Metabolomics non ciblées de sources biologiques en utilisant UltraPerformance chromatographie liquide haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS)

Résumé

Non ciblée métabolomique fournit une hypothèse générer instantané d'un profil métabolique. Ce protocole démontrera l'extraction et l'analyse des métabolites provenant de cellules, le sérum ou les tissus. Une gamme de métabolites sont interrogés par extraction en phase liquide-liquide, microflow UltraPerformance chromatographie liquide / haute résolution spectrométrie de masse (UPLC-HRMS) couplé à un logiciel d'analyse différentielle.

Résumé

Nous présentons ici un flux de travail pour analyser les profils métaboliques des échantillons biologiques d'intérêt, y compris, les cellules, le sérum ou les tissus. L'échantillon est d'abord séparé en fractions polaires et non polaires par une extraction en phase liquide-liquide, et partiellement purifié pour faciliter l'analyse en aval. Les deux aqueuses (métabolites polaires) et organique phases (métabolites non polaires) de l'extraction initiale sont traitées pour étudier un large éventail de métabolites. Les métabolites sont séparées par différentes méthodes de chromatographie liquide en fonction de leurs propriétés de la partition. Dans cette méthode, nous présentons microflow ultra performant (UP) méthodes LC, mais le protocole est extensible à des débits plus élevés et des pressions plus basses. L'introduction dans le spectromètre de masse peut être soit par des conditions optimisées de source générales ou composé. La détection d'un large éventail d'ions est effectuée en mode balayage complet en mode à la fois positif et négatif sur une large gamme m / z en utilisant haute résolution sur un récemment calibrated instrument. Sans étiquette analyse différentielle est effectuée sur les plates-formes bioinformatique. Les applications de cette approche comprennent le dépistage métabolique de la voie, la découverte de biomarqueurs et le développement de médicaments.

Introduction

Grâce aux progrès technologiques récents dans le domaine de la gestion des ressources humaines, non ciblées, génératrice d'hypothèses métabolomique approches sont devenus une approche réalisable à l'analyse d'échantillons complexes. ¹ spectromètres de masse capables de 100.000 résolution facilitant routine faible partie par million (ppm) Précision de masse sont devenus largement disponibles auprès de plusieurs fournisseurs. ^2,3 Cette précision de masse permet une plus grande spécificité et la confiance dans une mission préliminaire de l'identité de l'analyte, reconnaissance de formes isotopiques, et l'identification des produits d'addition. ⁴ Lorsque couplé avec une méthode d'extraction appropriée et, mélanges complexes de haute performance LC ou UPLC peuvent être analysées avec une spécificité supplémentaire tirée des données de temps de rétention. ⁵ UPLC possède une plus grande efficacité chromatographique et permet une plus grande sensibilité, la résolution et l'analyse temps à faire une plus grande couverture du métabolome possible. ⁶ Les grands ensembles de données qui en résultent peuvent être intégrés dans n'importe quelde multiples logiciels d'analyse différentielle et exploitées pour les modèles d'utilité ou d'analytes individuels d'intérêt. ^7,8,9,10,11 coups putatifs peuvent être initialement identifiés à l'aide d'une combinaison d'algorithmes de détection de pointe, précise basée sur la prévision de la formule chimique de masse, la prédiction de la fragmentation et recherche de base de données chimique. Cette approche permet la priorisation des objectifs de temps identification structurelle complète ou pour le développement de dilution des isotopes stables plus sensible et plus spécifique de surveillance UPLC / sélectionné ou multiple réaction / MS études qui sont les méthodes standards actuels de l'or pour la quantification. ¹²

La nature variable des échantillons biologiques a conduit à une optimisation des protocoles d'extraction d'urine ^{13, 14} cellules, le sérum ¹⁵ ou ¹⁶ tissu. Ce protocole caractéristiques extractions de cellules, le sérum et le tissu. Le cas échéant, des commentaires et des références supplémentaires ont été incluses pour moditions de la procédure pour l'inclusion des isotopes stables, ou l'inclusion des métabolites particulièrement instables.

Protocole

1. Extraction de l'échantillon à partir de cellules

1. Pour une plaque de cellules cm 10: recueillir 1,5 ml de suspension cellulaire dans un milieu levé dans un tube à centrifuger de verre pré-marqué 10 ml. Pour les lignes adhérentes, les cellules devraient être levées avec grattant délicatement dans 1,5 ml de milieu conservés dans la glace en option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape.
   Commentaire: Trempe du métabolisme cellulaire est cruciale pour certains métabolites. Pour l'analyse des métabolites sensibles au facteur temps, des procédures telles que l'extraction de méthanol froid devraient être considérés. ¹⁷
2. Ajouter 6 ml de chloroforme (CHCl ₃₎ / méthanol (CH ₃ OH) (2:1, v / v) pour chacun des tubes de verre de 10 ml contenant les échantillons. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min. Après agitation, les échantillons sont centrifugés avec un réglage bas d'accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer complètement les phases.
   Optionnel : Pour éviter d'utiliser _CHCl3, extractions peuvent être menées avec du dichlorométhane (CH ₂ Cl ₂₎ ^18,12.
3. Utilisation d'une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1.
4. Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l'échantillon dans de l'azote gazeux. Continuer à 2.6.2 pour le dessalage de phase aqueuse ou de continuer à 4.1 pour l'analyse directe.

2. Extraction des échantillons de sérum

1. Transférer 20 ul de sérum dans un tube en plastique de 2 ml Eppendorf option:. Si les normes internes sont utilisées, ajouter une aliquote appropriée à cette étape.
2. Ajouter 190 ul de CH ₃ OH et vortex pendant 10 sec.
3. Ajouter 380 ul de CHCl ₃ et vortex pendant 10 sec.
4. Ajouter 120 ul de H ₂ O pour induire une séparation de phase. Vortex les échantillons pendant 10 secondes et laisser s'équilibrer à température ambiante pendant 10min.
5. Centrifuger les échantillons à 8000 g pendant 10 min à 4 ° C pour séparer les phases.
6. Transférer la phase organique inférieure en plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Continuer à 4,1.
7. Transférer la phase aqueuse supérieure plus tard dans un plastique de 2 ml Eppendorf tube propre. Évaporer l'échantillon dans de l'azote gazeux.
8. Re-suspendre l'échantillon dans 200 pi H ₂ O. Acide ou une base réactifs (0,1% d'acide acétique, d'acide formique ou de 0,1% d'hydroxyde d'ammonium), peuvent être utilisés pour extraire préférentiellement métabolites sensibles au pH. Ultrasons pendant 20 min sur la glace pour remettre en suspension l'échantillon complètement.
9. Activez les colonnes de centrifugation C18 avec 500 pi CH ₃ OH.
10. Équilibrer la colonne de spin avec deux lavages de 500 pi H ₂ O puis charger l'échantillon. Si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage.
11. Laver avec 500 pi H ₂ O pour dessaler l'échantillon. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration dans le lavageétapes.
12. Eluer avec deux volumes de 200 pi 80% CH ₃ OH en H ₂ O dans un tube Eppendorf pré-étiquetés propre 2 ml. Là encore, si réactifs acides / bases sont utilisées maintenir cette concentration au cours des étapes de lavage. Continuer à 4,1.

3. Extraction des échantillons de tissus

1. Selon le tissu, utiliser entre 10-100 mg de tissus congelés. Ajouter le morceau entier de tissu à un ml bas tube de pré-étiquetés 2 de rétention Eppendorf avec 1 ml de PBS (1 M, pH 6,8) dans un bain de glace en option:. Si les normes internes sont utilisés, ajoutez-le dans la mémoire tampon, avant d'ajouter le tissu.
2. Homogénéiser le tissu dans la glace avec un broyeur de tissus électrique pendant 30 secondes dans chaque Eppendorf. Entre échantillons, nettoyer le broyeur de tissus à deux tubes séparés contenant CH ₃ OH et H ₂ O, respectivement.
3. Transfert de l'homogénat de tissu avec une pipette en plastique dans un tube de centrifugation de verre pré-marqué 10 ml. Après le transfert, rincer chaque tube Eppendorf2x avec 1 ml de CH ₃ OH et ajouter les lavages à l'homogénat de tissu dans des tubes de verre.
4. Ajouter 4 ml de _CHCl3 à chacun des tubes de verre de 10 ml contenant le broyat de tissus et de CH ₃ OH lavages. Définissez les échantillons dans un shaker ou multi-vortex à basse vitesse pendant 30 min.
5. Après agitation, centrifuger les échantillons avec une faible valeur d'accélération / décélération à 1.935 g pendant 10 min à séparer complètement les phases En option:. Pour éviter d'utiliser le chloroforme, les extractions ont été mis au point avec CH ₂ Cl _2.
6. Utilisation d'une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche organique (inférieure) à une nouvelle pré-marquée tube de centrifugeuse de 10 ml en verre. Continuer à 4,1.
7. En utilisant une tige longue pipette Pasteur, transférer la couche aqueuse à une nouvelle pré-étiquetés tube de centrifugation en verre de 10 ml. Aller à 2.6.2 pour le dessalage ou continuer à 4,1.

4. Re-suspension et la filtration des échantillons pour UPLC

1. Évaporer le samples sous azote gazeux.
2. Reconstituer séché jusqu'à échantillons dans un volume approprié de la solution de départ pour la méthode UPLC désirée (voir tableau 1). 50-100 ul est habituellement un volume re-suspension souhaitable. Doucement vortex et / ou d'une pipette l'échantillon de haut en bas pour aider à dissoudre les analytes.
3. Transférer l'échantillon dans une um filtre du tube de nylon 0,22 et tournent à jusqu'à 14.000 xg jusqu'à ce que l'échantillon ait complètement passé à travers le filtre (~ 5 min). Assurez-vous qu'il n'y a pas visible précipités restant dans l'échantillon.
4. Transférer le surnageant de l'échantillon filtré dans un flacon UPLC pré-marquée avec insert. Flacon de capsule, puis feuilleter le flacon pour éliminer les bulles à partir du fond de la cuvette d'échantillon. Placer l'échantillon dans l'échantillonneur automatique réfrigéré (4-5 ° C).

5. UPLC Setup

1. Utilisation du logiciel de contrôle du chromatographe en phase liquide, de créer une course pour l'échantillon biologique basé au large des conditions énumérées à l' Tableau 1. Ensuite, créez une méthode pour la phase aqueuse hors les conditions énumérées dans le tableau 1 en option:. Si un ensemble connu des analytes cibles sont d'un grand intérêt, d'optimiser les conditions UPLC l'aide de l'analogue marqué lourd de ces composés, et de générer une méthode utilisant ces conditions .
2. Permettre à l'UPLC pour équilibrer adéquatement. Cela devrait inclure un amorçage complet de solvants avant de fixer une colonne, et en suivant les instructions du fabricant pour le volume d'équilibration d'une nouvelle colonne (habituellement 3-5 volumes de colonne). Tenir un registre de départ de retour pressions pour aider à diagnostiquer les problèmes futurs.

6. Configuration du spectromètre de masse

1. Utilisation du logiciel de contrôle du spectromètre de masse à haute résolution, de créer une méthode en mode positif en utilisant les conditions énumérées dans le tableau 2. Ensuite, en utilisant les mêmes conditions, créer une méthode de mode négatif en option:. Si un ensemble connu des analytes cibles sont de haute intEREST, la source et optimiser les conditions de l'optique en utilisant l'analogue marqué lourd de ces composés, et de générer un procédé utilisant ces conditions.
2. Nettoyer et étalonner l'instrument, d'établir un spray stable dans le spectromètre, et laisser le temps à la solution d'étalonnage pour dissiper correctement de la source et de l'optique. Bonne stabilité de pulvérisation doit donner une 3-5% RSD de l'intensité sur au moins 100 balayages par injection d'une solution d'étalonnage à la même vitesse d'écoulement que la méthode LC étant utilisé.
3. Mettre en place la séquence pour tous les échantillons, régler le volume d'injection approprié, et d'exécuter un espace avant le premier échantillon. Si report ou la matrice des effets entre les échantillons sont soupçonnés, exécutez blancs / lave adéquates. Les échantillons doivent être configurés de manière aléatoire à l'aide d'un générateur de nombre aléatoire et une clé pour éviter les effets de lots introduits par l'analyse.
   Commentaire: Les échantillons de contrôle de la qualité, y compris les normes d'isotopes stables ou normes d'analyse de cibles potentielles peuvent êtreextrêmement précieux pour le dépannage et d'assurer des résultats fiables, reproductibles et valides. Une technique répliquée d'un seul échantillon de référence, suivie par un blanc de solvant peut être utilisé pour les accès écart d'intensité du signal et le temps de rétention, ainsi que des reports dans la course vide.
4. Commencez séquence et surveiller périodiquement pour des problèmes tels que la variation de pression ou de perte d'intensité du signal à travers la course. Si de graves problèmes sont détectés, arrêter la course, et recommencez à partir de 6.2.

7. Differential Analysis

1. Deux flux sont présentés pour ce protocole. La première est à travers un tamis 2.0, un logiciel d'analyse différentielle sans étiquette exclusive vendu par Thermo Fisher. Le deuxième flux est par XCMS en ligne, une plate-forme libre par Scripps Research Institute. ¹¹ Avant de commencer l'analyse différentielle, vérifier manuellement les TIC ou regarder chromatogrammes filtrés pour tous les composés connus dans l'échantillon afin d'assurer la reproductibilité des essaiset l'injection / UPLC / spray stabilité dans tous les échantillons.
2. TAMIS
   1. Transférez le fichier. Fichiers de données brutes du spectromètre de masse sur le disque dur du poste de travail où tamis est installé. (Note: en cours d'exécution tamis données stockées sur un disque dur connecté en réseau ou le port USB n'est pas conseillé car il peut limiter la vitesse d'analyse.)
   2. Ouvert crible, et commencer une nouvelle expérience.
   3. Chargez les fichiers appropriés dans tamis.
   4. Affectez des groupes de comparaison et de sélectionner un fichier unique de référence pour permettre tamis pour générer des paramètres à analyser.
   5. Suivez les instructions et régler tous les paramètres selon les exigences de toute expérience individuelle. Il est souvent conseillé de commencer avec des paramètres stricts, puis revenir en arrière et desserrer les paramètres comme paramètres plus généreuses peuvent allonger le temps d'analyse.
   6. Charger la liste de produit d'addition correcte pour le mode positif ou négatif dans les paramètres.
3. XCMS ligne
   1. Convertir des fichiersdans un format acceptable pour XCMS en ligne. Dans notre cas, nous convertissons à mzXML le format ^19.
   2. XCMS ouverts en ligne, et création d'emploi.
   3. Téléchargez et nommer des ensembles de données. Seuls deux ensembles de données (contrôle vs traitement) peuvent être téléchargées comme XCMS autonomes sont limitées à des comparaisons en tête-à-tête.
   4. Sélectionnez les paramètres souhaités dans la liste déroulante. Paramètres pré-remplis sont disponibles pour différentes configurations d'instrumentation, et ceux-ci peuvent encore être modifiés pour répondre aux besoins expérimentaux. Dans notre cas, nous utilisons les paramètres HPLC-Orbi2.
   5. Soumettre et confirmer travail.
4. Analyse des données
   1. Pour passoire et XCMS une liste de cadres et de fonctionnalités, respectivement, sera rempli une fois l'analyse terminée. Assurez-vous que l'alignement LC superpose les pics de repère. Si l'une des séries LC non alignés spectacle à grand écart de sommets emblématiques, cela peut indiquer un problème avec l'échantillon.
      Facultatif: Pour Sieve, si les normes internes sont utilisés, localisezle groupe de pic correspondant à normaliser et à la monture choisie. Pour XCMS On-line, la normalisation peut être effectuée dans un tableur après l'exportation.
   2. Tracer les données par le coefficient de variation (CV) dans un échantillon de population comme (par exemple des échantillons de contrôle). Toutes les grandes valeurs de CV peut indiquer un problème avec un ou plusieurs échantillons. Trier la liste en fonction des caractéristiques souhaitées (par exemple p-value <0,05, facteur de variation> 1,5, faible écart type au sein d'un groupe, etc.)
   3. Examinez chaque pic pour l'alignement approprié de pointe dans tous les groupes, l'intégration de pointe, gaussien forme de pic, intensité du signal, isotopes et l'affectation des produits d'addition.
   4. Exporter des données comme vous le souhaitez pour une analyse ultérieure ou pour générer des listes de masse ciblées pour confirmation et ⁿ expériences de SEP.

Résultats

Les résultats présentés montrent les données sélectionnées à partir d'un traitement de 6 h de cellules de glioblastome SH-SY5Y avec le pesticide et complexe mitochondrial I inhibiteur de la roténone. Par souci de concision, seules les données du mode positifs de phase organique est présenté. Les échantillons ont été traités et analysés comme décrit ci-dessus (figure 1, tableau 1, tableau 2) et chargés sur deux plates-formes d'analyse différentielle pour le label sans quantific...

Discussion

Non ciblée métabolomique offre un outil puissant pour étudier biotransformations endogènes ou xénobiotiques, ou de capturer un profil métabolique d'un échantillon d'intérêt. La sortie de la balance de la technique avec la résolution et la sensibilité de la technologie utilisée pour séparer et analyser l'échantillon, la capacité de faire face aux grands ensembles de données générées, et la possibilité d'exploiter l'ensemble des données des informations utiles (par exemple,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-031-CM
Water (H2O)	Fisher Scientific	W7-4	(optima)
Acetonitrile (CH3CN)	Fisher Scientific	A996-4	(optima)
Methanol (CH3OH)	Fisher Scientific	A454-4	(optima)
Isopropanol	Fisher Scientific	A464-4	(optima)
Chloroform (CH3Cl)	Sigma-Aldrich	366927	Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)	Acros Organics	61030-1000	To replace chloroform
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136	To replace chloroform
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific		(optima)
NH4OH	Fisher Scientific	A470-250	(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)	Sigma-Aldrich	78314
MicroSpin C18 Columns	Nest Group Inc	SS18V
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-200
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
10 ml Plastic Centrifuge Tubes	CellTreat	CLS-4301-015
LC Vials (glass)	Waters	60000751CV
LC Inserts (glass)	Waters	WAT094171
LC Vials (plastic)	Waters	186002640
0.22 μm Filters	Corning	8169	nylon
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1	Low Retention
			Equipment
High Resolution Mass Spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLC	Waters	nanoACQUITY UPLC
Source	Michrom	Thermo Advance Source
Differential Analysis Software	Thermo Scientific	SIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130	Waters	186003546	1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8	Sigma-Aldrich	54262	2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm