superior mais tarde a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Evapora-se a amostra sob atmosfera de azoto. Continue a 2.6.2 para dessalinização fase aquosa ou continuar a 4.1 para a análise direta.

2. Extracção de Amostra de soro

1. Transferir 20 uL de soro para um tubo Eppendorf de 2 ml de plástico Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicione uma aliquota adequada nesta etapa.
2. Adicionar 190 mL de _CH3OH e vortex por 10 segundos.
3. Adicionar 380 mL de _CHCI3 e vortex durante 10 seg.
4. Adicionar 120 mL de H ₂ O para induzir a separação de fases. Agitar as amostras para 10 seg e deixa-se equilibrar à temperatura ambiente durante 10min.
5. Centrifugar as amostras a 8000 xg durante 10 min a 4 ° C para separar as fases.
6. Transferir a fase orgânica inferior a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Continue a 4.1.
7. Transferir a fase aquosa superior mais tarde a um tubo de plástico de 2 ml de Eppendorf limpo. Evapora-se a amostra sob atmosfera de azoto.
8. Re-suspender a amostra em 200 ul _de H2O Ácido ou base de reagentes (0,1% de ácido acético, ácido fórmico ou de hidróxido de amónio a 0,1%) pode ser usado para extrair os metabolitos preferencialmente sensíveis ao pH. Sonicar durante 20 min em gelo para re-suspender a amostra completamente.
9. Activa as colunas de giro C18 com 500 mL _{de CH3OH.}
10. Equilibrar a coluna de spin com duas lavagens de 500 ul de _H2O e, em seguida, carregar a amostra. Se são utilizados reagentes de ácido / base de manter esta concentração nas etapas de lavagem.
11. Lava-se com 500 mL _{de H2O} para dessalinizar a amostra. Novamente, se os reagentes de ácido / base são usados ​​manter esta concentração na lavagempassos.
12. Eluir com dois volumes de 200 ul de 80% CH ₃ OH em ​​H ₂ O em 2 ml de um tubo pré-rotulados Eppendorf limpo. Novamente, se os reagentes de ácido / base são usados ​​manter esta concentração nas etapas de lavagem. Continue a 4.1.

3. Extracção de Amostra de Tecido

1. Dependendo do tecido, usar-se entre 10-100 mg de tecido congelado. Adicionar toda a peça de tecido para um tubo Eppendorf de 2 ml de retenção de grandes quantidades de pré-rotuladas com 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) num banho de gelo Opcional:. Se forem utilizados padrões internos, adicioná-la ao tampão, antes de adicionar o tecido.
2. Homogeneizar o tecido no gelo com um moedor de tecido elétrica por 30 segundos em cada Eppendorf. Entre amostras, limpe o triturador de tecidos em dois tubos separados contendo _CH3OH e _H2O, respectivamente.
3. Transferir o homogenato de tecido com uma pipeta de plástico de 10 ml para um tubo de centrífuga de vidro pré-rotulados. Após a transferência, lavar cada tubo Eppendorf2x com 1 ml de _CH3OH e adicionar as lavagens ao homogeneizado de tecido no interior dos tubos de vidro.
4. Adicionar 4 ml de CHCl ₃ a cada um dos tubos de vidro contendo 10 ml do homogeneizado de tecido e _CH3OH lavagens. Defina as amostras em um shaker ou multi-vortexer em velocidade baixa por 30 min.
5. Após agitação, centrifugação das amostras, com um nível baixo de aceleração / desaceleração em 1935 xg durante 10 min para separar completamente as fases opcionais:. Para evitar a utilização de clorofórmio, extracções foram desenvolvidos com CH ₂ Cl _2.
6. Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a camada orgânica (inferior) para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Continue a 4.1.
7. Utilizando uma haste longa pipeta Pasteur, transferir a fase aquosa para um novo tubo de centrífuga de 10 ml de vidro pré-rotulados. Ir para 2.6.2 para dessalinização ou continuar a 4.1.

4. Re-suspensão e Filtração de amostras para UPLC

1. Evaporar o samples em gás nitrogênio.
2. Reconstituir secou-se as amostras num volume apropriado de solução de partida para o método de UPLC desejada (ver Tabela 1). 50-100 ul é geralmente um volume de ressuspensão desejável. Suavemente vortex e / ou pipeta da amostra cima e para baixo para ajudar na dissolução dos analitos.
3. Transfira a amostra num tubo de um filtro de nylon de 0,22 e de rotação de até 14.000 x g até a amostra ter passado completamente através do filtro (~ 5 minutos). Certifique-se de que não há precipitados visíveis que permanece na amostra.
4. Transferir o sobrenadante da amostra filtrada para um frasco UPLC pré-rotuladas com inserção. Tampão frasco, em seguida, apertar o frasco de forma a remover quaisquer bolhas a partir do fundo do frasco de amostra. Colocar a amostra no auto-amostrador refrigerado (4-5 ° C).

5. Setup UPLC

1. Usando o software de controle para o cromatógrafo líquido, criar uma corrida para a amostra biológica baseado fora das condições previstas no Tabela 1. Em seguida, criar um método para a fase aquosa fora das condições listadas na Tabela 1 Opcional:. Se um conjunto conhecido de analitos alvo são de grande interesse, optimizar as condições de UPLC utilizando o análogo marcado pesada destes compostos, e gerar um método que utiliza estas condições .
2. Permitir que a UPLC equilibrar adequadamente. Isto deve incluir uma iniciação completa de solventes antes de anexar uma coluna, e seguindo as instruções do fabricante para o volume de equilíbrio de uma nova coluna (geralmente 3-5 volumes de coluna). Manter um registro de partida de volta pressões para ajudar a diagnosticar problemas futuros.

6. Setup Espectrômetro de Massa

1. Utilizando o software de controlo para o espectrómetro de massa de alta resolução, criar um método de modo positivo, utilizando as condições listadas na Tabela 2. Em seguida, utilizando as mesmas condições, criar um método opcional de modo negativo:. Se um conjunto conhecido de analitos alvo são de elevada interest, fonte e optimizar as condições de óptica utilizando o análogo marcado pesada destes compostos, e gerar um método que utiliza estas condições.
2. Limpar e calibrar o instrumento, estabelecer uma pulverização estável no espectrómetro, e que haja tempo para que a solução de calibração para dissipar de forma adequada a partir da fonte e óptica. Estabilidade aceitável de pulverização deve dar um 3-5% RSD de intensidade ao longo de pelo menos 100 scans com a injecção da solução de calibração com a mesma taxa de fluxo como a LC método a ser utilizado.
3. Configure a seqüência para todas as amostras, ajustar o volume de injeção adequado, e executar um espaço em branco antes da primeira amostra. Se houver suspeita de reporte ou matriz de efeitos entre amostras, execute blanks / lavagens adequadas. As amostras devem ser configurados de modo randomizado, utilizando um gerador de números aleatórios e uma chave para evitar os efeitos de lote introduzidas pela análise.
   Comentário: amostras de controle de qualidade, incluindo as normas de isótopos estáveis ​​ou padrões analíticos dos prováveis ​​alvos pode serextremamente valioso na solução de problemas e assegurando resultados confiáveis ​​e reprodutíveis, e válido. Uma repetição técnica de um só amostra padrão seguido por um branco de solvente pode ser utilizado para aceder desvio de intensidade do sinal e o tempo de retenção, bem como o arrastamento em ensaio em branco.
4. Comece a seqüência e monitorar periodicamente para problemas, incluindo flutuações de pressão ou perda de intensidade do sinal ao longo do curso. Se forem detectados problemas graves, interromper a corrida, e repita a partir do 6.2.

7. Análise diferencial

1. Dois fluxos de trabalho são apresentados para esse protocolo. A primeira é através PENEIRA 2.0, software de análise diferencial etiqueta livre de propriedade vendido por Thermo Fisher. O segundo fluxo de trabalho é através XCMS online, uma plataforma livre através do Instituto de Pesquisa Scripps. ¹¹ Antes de iniciar a análise diferencial, verificar manualmente as TICs ou olhar cromatogramas filtradas para qualquer composto conhecido na amostra para garantir a reprodutibilidade das corridase injeção / UPLC / spray de estabilidade em todas as amostras.
2. PENEIRA
   1. Transfira os arquivos de dados brutos. Desde o espectrômetro de massa para o disco rígido da estação de trabalho onde PENEIRA está instalado. (Nota: a funcionar PENEIRA com os dados armazenados em uma unidade conectada em rede ou porta USB não é aconselhável, pois pode limitar a velocidade de análise).
   2. Abrir peneira, e começar uma nova experiência.
   3. Carregar os arquivos apropriados em peneira.
   4. Atribuir grupos de comparação e selecione um arquivo único de referência para permitir a peneira para gerar os parâmetros para análise.
   5. Siga as instruções e ajustar os parâmetros de acordo com requisitos de qualquer experiência individual. Muitas vezes, é aconselhável começar com parâmetros rigorosos e, em seguida, voltar e soltar os parâmetros conforme as definições mais generosas podem alongar o tempo de análise.
   6. Carregar a lista de aduto correta para o modo positivo ou negativo nos parâmetros.
3. XCMS online
   1. Converta arquivosem um formato aceitável para XCMS Online. No nosso caso, nós convertemos a mzXML formato ^19.
   2. XCMS abertas online, e criar emprego.
   3. Carregar e nomear conjuntos de dados. Apenas dois conjuntos de dados (por exemplo, controle vs tratamento) podem ser carregados como XCMS stand-alone é limitada a comparações head-to-head.
   4. Selecione as configurações desejadas na lista drop-down. Os parâmetros pré-povoadas estão disponíveis para diferentes configurações de instrumentação, e estes podem ainda ser modificados para as necessidades experimentais. No nosso caso, usamos as configurações de HPLC-Orbi2.
   5. Enviar e confirme trabalho.
4. Análise de Dados
   1. Para peneira e XCMS uma lista de quadros e recursos, respectivamente, será preenchida uma vez que a análise for concluída. Certifique-se de que o alinhamento LC sobrepõe quaisquer picos marco. Se qualquer uma das corridas LC desalinhados mostram grande desvio em picos marco isso pode indicar um problema com a amostra.
      Opcional: Para a peneira, se as normas internas são utilizadas, localizeo grupo pico correspondente e normalizar o quadro selecionado. Para XCMS On-line, a normalização pode ser feito em uma planilha após a exportação.
   2. Plotar os dados por meio do coeficiente de variação (CV) em uma amostra da população, como (por exemplo, amostras de controle). Qualquer grandes valores de CV pode indicar um problema com um ou mais amostras. Classificar a lista com base em características desejadas (por exemplo, valor de p <0,05, Mudança Fold> 1.5, baixo desvio padrão dentro de um grupo, etc).
   3. Examine cada pico para o alinhamento apropriado de pico em todos os grupos, a integração de pico, o pico de forma Gaussian, a intensidade do sinal, isótopos e atribuição aduto.
   4. Exportar dados como desejado para uma análise mais aprofundada ou para gerar listas de massa direcionados para a confirmação e ⁿ experimentos MS.

Resultados

Os resultados apresentados mostram os dados selecionados a partir de um tratamento de 6 horas de células de glioblastoma SH-SY5Y com o pesticida e inibidor do complexo I mitocondrial rotenona. Para resumir, apenas a fase de dados de modo positivo orgânicos é apresentada. As amostras foram processadas e analisadas como descrito acima (Figura 1, Tabela 1, Tabela 2) e carregou-se duas plataformas de análises diferenciais para o marcador livre de quantificação, peneira e XCMS linha. Embora um grande n...

Discussão

Irrelevantes metabolômica oferece uma ferramenta poderosa para investigar biotransformações endógenos ou xenobióticos, ou a captura de um perfil metabólico de uma amostra de interesse. A saída das escalas técnica com a resolução e sensibilidade da tecnologia utilizada para separar e analisar a amostra, a capacidade de lidar com grandes conjuntos de dados gerados, bem como a capacidade para extrair o conjunto de dados para obter informações úteis (por exemplo, a pesquisa de banco de dados de massa e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-031-CM
Water (H2O)	Fisher Scientific	W7-4	(optima)
Acetonitrile (CH3CN)	Fisher Scientific	A996-4	(optima)
Methanol (CH3OH)	Fisher Scientific	A454-4	(optima)
Isopropanol	Fisher Scientific	A464-4	(optima)
Chloroform (CH3Cl)	Sigma-Aldrich	366927	Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)	Acros Organics	61030-1000	To replace chloroform
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136	To replace chloroform
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific		(optima)
NH4OH	Fisher Scientific	A470-250	(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)	Sigma-Aldrich	78314
MicroSpin C18 Columns	Nest Group Inc	SS18V
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-200
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
10 ml Plastic Centrifuge Tubes	CellTreat	CLS-4301-015
LC Vials (glass)	Waters	60000751CV
LC Inserts (glass)	Waters	WAT094171
LC Vials (plastic)	Waters	186002640
0.22 μm Filters	Corning	8169	nylon
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1	Low Retention
			Equipment
High Resolution Mass Spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLC	Waters	nanoACQUITY UPLC
Source	Michrom	Thermo Advance Source
Differential Analysis Software	Thermo Scientific	SIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130	Waters	186003546	1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8	Sigma-Aldrich	54262	2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm