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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Untargeted metabolomics stellt eine Hypothese generieren Momentaufnahme eines metabolischen Profils. Dieses Protokoll wird zeigen, die Extraktion und Analyse von Metaboliten von Zellen, Serum oder Gewebe. Eine Reihe von Metaboliten werden mit flüssigem befragten-Flüssigphasenextraktion, Mikroströmungsfühler UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie / hochauflösende Massenspektrometrie (UPLC-HRMS), gekoppelt mit Differential-Analyse-Software.

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen Workflow, um die metabolische Profile für biologische Proben des Interesses einschließlich analysieren; Zellen, Serum oder Gewebe. Die Probe wird zunächst in polaren und nicht-polaren Fraktionen durch eine Flüssig-Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt und teilweise gereinigt, um stromabwärts Analyse zu erleichtern. Sowohl wässrige (polare Metaboliten) und organischen (nicht-polaren Metaboliten) Phasen der ersten Extraktion verarbeitet werden, um eine breite Palette von Metaboliten zu überblicken. Stoffwechselprodukte werden von verschiedenen Flüssigkeits-Chromatographie-Methoden auf ihre Eigenschaften Partition Basis getrennt. Bei diesem Verfahren stellen wir Mikroströmungsfühler ultra-Leistung (UP) LC-Methoden, aber das Protokoll ist skalierbar, um höhere Ströme und niedrigere Drücke. Einführung in das Massenspektrometer kann entweder durch allgemeine oder Verbindung optimierte Quelle Bedingungen. Erkennung von einem breiten Spektrum von Ionen erfolgt im Full-Scan-Modus in positive und negative Modus durchgeführt über einen breiten m / z-Bereich mit hoher Auflösung auf einem kürzlich calibrated Instrument. Markierungsfreie Differentialanalyse wird auf Bioinformatik-Plattformen durchgeführt. Anwendungen dieses Ansatzes umfassen Stoffwechselweg Screening zur Entdeckung von Biomarkern und Entwicklung von Arzneimitteln.

Einleitung

Aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte auf dem Gebiet der HRMS haben ungezielte, Hypothesen-Generierung metabolomics Ansätze werden eine praktikable Ansatz zur Analyse von komplexen Proben. 1-Massenspektrometer zur Auflösung 100.000 erleichtert Routine niedrigen Teil pro Million (ppm) Massegenauigkeit haben sich weitgehend von verschiedenen Herstellern. 2,3 Diese Masse Genauigkeit ermöglicht eine größere Spezifität und Vertrauen in eine vorläufige Zuordnung der Analyten Identität Isotopen Mustererkennung und Addukt Identifikation. 4 Wenn mit einem geeigneten Extraktionsverfahren und High-Performance-LC oder UPLC, komplexe Mischungen gekoppelt kann mit zusätzlichen Spezifität von Verweilzeit Daten abgeleitet analysiert werden. 5 UPLC besitzt größere chromatographische Effizienz und ermöglicht eine höhere Empfindlichkeit, Auflösung und Analyse Zeit macht eine größere Abdeckung des Metaboloms möglich. 6 Die entstehenden großen Datenmengen können in einem integriert werdenmehrerer Differential-Analyse-Software und abgebaut für brauchbare Muster oder einzelne Analyten von Interesse. 7,8,9,10,11 Putative Treffern zunächst identifiziert werden mit einer Kombination aus Spitze Algorithmen, genaue Masse basierte chemische Formel Vorhersage, Fragmentierung Vorhersage und chemische Datenbank suchen. Dieser Ansatz ermöglicht die Priorisierung von Zielen für zeitaufwändige vollständige strukturelle Identifizierung oder für die Entwicklung von empfindlicher und präziser Isotopenverdünnungsanalyse UPLC / ausgewählte oder multiple reaction monitoring / MS-Studien, dass die derzeitige Goldstandard Methoden zur Quantifizierung sind. 12

Die unterschiedliche Art von biologischen Proben ist die Optimierung der Extraktion Protokolle für Urin 13 Zellen 14, 15 Serum oder Gewebe 16 geführt. Dieses Protokoll bietet Extraktionen für Zellen, Serum und Gewebe. Gegebenenfalls haben Kommentare und weitere Referenzen für Modifikationen einbezogengen des Verfahrens zur Bewältigung Einbeziehung von stabilen Isotopen, oder für die Aufnahme von besonders instabilen Metaboliten.

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Protokoll

1. Beispiel Extraktion aus Zellen

  1. Für eine 10 cm Platte von Zellen: collect 1,5 ml angehoben Zellsuspension in Medien in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Für Anhänger Linien sollten die Zellen mit sanften Schaben in 1,5 ml Medium auf Eis gehalten angehoben werden. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt.
    Kommentar: Abschrecken des Zellstoffwechsels ist entscheidend für bestimmte Metaboliten. Für die Analyse von Zeit-und Kleinschreibung Metaboliten sollten Verfahren wie kalte Methanolextraktion Betracht gezogen werden. 17
  2. 6 ml Chloroform (CHCl 3) / Methanol (CH 3 OH) (2:1, v / v) zu jedem der 10 ml Glasröhrchen mit den Proben. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min. Nach dem Schütteln werden die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert, um die Phasen vollständig zu trennen.
    Wahlfrei : Um zu vermeiden, unter Verwendung von CHCl 3, Extraktionen mit Dichlormethan durchgeführt werden (CH 2 Cl 2) 18,12.
  3. Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1.
  4. Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas. Weiter zu 2.6.2 für wässrige Phase Entsalzung oder weiter auf 4,1 für die direkte Analyse.

2. Beispiel Extraktion aus Serum

  1. Übertragen Sie 20 ul Serum in einem Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie die entsprechende Aliquot bei diesem Schritt.
  2. In 190 ul CH 3 OH und Vortex für 10 Sekunden.
  3. In 380 ul CHCl 3 und Vortex für 10 Sekunden.
  4. In 120 ul H 2 O, um eine Phasentrennung zu induzieren. Vortex die Proben für 10 sec und damit bei RT für 10 äquilibrierenmin.
  5. Zentrifugieren Sie die Proben bei 8000 g für 10 min bei 4 ° C, um die Phasen zu trennen.
  6. Übertragen Sie die untere organische Phase in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Weiter zum 4.1.
  7. Übertragen Sie die obere wässrige später in einen sauberen Kunststoff 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Verdampft die Probe unter Stickstoffgas.
  8. Re-suspend die Probe in 200 ul H 2 O. Säure oder Base Reagenzien (0,1% Essigsäure, Ameisensäure oder 0,1% Ammoniumhydroxid) verwendet werden, um bevorzugt extrahieren pH-empfindliche Metaboliten werden. Ultraschallbad für 20 min auf Eis, um erneut zu suspendieren die Probe vollständig.
  9. Aktivieren Sie die C18-Spin-Säulen mit 500 ul CH 3 OH.
  10. Equilibrieren die Spin-Säule mit zwei Waschungen von 500 ul H 2 O und laden Sie dann die Probe. Wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten.
  11. Waschen mit 500 ul H 2 O, um die Probe zu entsalzen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in der WäscheSchritte.
  12. Eluieren mit zwei Volumen von 200 ul 80% CH 3 OH in H 2 O in ein beschriftetes sauberes 2 ml Eppendorf-Röhrchen. Auch wenn Säure / Base-Reagenzien verwendet werden, halten diese Konzentration in den Waschschritten. Weiter zum 4.1.

3. Beispiel Extraktion aus Gewebe

  1. Je nach Gewebe zwischen 10-100 mg von gefrorenem Gewebe verwenden. Fügen Sie das ganze Stück Gewebe zu einer pre-markierten 2 ml low retention Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml PBS (1 M, pH 6,8) in einem Eisbad. Optional: Wenn interne Standards verwendet werden, fügen Sie es in den Puffer, bevor das Gewebe.
  2. Homogenisieren des Gewebes im Eis mit einer elektrischen Schleifmaschine Gewebe für 30 sec in jedem Eppendorf. Zwischen Proben, reinigen das Gewebe Mühle in zwei getrennten Röhren mit CH 3 OH und H 2 O auf.
  3. Übertragen Sie die Gewebehomogenat mit einer Kunststoff-Pipette in ein beschriftetes 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Nach der Übertragung, spülen jedes Eppendorf-Röhrchen2x mit 1 ml CH 3 OH und fügen Sie die Waschungen der Gewebehomogenat in den Glasröhren.
  4. 4 ml CHCl 3 zu jeder der 10 ml-Röhrchen, die das Gewebe-Homogenat und CH 3 OH wäscht. Stellen Sie die Proben in einem Shaker oder Multi-Vortexer bei niedriger Geschwindigkeit für 30 min.
  5. Nach dem Schütteln, zentrifugieren Sie die Proben mit einer geringen Beschleunigung / Verzögerung Einstellung bei 1.935 xg für 10 min vollständig zu trennen die Phasen Optional:. Um zu vermeiden, mit Chloroform, haben Extraktion mit CH 2 Cl 2 entwickelt worden.
  6. Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die organische (untere) Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Weiter zum 4.1.
  7. Mit einem langen Stiel Pasteurpipette übertragen die wässrige Schicht auf eine neue Pre-markierten 10 ml Glaszentrifugenröhrchen. Gehe zu 2.6.2 für Entsalzung oder weiter auf 4,1.

4. Re-Suspension und Filtration von Proben für UPLC

  1. Man dampft das samples unter Stickstoffgas.
  2. Den Inhalt herabgetrocknetes Proben in einem geeigneten Volumen der Ausgangslösung für die gewünschte UPLC Methode (siehe Tabelle 1). 50-100 ul ist in der Regel eine wünschenswerte Resuspension Volumen. Vortexen und / oder einer Pipette die Probe nach oben und unten, um das Lösen der Analyten zu unterstützen.
  3. Übertragen Sie die Probe in einen 0,22 um Nylon-Rohr-Filter und drehen sich mit bis zu 14.000 xg, bis die Probe vollständig durch den Filter (ca. 5 Min.) geleitet. Stellen Sie sicher, dass es keine sichtbare Partikel in der Probe verbleibt.
  4. Den Überstand des gefilterten Probe in ein beschriftetes UPLC Fläschchen mit Einsatz. Cap Fläschchen, dann streichen Sie das Fläschchen, um alle Blasen aus dem Boden der Probe Fläschchen entfernen. Legen Sie die Probe in der gekühlten Autosampler (4-5 ° C).

5. UPLC-Setup

  1. Mit der Steuer-Software für die Flüssigkeitschromatographen, erstellen Sie einen Lauf für die organischen Probe aus der genannten Bedingungen in der Basis Tabelle 1. Dann erstellen Sie eine Methode für die wässrige Phase aus den in Tabelle 1 aufgelistet. Optional: Wenn ein bekannter Satz von Analyten von großem Interesse sind, optimieren die UPLC Bedingungen mit den schweren markiertes Analogon dieser Verbindungen und erzeugen ein Verfahren unter Verwendung dieser Bedingungen .
  2. Lassen Sie die UPLC angemessen auszugleichen. Dies sollte eine vollständige Grundierung von Lösungsmitteln, bevor Sie eine Spalte, und nach den Anweisungen des Herstellers für die Äquilibrierung Volumen von einer neuen Spalte (in der Regel 3-5 Säulenvolumen) umfassen. Pflegen Sie ein Protokoll ab Rückdrücke zur Diagnose zukünftige Probleme.

6. Massenspektrometer-Setup

  1. Mit der Steuersoftware für den hochauflösenden Massenspektrometer, erstellen Sie eine positive Mode-Verfahren unter Verwendung der in Tabelle 2 aufgeführt. Dann unter den gleichen Bedingungen, einen negativen Modus Verfahren Optional:. Wenn ein bekannter Satz von Analyten sind von hoher intERest, zu optimieren und eine Optik, mit der schweren Bedingungen markiertes Analogon dieser Verbindungen enthält, und eine Methode unter Verwendung dieser Bedingungen.
  2. Reinigen und kalibrieren Sie das Gerät, eine stabile Spray in das Spektrometer und genügend Zeit für die Kalibrierung Lösung angemessen von der Quelle und Optik abzuleiten. Akzeptabel Stabilität der Spray sollte eine 3-5% der Intensität über mindestens 100 Scans RSD mit Einspritzung der Kalibrierlösung zur gleichen Durchfluss wie die LC-Methode verwendet wird.
  3. Richten Sie die Sequenz für alle Proben, setzen entsprechende Injektionsvolumen, und führen Sie eine leere vor der ersten Probe. Wenn Verschleppung oder Matrix-Effekte zwischen den Proben vermutet werden, laufen angemessene Rohlinge / Wäschen. Die Proben sollten Einrichtung in einer randomisierten Weise unter Verwendung eines Zufallszahlengenerators und eine Taste, um die Charge durch die Analyse eingeführt Wirkungen zu vermeiden.
    Kommentar: Qualitätskontrolle Proben einschließlich stabiler Isotope Normen oder Analysestandards wahrscheinliche Ziele können seinäußerst wertvoll bei der Fehlersuche und Sicherung zuverlässige, reproduzierbare und valide Ergebnisse. Ein technisches Replikat eines Standard nur Probe durch eine Blindlösung gefolgt kann verwendet werden, um Zugriff auf Abweichung von Signalintensität und Verweildauer sowie Verschleppung in die leere run werden.
  4. Start-Sequenz und überwachen regelmäßig für Probleme wie Druckschwankungen oder Verlust der Signalstärke in der Flucht. Wenn eine schwere Probleme erkannt werden, stoppen den Lauf, und wiederholen von 6,2.

7. Differential Analysis

  1. Zwei Workflows werden für dieses Protokoll vorgestellt. Die erste ist durch SIEVE 2.0, proprietäre markierungsfreie Differential-Analyse-Software von Thermo Fisher verkauft. Der zweite Workflow ist durch XCMS Online, eine kostenlose Plattform durch Scripps Research Institute. 11. Vor Beginn Differentialanalyse, manuell überprüfen die Tics oder schauen gefiltert Chromatogramme für jede bekannte Verbindung in der Probe, um die Reproduzierbarkeit der Läufe zu gewährleistenund Einspritzung / UPLC / Aerosol Stabilität in allen Proben.
  2. SIEVE
    1. Übertragen Sie die. Rohdaten aus dem Massenspektrometer auf die Festplatte der Workstation, SIEVE installiert ist. (Anmerkung: Laufen Sieb mit Daten auf einem vernetzten oder USB-Port angeschlossen Laufwerk gespeichert ist nicht ratsam, da sie die Geschwindigkeit der Analyse können zu begrenzen.)
    2. Offene SIEVE, und beginnen ein neues Experiment.
    3. Legen Sie die entsprechenden Dateien in SIEVE.
    4. Weisen Vergleichsgruppen und wählen Sie eine einzelne Referenz-Datei, damit SIEVE, um die Parameter für die Analyse zu generieren.
    5. Folgen Sie den Anweisungen und stellen Sie alle Parameter pro Anforderungen jedes einzelnen Experiments. Oft ist es ratsam, mit strengen Parametern zu starten und dann gehen Sie zurück und lösen Sie die Parameter als großzügiger Einstellungen Analyse Zeit verlängern kann.
    6. Legen Sie das richtige Addukt Liste für positive oder negative Modus in den Parametern.
  3. XCMS Online
    1. Konvertieren von Dateienin einem akzeptablen Format für XCMS Online. In unserem Fall, wandeln wir mzXML Format. 19
    2. Offene XCMS Online und E-Mail Job.
    3. Upload und nennen Datensätzen. Nur zwei Datensätze (zB Steuerung vs Behandlung) können als Stand-alone-XCMS wird Kopf-an-Kopf-Vergleiche beschränkt hochgeladen werden.
    4. Wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus der Dropdown-Liste. Pre-besiedelte Parameter sind für verschiedene Instrumente Setups zur Verfügung, und diese können weiter für experimentelle Bedürfnisse modifiziert werden. In unserem Fall nutzen wir die HPLC-Orbi2 Einstellungen.
    5. Senden und bestätigen Job.
  4. Data Analysis
    1. Für SIEVE und XCMS eine Liste der Rahmen und Ausstattung, bzw. aufgefüllt wird, sobald die Analyse abgeschlossen sein. Stellen Sie sicher, dass die LC Ausrichtung keine Wahrzeichen Peaks überlagert. Wenn eine der unaligned LC läuft große Abweichung zeigen in Wahrzeichen Gipfel kann dies auf ein Problem mit der Probe.
      Optional: Für SIEVE, wenn interne Standards verwendet werden, findendie entsprechende Peakgruppe und zu normalisieren, um die ausgewählte Fassung. Für XCMS On-line können Normalisierung in einer Tabellenkalkulation nach der Ausfuhr durchgeführt werden.
    2. Zeichnen Sie die Daten, die von der Variationskoeffizient (CV) innerhalb einer Probe wie Bevölkerung (zB Kontrollproben). Alle großen CV-Werte kann auf ein Problem mit einem oder mehreren Probe. Sortieren Sie die Liste auf die gewünschten Eigenschaften (z. B. p-Wert <0,05, Fold Change> 1.5, niedrige Standardabweichung innerhalb einer Gruppe, etc.) basiert.
    3. Untersuchen Sie jeden Peak für Peak entsprechende Ausrichtung über Gruppen, Peak-Integration, Gauß-Peak-Form, Signalintensität, Isotope und Addukt Zuordnung.
    4. Exportieren von Daten als für die weitere Analyse gewünscht oder gezielt Masse Listen zur Bestätigung und MS n Experimente zu generieren.

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Ergebnisse

Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ausgewählte Daten aus einer 6-stündigen Behandlung von SH-SY5Y Glioblastom-Zellen mit dem Pestizid und mitochondrialer Komplex I-Inhibitor Rotenon. Der Kürze halber werden nur die organische Phase positive Mode-Daten dargestellt. Die Proben wurden aufgearbeitet und analysiert, wie oben beschrieben (Abbildung 1, Tabelle 1, Tabelle 2) geladen und auf zwei Differentialanalyse Plattformen für Label-freie Quantifizierung SIEVE und XCMS online. Obwohl eine große Anzahl...

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Diskussion

Untargeted metabolomics bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von endogenen oder xenobiotischen Biotransformationen, oder die Erfassung eines metabolischen Profils aus einer Probe von Interesse. Der Ausgang der Technik skaliert mit der Auflösung und Empfindlichkeit der verwendeten Technologie zu trennen und analysieren die Probe, die Fähigkeit, mit der große Datenmengen erzeugt umzugehen, und die Fähigkeit, um die Datenmenge für nützliche Informationen (zB genaue Masse Datenbanksuche...

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Offenlegungen

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir danken für die Unterstützung der NIH Zuschüsse P30ES013508 und 5T32GM008076. Wir danken auch Thermo Scientific für den Zugang zu SIEVE 2.0 und Drs. Eugene Ciccimaro und Mark Sanders von Thermo Scientific für hilfreiche Diskussionen.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Phosphate Buffered SalineMediatech21-031-CM
Water (H2O)Fisher ScientificW7-4(optima)
Acetonitrile (CH3CN)Fisher ScientificA996-4(optima)
Methanol (CH3OH)Fisher ScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
Chloroform (CH3Cl)Sigma-Aldrich366927Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)Acros Organics61030-1000To replace chloroform
Diethyl EtherSigma-Aldrich346136To replace chloroform
Formic Acid (FA)Fisher Scientific(optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 ColumnsNest Group IncSS18V
Pasteur PipettesFisher Scientific13-678-200
10 ml Glass Centrifuge TubesKimble Chase73785-10
10 ml Plastic Centrifuge TubesCellTreatCLS-4301-015
LC Vials (glass)Waters60000751CV
LC Inserts (glass)WatersWAT094171
LC Vials (plastic)Waters186002640
0.22 μm FiltersCorning8169nylon
2 ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1Low Retention
Equipment
High Resolution Mass SpectrometerThermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC
SourceMichromThermo Advance Source
Differential Analysis SoftwareThermo ScientificSIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8Sigma-Aldrich542622.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm

Referenzen

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