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요약

타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 - 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).

초록

여기에서 우리는 등 그 생물 학적 샘플 신진 대사 프로파일을 분석 할 수있는 워크 플로우를 제시, 세포, 혈청, 또는 조직. 샘플을 먼저 액체 - 액체 상 적출에 의해 극성 및 비극성 분획으로 분리하고, 부분적으로 다운 스트림 분석을 용이하게 정제된다. 초기 추출 수용액 (극성 대사 물질) 및 유기 모두 (비 극성 대사 물질) 단계는 대사의 넓은 범위를 조사하기 위해 처리됩니다. 대사는 자신의 파티션 속성에 따라 다른 액체 크로마토 그래피 방법으로 구분됩니다. 이 방법에서는, 우리는 (UP) LC 방법을 마이크로 초 성과를 제시하지만, 프로토콜은 높은 흐름과 낮은 압력으로 확장됩니다. 질량 분석기에 도입 일반 또는 화합물 최적화 된 소스 조건 중 하나를 할 수 있습니다. 이온의 넓은 범위의 검출은 최근 C에 높은 해상도를 사용하여 광범위한 m / Z 범위에서 긍정적이고 부정적인 모드에서 전체 스캔 모드에서 수행됩니다악기를 alibrated. 레이블 무료 차동 분석은 생물 정보학 플랫폼에서 수행됩니다. 이 방법의 응용 프로그램은 대사 경로 검사, biomarker 발견과 약물 개발이 (가) 있습니다.

서문

HRMS 분야의 최근 기술 발전으로 인해, 타겟이 불분명 한, 가설 생성 대사 접근은 복잡한 시료의 분석 가능한 방법이되고 있습니다. 백만 루틴 낮은 부분을 촉진 100,000 해상도 (PPM)의 질량 정확도 수 1 질량 분석기 널리되고있다 여러 공급 업체에서 제공. 2,3이 질량 정확도는 더 특이 분석의 정체성, 동위 원소 패턴 인식, 내전 식별의 예비 할당에 대한 신뢰하실 수 있습니다. 4 적절한 추출 절차 및 고성능 LC 또는 UPLC, 복잡한 혼합물과 결합 할 때 유지 시간 데이터에서 파생 된 추가 특이성 분석 할 수 있습니다. 5 UPLC 더 큰 크로마토 그래피의 효율성을 소유하고 그 결과 큰 데이터 집합이 어떤에 통합 될 수있는 가능한 대사 체 6.의 큰 범위를 만드는 민감도, 해상도 및 분석 시간을 허용여러 개의 차동 분석 소프트웨어 및 유용한 패턴이나 관심의 개별 분석을 위해 채굴. 7,8,9,10,11 상상 속 히트 곡이 처음 피크 검출 알고리즘의 조합, 정확한 질량 기반의 화학 수식 예측, 조각 예측을 사용하여 식별 할 수있는, 그리고 화학 데이터베이스 검색을. 이 방법은 수 시간이 소요되는 전체 구조 식별을 위해 또는 더 민감하고 더 구체적인 안정 동위 원소 희석 개발을위한 목표 UPLC / 선택 또는 다중 반응 모니터링 / 정량에 대한 현재 금 표준 방법입니다 MS 연구. 12 우선 순위

생물학적 시료의 다양한 자연 뇨 13, 셀 14, 혈청 15, 또는 조직 16 추출 프로토콜 최적화되었다. 이 프로토콜 기능을 추출 세포, 혈청 및 조직합니다. 적절한 경우, 코멘트 및 추가 참조는 수정 여부에 대한 포함되어 있습니다절차 화 : 안정 동위 원소의 포함을 해결하거나, 특히 불안정한 대사 산물 포함 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 세포 시료 전처리

  1. 세포의 10 센티미터 플레이트 : 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 미디어 해제 세포 현탁액의 1.5 ML를 수집합니다. 접착 라인의 경우, 세포는 얼음에 보관 매체의 1.5 ML에 부드러운된다고으로 해제해야합니다 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다.
    코멘트 : 세포 대사의 담금질 특정 대사 산물 중요합니다. 시간에 민감한 대사 산물의 분석을 위해, 같은 차가운 메탄올 추출 등의 절차가 고려되어야한다. 17
  2. 샘플을 포함하는 10 ML 유리 튜브에 각각 6 클로로포름 ML (CHCl 3) / 메탄올 (CH 3 OH) (2:1 V / V)를 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다. 흔들어 후, 샘플은 4에서 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 원심 분리 ° C 완전히 단계를 분리 할 수​​ 있습니다.
    선택 : CHCl 3 사용하지 않으려면, 추출은 (CH 2 망할 CIA 2) 디클로로 메탄으로 수행 할 수있다 18,12.
  3. 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다.
  4. 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발. 액상 탈염을 위해 2.6.2을 계속하거나 직접 분석을 위해 4.1를 계속합니다.

2. 혈청의 샘플 추출

  1. 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 혈청 20 μl를 전송 옵션 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우,이 단계에서 적절한 나누어지는을 추가합니다.
  2. 10 초 동안 CH 3 OH와 소용돌이의 190 μl를 추가합니다.
  3. 10 초 동안 CHCl 3와 소용돌이의 380 μl를 추가합니다.
  4. 상 분리를 유도하기 위해 H 2 O 120 μl를 추가합니다. 소용돌이 10 초 샘플 및 10에 대한 RT에서 평형 수분.
  5. 4시 10 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 분리기 ° C 단계를 구분합니다.
  6. 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 더 낮은 유기 상을 전송합니다. 4.1 계속합니다.
  7. 나중에 깨끗한 플라스틱 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 위 수성을 전송합니다. 질소 가스 하에서 시료를 증발.
  8. 200 μL H 2 O에서 샘플을 다시 일시 중지합니다 산 또는 염기 시약 (0.1 % 아세트산, 포름산 0.1 %의 수산화 암모늄)를 우선적으로 산도에 민감한 대사를 추출하는 데 사용할 수 있습니다. 완전히 샘플을 다시 일시 중단 얼음에 20 분간 초음파 처리.
  9. 500 μL CH 3 OH와 C18 스핀 컬럼을 활성화합니다.
  10. 500 μL H 2 O의 두 세척과 스핀 열 평형 후 샘플을로드합니다. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 세척 단계에서이 농도를 유지한다.
  11. 샘플을 탈염하는 500 μL H 2 O로 씻으십시오. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척이 농도를 유지단계.
  12. 이전 레이블 깨끗한 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 H 2 O 3 OH CH 200 μL 80 %의 두 권으로 용출. 산 / 염기 시약을 사용하는 경우 다시 세척 단계에서이 농도를 유지한다. 4.1 계속합니다.

3. 조직의 샘플 추출

  1. 조직에 따라 냉동 조직의 10-100 밀리그램 사이에 사용합니다. 얼음 목욕 PBS 1 ㎖ (1 M, 산도 6.8)로 미리 표시된 2 ㎖ 낮은 유지 에펜 도르프 튜브에 조직의 모든 조각을 추가 선택 사항 :. 내부 표준 물질을 사용하는 경우 추가하기 전에, 버퍼에 추가 조직.
  2. 각 에펜 도르프에서 30 초 동안 전기 조직 분쇄기 얼음의 조직을 균질화. 샘플 사이, 각각 CH 3 OH와 H 2 O를 포함하는 두 개의 별도의 튜브에 조직 분쇄기를 청소하십시오.
  3. 미리 표시 10 mL 유리 원심 분리기 튜브에 플라스틱 피펫으로 조직 균질을 전송합니다. 전송 후 각 에펜 도르프 튜브 린스CH 3 OH 1 ㎖로 2 배와 유리 튜브에 조직 균질 액으로 세척을 추가합니다.
  4. 조직 균질 및 CH 3 OH 세척을 포함하는 10 ML 유리 튜브의 각 CHCl 3 4 ML을 추가합니다. 30 분 동안 저속에 쉐이커 또는 다중 vortexer에 샘플을 설정합니다.
  5. 진동 후 완전히 단계를 구분하는 10 분 동안 1,935 XG에서 낮은 가속 / 감속 설정으로 샘플을 원심 분리기 선택 :. 클로로포름을 사용하지 않으려면, 추출은 CH 2 망할 CIA 2 개발되었습니다.
  6. 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 유기 (아래) 레이어를 전송할 수 있습니다. 4.1 계속합니다.
  7. 긴 줄기 파스퇴르 피펫 사용하여 새 사전 표시 10 ㎖ 유리 원심 분리기 튜브에 수성 레이어를 전송합니다. 탈염을 위해 2.6.2로 이동하거나 4.1로 진행합니다.

4. 재 서스펜션과 UPLC에 대한 샘플의 여과

  1. SAMP을 증발질소 가스 하에서 레.
  2. 재구성하여 원하는 UPLC 방법 (표 1 참조) 시작 솔루션의 적절한 볼륨 샘플을 건조. 50-100 μL 일반적으로 바람직한 재 서스펜션 볼륨입니다. 부드럽게 소용돌이 및 / 또는 분석을 용해에 도움 아래 샘플을 피펫.
  3. 시료가 완전히 필터 (~ 5 분)를 통과 한 때까지 14,000 XG에에서 0.22 μm의 나일론 튜브 필터와 스핀에 샘플을 전송합니다. 샘플에 남아있는 침전물 눈에 보이는이 없는지 확인하십시오.
  4. 인서트 미리 표시 UPLC 유리 병에 필터링 된 시료의 상등액을 전송합니다. 캡 유리 병은, 다음 샘플 유리 병의 바닥에서 모든 거품을 제거하기 위해 유리 병을 가볍게. 냉장 자동 시료 주입기 (4-5 ° C)에서 샘플을 놓습니다.

5. UPLC 설정

  1. 액체 크로마토 그래프의 제어 소프트웨어를 사용에 나열된 조건을 기반 유기 샘플 실행을 만들 표 1. . 다음 사항 표 1에 나열된 조건 해제 수성 단계에 대한 방법을 만들기 : 대상 분석 알려진 일련의 높은 관심이 있다면,이 화합물의 무거운 표시된 아날로그를 사용하여 UPLC 조건을 최적화하며, 이러한 조건을 사용하여 메서드를 생성 .
  2. UPLC 적절하게 평형을 허용합니다. 이 열을 연결하고 새 열 (보통 3-5 열 볼륨)의 평형 볼륨에 대한 제조 업체의 지침을 수행하기 전에 용매의 전체 프라이밍를 포함해야합니다. 미래의 문제를 진단하는 데 도움이되는 압력을 다시 시작 로그를 유지합니다.

6. 질량 분광계 설정

  1. 고해상도 질량 분석기의 제어 소프트웨어를 사용하여 표 2에 나열된 조건을 사용하여 긍정적 인 모드 메서드를 만듭니다. 그런 다음 같은 조건을 사용하여 음의 모드 메서드를 만듭니다 사항 :. 대상 분석 물질의 알려진 세트는 높은 INT의 경우erest 최적화 소스 및 이들 화합물의 무거운 표시된 아날로그를 사용하여 광학 조건 및이 조건을 사용하는 방법을 생성합니다.
  2. 기기를 청소하고 교정, 분광계에 안정적인 스프레이를 수립하고 적절하게 소스 및 광학에서 발산하는 교정 솔루션을위한 시간을 허용합니다. 스프레이 허용 안정성 LC 방법을 사용하는 것과 동일한 유량 보정 용액의 주입 최소 100 스캔을 통해 강도의 RSD ~ 5 %를 주어야한다.
  3. 모든 샘플에 대한 순서를 설정, 적절한 주입 볼륨을 설정하고 첫 번째 샘플 전에 빈을 실행합니다. 샘플 사이 이월 또는 행렬 효과가 의심되는 경우, 적절한 공백 / 세척을 실행합니다. 샘플 분석을 도입하는 일괄 처리 효과를 방지하기 위해 난수 생성기 및 키를 사용하여 무작위 방식으로 설정해야합니다.
    코멘트 : 가능성이 대상의 안정 동위 원소 표준이나 분석 기준 등 품질 관리 샘플이 될 수 있습니다신뢰성, 재현성, 그리고 유효한 결과를 해결하고 보장에서 매우 중요. 용매 빈 다음에 표준 만 샘플의 기술적 복제는 빈 실행에 신호 강도 및 체류 시간의 편차뿐만 아니라 이월에 액세스 할 수 있습니다.
  4. 순서를 시작하고 압력 변동, 또는 실행을 통해 신호 강도의 손실을 포함하여 문제를 주기적으로 모니터링 할 수 있습니다. 심각한 문제가 발견되는 경우, 실행을 중지하고 6.2에서 반복합니다.

7. 차이 분석

  1. 두 워크 플로는이 프로토콜에 대한 안내되게됩니다. 첫 번째는 SIEVE 2.0, 써모 피셔에 의해 판매 독점 레이블 무료 차동 분석 소프트웨어를 통해이다. 두 번째 워크 플로 차이 분석을 시작하기 전에 XCMS 온라인, 스크립스 연구소를 통해 무료 플랫폼을 제공합니다. 11까지이며, 수동 틱을 확인하거나 실행의 재현성을 보장하기 위해 예제의 모든 알려진 화합물 여과 크로마토 그램에서 보면모든 샘플에 걸쳐 주입 / UPLC / 스프레이 안정성.
  2. SIEVE
    1. 질량 분석기에서 SIEVE가 설치된 워크 스테이션의 하드 드라이브에. 원시 데이터 파일을 전송합니다. (참고 : 분석의 속도를 제한 할 수있는 네트워크 또는 USB 포트에 연결된 드라이브에 저장된 데이터 자체를 실행하는 것이 좋습니다되지 않습니다.)
    2. 열기 체, 새로운 실험을 시작합니다.
    3. SIEVE에 해당 파일을로드합니다.
    4. 비교 그룹을 지정하고 SIEVE 분석을위한 변수를 생성 할 수 있도록하는 하나의 참조 파일을 선택합니다.
    5. 프롬프트 및 개별 실험의 요구 사항에 따라 모든 매개 변수를 조정하십시오. 그것은 엄격한 매개 변수와 함께 시작하고 되돌아 가서 더 관대 한 설정은 분석 시간을 길게 수있는 매개 변수를 느슨하게하는 것이 좋습니다.
    6. 매개 변수에서 양 또는 음의 모드에 대한 올바른 부가 생성물 목록을로드합니다.
  3. XCMS 온라인
    1. 파일을 변환온라인 XCMS에 대한 허용 형식으로. 우리의 경우, 우리는 형식을 mzXML로 변환. 19
    2. 오픈 XCMS 온라인 및 작업을 만듭니다.
    3. 업로드 및 데이터 세트 이름을 지정합니다. 두 데이터 집합 (예 : 제어 대 치료) 독립형 XCMS는 헤드 투 헤드 비교로 제한되어 있으므로 업로드 할 수 있습니다.
    4. 드롭 다운 목록에서 원하는 설정을 선택합니다. 미리 채워진 매개 변수를 다른 기기에 설치할 경우에 사용할 수 있으며, 이러한 추가 실험 필요를 수정할 수 있습니다. 우리의 경우, 우리는 HPLC-Orbi2 설정을 사용합니다.
    5. 제출하고 작업을 확인합니다.
  4. 데이터 분석
    1. 분석이 완료되면 SIEVE 및 XCMS에 대한 각각 구조와 기능의 목록이 채워집니다. LC 정렬은 모든 랜드 마크 피크를 겹쳐 있는지 확인합니다. 정렬되지 않은 LC가 실행 중 하나가 랜드 마크 피크에 큰 편차를 표시하는 경우이 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다.
      옵션 : 내부 표준 물질을 사용하는 경우 SIEVE를 들어, 위치해당 피크 그룹과 선택된 프레임에 정상화. 온라인 XCMS를 들어, 정규화 보낸 후 스프레드 시트에서 수행 할 수 있습니다.
    2. 같은 샘플 집단 (예를 들어, 컨트롤 샘플) 내 변동 계수 (CV)에 의해 데이터를 플롯합니다. 어떤 큰 CV 값은 하나 또는 그 이상의 샘플 문제를 나타낼 수 있습니다. 원하는 특성 (예를 들어, P-값 <0.05, 겹 변경> 1.5 그룹 내에서 낮은 표준 편차 등)에 따라 목록을 정렬합니다.
    3. 그룹간에 적절한 피크 정렬, 피크 통합, 가우스 피크 모양, 신호 강도, 동위 원소 및 부가 생성물 할당 각 피크를 검사합니다.
    4. 추가 분석을 위해 원하는 데이터를 내보내거나 확인 및 MS n 개의 실험 대상 물질 목록을 생성 할 수 있습니다.

결과

제시된 결과는 농약과 미토콘드리아 복잡한 I 억제제 로테 논을 가진 SH-SY5Y 아교 모세포종 세포의 6 시간 처리에서 선택된 데이터를 보여줍니다. 간결 만 유기 상 긍정적 인 모드 데이터가 표시됩니다. 샘플을 처리하고 위에서 설명한대로 분석 (그림 1, 표 1, 표 2)와 레이블이없는 정량 SIEVE 및 XCMS 온라인으로 두 개의 차동 분석 플랫폼에 탑재되었다. 조회수 많은 수의 (그림 2, 그?...

토론

타겟이 불분명 한 대사는 내인성 또는 생체이 biotransformations을 조사하거나, 그 샘플의 대사 프로파일을 캡처하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 해상도와 감도, 생성 된 대용량 데이터를 처리 할 수있는 능력을 샘플을 분리하고 분석하는 데 사용되는 기술과 유용한 정보 (예 : 정확한 질량 데이터베이스 검색)에 대한 데이터 집합을 채굴 할 수있는 능력을 가진 기술 저울의 출력. 최근, 이?...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 5T32GM008076의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 SIEVE 2.0 및 박사 부부에 액세스하기 위해 온도 과학을 감사합니다. 유용한 토론 유진 Ciccimaro 및 온도 과학의 마크 샌더스.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
   Reagent
Phosphate Buffered SalineMediatech21-031-CM 
Water (H2O)Fisher ScientificW7-4(optima)
Acetonitrile (CH3CN)Fisher ScientificA996-4(optima)
Methanol (CH3OH)Fisher ScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
Chloroform (CH3Cl)Sigma-Aldrich366927Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)Acros Organics61030-1000To replace chloroform
Diethyl EtherSigma-Aldrich346136To replace chloroform
Formic Acid (FA)Fisher Scientific (optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)Sigma-Aldrich78314 
MicroSpin C18 ColumnsNest Group IncSS18V 
Pasteur PipettesFisher Scientific13-678-200 
10 ml Glass Centrifuge TubesKimble Chase73785-10 
10 ml Plastic Centrifuge TubesCellTreatCLS-4301-015 
LC Vials (glass)Waters60000751CV 
LC Inserts (glass)WatersWAT094171 
LC Vials (plastic)Waters186002640 
0.22 μm FiltersCorning8169nylon
2 ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1Low Retention
   Equipment
High Resolution Mass SpectrometerThermo ScientificLTQ XL-Orbitrap 
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC 
SourceMichromThermo Advance Source 
Differential Analysis SoftwareThermo ScientificSIEVE 2.0 
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8Sigma-Aldrich542622.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm

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