Metabolomica non mirati da fonti biologiche Uso UltraPerformance cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alta risoluzione (UPLC-HRMS)

Riepilogo

Non mirati metabolomica fornisce una ipotesi la generazione di un'istantanea di un profilo di metabolico. Questo protocollo dimostrerà la estrazione e l'analisi delle metaboliti provenienti da cellule, siero, o tessuto. Una gamma di metaboliti vengono intervistati usando l'estrazione in fase liquido-liquido, microflusso UltraPerformance liquida cromatografia in fase / ad alta-risoluzione di massa spettrometria di (UPLC-HRMS) accoppiato ad software di analisi differenziale di.

Abstract

Qui vi presentiamo un flusso di lavoro per analizzare i profili metabolici per i campioni biologici di interesse, tra cui: le cellule, siero o tessuto. Il campione viene prima separato in frazioni polari e non polari da una fase di estrazione liquido-liquido, e parzialmente purificato per facilitare l'analisi a valle. Entrambi acquose (metaboliti polari) e biologici (metaboliti non polari) fasi di estrazione iniziale vengono elaborati per rilevare una vasta gamma di metaboliti. Metaboliti sono separati da diversi metodi di cromatografia liquida in base alla loro proprietà di partizione. In questo metodo, vi presentiamo microflow ultra-prestazioni (UP) i metodi LC, ma il protocollo è scalabile per i flussi più elevati e pressioni più basse. Introduzione nello spettrometro di massa può essere attraverso sia le condizioni generali o di composti di origine ottimizzati. Rilevamento di una vasta gamma di ioni viene eseguito in modalità di scansione completa in modalità sia positivi che negativi su un'ampia m / z gamma utilizzando ad alta risoluzione su un recente calibrated strumento. Analisi differenziale senza etichetta viene eseguita su piattaforme bioinformatiche. Le applicazioni di questo approccio includono lo screening metabolico percorso, scoperta di biomarcatori, e lo sviluppo di farmaci.

Introduzione

A causa di recenti progressi tecnologici nel campo della HRMS, non mirati, ipotesi generatrici metabolomica approcci sono diventati un approccio possibile per l'analisi di campioni complessi. ¹ spettrometri di massa in grado di facilitare la risoluzione 100.000 di routine parte bassa per milione (ppm) di accuratezza di massa sono diventati ampiamente disponibile da fornitori diversi. ^2,3 Questa accuratezza di massa consente una maggiore specificità e la fiducia in una assegnazione preliminare di identità dell'analita, pattern recognition isotopica, e l'identificazione addotto. ⁴ Quando accoppiato con una procedura di estrazione appropriato e LC o UPLC, miscele complesse ad alte prestazioni possono essere analizzati con specificità ulteriore derivato da dati di tempo di ritenzione. ⁵ UPLC possiede una maggiore efficienza cromatografica e permette una maggiore sensibilità, risoluzione e analisi in tempo facendo una maggiore copertura del metabolome possibile. ⁶ Le grandi serie di dati risultanti possono essere integrati in qualsiasidi molteplici software di analisi differenziale e estratti di modelli utili o di singoli analiti di interesse. ^7,8,9,10,11 colpi putativi possono essere inizialmente identificati utilizzando una combinazione di algoritmi di rilevamento di picco, massa accurata predizione basata formula chimica, la previsione di frammentazione, e chimico ricerca del database. Questo approccio consente di priorità di obiettivi per il tempo completa identificazione strutturale o per lo sviluppo di diluizione degli isotopi stabili più sensibile e più specifico monitoraggio UPLC / selezionato o multiplo reazione / studi di MS che sono gli attuali metodi standard d'oro per la quantificazione. ¹²

Diversa natura dei campioni biologici ha portato ad ottimizzare protocolli di estrazione per l'urina ^{13, 14} cellule, siero ^15, o il tessuto ^16. Questo protocollo caratteristiche estrazioni per le cellule, siero e tessuto. Se del caso, i commenti ei riferimenti aggiuntivi sono stati inclusi per la modificazione della procedura per tener conto dell'inclusione di isotopi stabili, o per l'inserimento di metaboliti particolarmente instabili.

Protocollo

1. Estrazione del campione da cellule

1. Per un piatto di cm 10 celle: raccogliere 1,5 ml di sospensione cellulare sollevato dai media in un pre-etichettata 10 ml provetta di vetro. Per le linee aderenti, le cellule devono essere sollevati con scraping delicato in 1,5 ml di mezzo di tenuta in ghiaccio. Facoltativo: Se si usano gli standard interni, aggiungere un'aliquota appropriata in questo passaggio.
   Commento: Estinzione del metabolismo cellulare è fondamentale per alcuni metaboliti. Per l'analisi dei metaboliti time-sensitive, devono essere considerati come le procedure di estrazione metanolo freddo. ¹⁷
2. Aggiungere 6 ml di cloroformio (CHCl ₃₎ / metanolo (CH ₃ OH) (2:1, v / v) a ciascuno dei tubi di vetro da 10 ml contenenti i campioni. Impostare i campioni in uno shaker o multi-vortex a bassa velocità per 30 min. Dopo agitazione, i campioni vengono centrifugati con un ambiente a bassa accelerazione / decelerazione a 1935 xg per 10 min a 4 ° C per separare completamente le fasi.
   Opzionale : Per evitare di utilizzare _CHCl3, estrazioni può essere condotta con diclorometano (CH ₂ Cl ₂₎ ^18,12.
3. Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato organico (basso) per un nuovo pre-etichettato 10 ml provetta da centrifuga di vetro. Continuare a 4.1.
4. Trasferire la soluzione acquosa superiore successivamente in una plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Evaporare il campione sotto gas azoto. Continuare a 2.6.2 per la dissalazione fase acquosa o continuare a 4.1 per l'analisi diretta.

2. Estrazione del campione di siero

1. Trasferire 20 ml di siero in una plastica 2 ml provetta Eppendorf. Facoltativo: Se si usano gli standard interni, aggiungere un'aliquota appropriata in questo passaggio.
2. Aggiungere 190 ml di CH ₃ OH e vortex per 10 sec.
3. Aggiungere 380 ml ​​di _CHCl3 e vortex per 10 sec.
4. Aggiungere 120 ml di H ₂ O per indurre la separazione di fase. Vortex i campioni per 10 sec e Lasciare equilibrare a temperatura ambiente per 10min.
5. Centrifugare i campioni a 8.000 xg per 10 min a 4 ° C per separare le fasi.
6. Trasferire la fase organica inferiore in plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Continuare a 4.1.
7. Trasferire la soluzione acquosa superiore successivamente in una plastica pulito 2 ml provetta Eppendorf. Evaporare il campione sotto gas azoto.
8. Risospendere il campione in 200 ml di H ₂ O. Reagenti acido o base (0,1% di acido acetico, acido formico o 0,1% di idrossido di ammonio) possono essere utilizzati per estrarre preferenzialmente pH metaboliti sensibili. Ultrasuoni per 20 min in ghiaccio per risospendere completamente il campione.
9. Attivare le colonne di spin C18 con 500 microlitri CH ₃ OH.
10. Equilibrare la colonna con due lavaggi di 500 microlitri H ₂ O e quindi caricare il campione. Se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nelle fasi di lavaggio.
11. Lavare con 500 ml H ₂ O per desalinizzare l'esempio. Ancora, se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nel lavaggiopassaggi.
12. Eluire con due volumi di 200 ml 80% CH ₃ OH in H ₂ O in un pre-etichettato clean 2 ml provetta Eppendorf. Ancora, se si utilizzano reagenti acido / base mantenere questa concentrazione nelle fasi di lavaggio. Continuare a 4.1.

3. Estrazione del campione di tessuto

1. A seconda del tessuto, utilizzare tra 10-100 mg di tessuto congelato. Aggiungere tutto il pezzo di tessuto di un pre-etichettati 2 ml provetta Eppendorf bassa ritenzione con 1 ml di PBS (1 M, pH 6,8) in un bagno di ghiaccio. Facoltativo: Se si utilizzano standard interni, inserirlo nel buffer, prima di aggiungere il tessuto.
2. Omogeneizzare il tessuto in ghiaccio con una smerigliatrice tessuto elettrico per 30 sec in ogni Eppendorf. Tra i campioni, pulire il macinino tessuto in due provette separate contenenti CH ₃ OH e H ₂ O, rispettivamente.
3. Trasferire il tessuto omogenato con una pipetta di plastica in un pre-etichettata 10 ml provetta di vetro. Dopo il trasferimento, risciacquare ogni provetta Eppendorf2x con 1 ml di CH ₃ OH e aggiungere i lavaggi al tessuto omogenato nei tubi di vetro.
4. Aggiungere 4 ml di _CHCl3 a ciascuno dei tubi di vetro 10 ml contenenti l'omogenato tissutale e CH ₃ OH lavaggi. Impostare i campioni in uno shaker o multi-vortex a bassa velocità per 30 min.
5. Dopo aver agitato, centrifugare i campioni con un livello basso di accelerazione / decelerazione a 1935 xg per 10 minuti a separare completamente le fasi. Facoltativo: Per evitare di utilizzare il cloroformio, estrazioni sono stati sviluppati con CH ₂ Cl _2.
6. Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato organico (basso) per un nuovo pre-etichettato 10 ml provetta da centrifuga di vetro. Continuare a 4.1.
7. Utilizzando un gambo lungo pipetta Pasteur, trasferire lo strato acquoso in un pre-etichettato 10 ml provetta di vetro. Vai a 2.6.2 per la dissalazione o continuare a 4.1.

4. Risospensione e la filtrazione di campioni per UPLC

1. Far evaporare la samples sotto gas azoto.
2. Ricostituire asciugata giù i campioni in un volume appropriato di soluzione di partenza per il metodo UPLC desiderata (vedi Tabella 1). 50-100 microlitri è solitamente un volume risospensione desiderabile. Delicatamente vortice e / o dispensare il campione su e giù per aiutare a sciogliere gli analiti.
3. Trasferire il campione in una provetta 0,22 micron filtro di nylon e centrifuga fino a 14.000 xg finché il campione è completamente passata attraverso il filtro (~ 5 min). Assicurarsi che non ci siano precipitati visibili rimanendo nel campione.
4. Trasferire il surnatante del campione filtrato in una fiala UPLC pre-etichettati con inserto. Fiala Cap, poi scorri il flaconcino per rimuovere eventuali bolle dal fondo della fiala del campione. Mettere il campione nel campionatore automatico refrigerato (4-5 ° C).

5. Setup UPLC

1. Utilizzando il software di controllo per il cromatografo liquido, creare una corsa per il campione biologico in base al largo delle condizioni elencate in Tabella 1. Quindi creare un metodo per la fase acquosa fuori le condizioni elencate nella Tabella 1. Facoltativo: Se una serie nota di analiti sono di grande interesse, ottimizzare le condizioni UPLC utilizzando la pesante analogico etichetta di questi composti, e generare un metodo che utilizza queste condizioni .
2. Lasciare che il UPLC per equilibrare adeguatamente. Ciò dovrebbe includere un adescamento pieno di solventi prima di collegare una colonna, e seguendo le indicazioni del produttore per il volume di equilibrio di una nuova colonna (solitamente 3-5 volumi di colonna). Mantenere un registro di partenza indietro pressioni per diagnosticare eventuali problemi futuri.

6. Setup spettrometro di massa

1. Utilizzando il software di controllo per lo spettrometro di massa ad alta risoluzione, creare un metodo modalità positiva usando le condizioni elencate nella Tabella 2. Poi utilizzando le stesse condizioni, creare un metodo modalità negativa facoltativa:. Se una serie nota di analiti sono di alta interest, ottimizzare le condizioni ottici utilizzando la pesante etichetta analogico di questi composti e fonte, e generare un metodo che utilizza queste condizioni.
2. Pulire e calibrare lo strumento, di stabilire uno spruzzo stabile nello spettrometro, e dare il tempo per la soluzione di calibrazione per dissipare adeguatamente dalla fonte e l'ottica. Stabilità accettabile di spruzzo dovrebbe dare un 3-5% di RSD intensità su almeno 100 scansioni con l'iniezione di soluzione di calibrazione alla stessa portata come utilizzarlo metodo LC.
3. Impostare la sequenza per tutti i campioni, impostare il volume di iniezione del caso, ed eseguire un vuoto prima che il primo campione. Se si sospetta di riporto o di matrice effetti tra i campioni, eseguire spazi / lavaggi adeguati. I campioni devono essere impostati in modo randomizzato utilizzando un generatore di numeri casuali e un tasto per evitare effetti lotti introdotti da analisi.
   Commento: campioni di controllo di qualità, tra cui norme isotopi stabili o norme di analisi dei possibili obiettivi possono essereestremamente prezioso in la risoluzione dei problemi ed assicurando risultati affidabili, riproducibili, e di valido. Una replicato tecnico di una soli campione standard seguito da uno solvente in bianco può essere usato per accessi deviazione del intensità del segnale e tempo di ritenzione, così come carryover porta al run blank.
4. Begin sequenza e monitorare periodicamente per i problemi tra cui fluttuazioni di a pressione, o la perdita di intensità segnale di in tutto il run. Se vengono rilevati problemi di gravi, fermare la corsa, e ripetere dal 6,2.

7. Analisi Differenziale

1. Due flussi di lavoro di vengono presentati per questo protocollo. Il primo è attraverso SIEVE 2.0, proprietarie software di etichetta di-libero analisi di differenziale venduta da Thermo Fisher. Il secondo flusso di lavoro di è attraverso XCMS online, in una piattaforma gratuita attraverso Scripps Research Institute. ¹¹ Prima di intraprendere analisi di differenziale, controllare manualmente gli IAT o di guardare al cromatogrammi filtrati per qualsiasi composto noto nel campione di al fine di garantire riproducibilità di pistee iniezione / UPLC / spruzzo la stabilità in tutta tutti i campioni.
2. SETACCIO
   1. Trasferire i file di dati. Prime provenienti da il spettrometro di massa per il disco rigido della il stazione di lavoro in cui è installato SIEVE. (Nota: in esecuzione SIEVE con i dati memorizzati su un disco collegato in rete o la porta USB non è consigliabile in quanto può limitare la velocità di analisi.)
   2. Aperto SIEVE, e iniziare un nuovo esperimento.
   3. Caricare i file appropriati in SIEVE.
   4. Assegnare gruppi di confronto e selezionare un singolo file di riferimento per consentire SIEVE per generare i parametri di per l'analisi.
   5. Seguire il prompt e regolare eventuali parametri di per ogni requisiti della qualsiasi esperimento individuo. E 'spesso consigliabile di iniziare con i parametri di stringenti e di poi tornare indietro e allentare i parametri come di impostazioni meno generosi possono allungare tempo di analisi.
   6. Caricare l'elenco Addotto corretta per modalità positiva o negativa nei parametri.
3. XCMS in linea
   1. Convertire i filein un formato accettabile per i XCMS on-line. Nel nostro caso, convertiamo a mzXML formato di. ¹⁹
   2. Aperte XCMS online, in e Crea Giobbe.
   3. Upload e assegnare un nome set di dati. Solo due set di dati (ad es di Controllo vs Il trattamento) possono essere caricati come XCMS stand-alone è limitata a i confronti testa-a-head.
   4. Selezionare impostazioni desiderate provenienti da la lista drop-verso il basso. Parametri di Pre-popolate sono disponibili per diversi messe a punto di strumentazione, e questi possono essere ulteriormente modificati per le esigenze di sperimentali. Nel nostro caso, noi usiamo le impostazioni di HPLC-Orbi2.
   5. Submit e confermare di posti di lavoro.
4. Analisi dei dati
   1. Per i SIEVE e di XCMS un elenco di fotogrammi e le caratteristiche, rispettivamente, verrà popolato una volta che la analisi di è finito. Assicurarsi che il allineamento LC si sovrappone a eventuali picchi di punto di riferimento. Se uno qualsiasi dei non allineati tirature LC Far vedere deviazione di grandi dimensioni in picchi di punto di riferimento questo può indicare un problema con il campione.
      Opzionale: Per SIEVE, se sono utilizzati standard interni, individuareil gruppo picco corrispondente e normalizzare al fotogramma selezionato. Per i XCMS On-linea di, la normalizzazione può essere fatto in un foglio di calcolo dopo l'esportazione.
   2. Tracciare i dati by coefficiente di variazione (CV) all'interno di una popolazione campionaria come le (ad es campioni di controllo). Eventuali di grandi dimensioni valori di CV possono indicare un problema con uno o più campione. Ordinare l'elenco in base a caratteristiche desiderate (ad esempio p-value <0.05, Fold Change> 1.5, bassa deviazione standard all'interno di un gruppo, ecc.)
   3. Esaminare ogni picco per l'allineamento appropriata di picco attraverso i gruppi, l'integrazione di picco, gaussiano di picco forma, la intensità del segnale, isotopi, e l'assegnazione addotto di.
   4. Di dati Esportare, se lo desideri per ulteriori analisi o di per generare le liste di massa mirati per la conferma e di di MS ⁿ esperimenti di.

Risultati

I risultati presentati mostrano i dati selezionati provenienti da un trattamento di 6-hr di cellule di glioblastoma SH-SY5Y con il pesticida e la complesso I mitocondriale inibitore di rotenone. Per brevità, solo i i di fase dati in modalità positivi organici è presentato. I campioni sono stati elaborati ed analizzati come descritto sopra (Figura 1, tabella 1, Tabella 2) e di caricate su due piattaforme di analisi differenziali per i etichetta di-gratuitamente quantificazione, SETACCIO e di XCMS on-l...

Discussione

Non mirati metabolomica offre un potente strumento per indagare biotrasformazioni endogeni o xenobiotic, o di catturando un profilo di metabolico da un campione di interesse. L'output di i scale di di tecnica con la risoluzione e la sensibilità del la tecnologia utilizzata per separare e analizzare il campione di, la capacità di affrontare con le grandi serie di dati generate, e la capacità a mine il set di dati per informazioni utili (ad es accurata ricerca in basi dati di massa). Recentemente, questo ?...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
Phosphate Buffered Saline	Mediatech	21-031-CM
Water (H2O)	Fisher Scientific	W7-4	(optima)
Acetonitrile (CH3CN)	Fisher Scientific	A996-4	(optima)
Methanol (CH3OH)	Fisher Scientific	A454-4	(optima)
Isopropanol	Fisher Scientific	A464-4	(optima)
Chloroform (CH3Cl)	Sigma-Aldrich	366927	Hazard
Dichloromethane (CH2Cl2)	Acros Organics	61030-1000	To replace chloroform
Diethyl Ether	Sigma-Aldrich	346136	To replace chloroform
Formic Acid (FA)	Fisher Scientific		(optima)
NH4OH	Fisher Scientific	A470-250	(optima)
Ammonium formate (HCOONH4)	Sigma-Aldrich	78314
MicroSpin C18 Columns	Nest Group Inc	SS18V
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-200
10 ml Glass Centrifuge Tubes	Kimble Chase	73785-10
10 ml Plastic Centrifuge Tubes	CellTreat	CLS-4301-015
LC Vials (glass)	Waters	60000751CV
LC Inserts (glass)	Waters	WAT094171
LC Vials (plastic)	Waters	186002640
0.22 μm Filters	Corning	8169	nylon
2 ml Eppendorf Tubes	BioExpress	C-3229-1	Low Retention
			Equipment
High Resolution Mass Spectrometer	Thermo Scientific	LTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLC	Waters	nanoACQUITY UPLC
Source	Michrom	Thermo Advance Source
Differential Analysis Software	Thermo Scientific	SIEVE 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130	Waters	186003546	1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm
Acentis Express C8	Sigma-Aldrich	54262	2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm