העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

Summary

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.

Abstract

עין דרוזופילה נעשתה שימוש נרחב כמודל למחקרים של התפתחות וניוון עצבי. עם טכניקת רקומבינציה mitotic רבת עוצמה, מסכי גנטיים אלגנטיים המבוססים על ניתוח משובט הובילו לזיהוי של מסלולי איתות מעורבים בפיתוח העין וקולטי אור בידול (PR) בשלבי זחל. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, אשר יכול לשמש לניתוח משובט מהיר בעין של חיים הבוגרים דרוזופילה. תאי קולטי אור פלורסנט הם צילמו עם טכניקת נטרול קרנית, ברשתית עם שיבוטים פסיפס שנוצרו על ידי רקומבינציה בתיווך flipase. לשיטה זו מספר יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית קלאסי של הרשתית: ניתן להשתמש בו להקרנת תפוקה גבוהה והוכיח את השיטה יעילה לזיהוי הגורמים המסדירים הישרדות יחסי ציבור ותפקוד. זה יכול לשמש גם לניתוחים הקינטית של ניוון יחסי ציבור באותו ענים חייםאל פני כמה שבועות, כדי להדגים את הדרישה לגנים ספציפיים להישרדות יחסי ציבור או פונקציה בזבוב הבוגר. שיטה זו היא גם שימושית לטיפול בבעיות אוטונומיה תא במוטנטים התפתחותית, כגון אלה שבהקמתה של קוטביות תא מישוריים מושפעת.

Introduction

רשתית דרוזופילה מורכבת מכ -800 יחידות ommatidial (איור 1 א), אשר מאורגנות בדיוק, עם ציר מוגדר וברור של קוטביות (איור 1). כל יחידה מכילה 20 תאים: שמונה תאי קולטי אור (PRS) ו12 תאי אבזר, כוללים תאים חרוטים, תאי פיגמנט וזיפי תאים ^1,2. שני סוגים של יחסי הציבור נבדלים על בסיס הסוג של רודופסין (Rh) שהם מבטאים. שישה הפורטוריקנים החיצוניים (R1-6) להביע RH1 ומסודרים בתבנית בצורת טרפז (איור 1 ג). במרכז הטרפז, שני הפורטוריקנים הפנימיים (R7/R8) להביע את ארבעה סוגים אפשריים של רודופסין (Rh3, Rh4, Rh5 או Rh6) ומאורגנים כך שR7 שקרים על גבי R8 ^3.

יותר מ 2,500 גנים מעורבים בהמורפוגנזה של העין דרוזופילה ^4, אשר הוכיחה את מודל חזק מאוד ללימודים של פנל רחב של תהליכים, כוללים deve העיןlopment, גיוס יחסי ציבור, בידול, קוטביות תא מישוריים, המורפוגנזה, הישרדות, אפופטוזיס ותמרה חזותית ^5-9.

חוקרים עובדים על העין דרוזופילה יש, במשך שנים רבות, פיתחו טכניקות הדמיה הרשתית וביצוע מסכי גנטיים שיטתיים. הדרך הקלה ביותר לתמונת הרשתית המבוגר היא להסתכל על הקרנית בבעלי חיים משותקים (איור 1 א). המבנה של הקרנית יכול להיות דמיינו דווקא על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים סורק והיה בשימוש במסך גנטי בקנה מידה גדולה על ידי קונסורציום URCFG (http://www.bruinfly.ucla.edu) ^10. זוהי גישה יעילה מאוד להמחשת שינויים הגלובליים מורפולוגיים במבנה קרני, כגון חספוס עין או ברק, לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות בגנים השולטים בשלבים מוקדמים בהתפתחות או כדאיות תא. עם זאת, להדמיה הגלובלית של הקרנית היא לא sufficient לזהות את הגורמים המסדירים את כדאיות המורפוגנזה או יחסי ציבור יחסי הציבור מבוגרים rhabdomere ותפקוד. ניתוח מסוג זה דורש חקירה יסודית יותר של יושרת יחסי הציבור, המבוססת על מיקרוסקופ שלב בניגוד סעיפים שרף חצי דקים המשיקים של ^11-13 הרשתית. טכניקה זו מתאימה לניתוחי פסיפס, שבה ניתן לזהות הפורטוריקנים מוטציה על ידי חוסר ^14,15 הפיגמנט האדום שלהם.

יכולים גם להיות דמיינו שיבוטים מוטציה פסיפס ובניתוחים כל ההר של רשתית גלמים או מבוגר, על הבסיס של חוסר החלבון פלואורסצנטי ירוק אות (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי ^16,17. שתי טכניקות אלה שימושיות מאוד, אבל שניהם עבודה וזמן רב ולכן אינו מתאימים להקרנה בקנה מידה גדולה. אנו ואחרים פיתחו את השימוש בטכניקות נטרול קרנית להדמיה של הפורטוריקנים ייצור חלבוני ניאון ^18,19, כדי להקל על יחסי ציבור מהירים מנתח. בעזרת טכניקה, זה מוטציהניתן לזהות שיבוטים על בסיס autofluorescence של הפיגמנט האדום (w +) בשיבוטי דרוזופילה מבוגרים פסיפס. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת את הרזולוציה התא הבודד הדרושה לטיפול באוטונומית תא מנפיקה ^19. התגברנו על בעיה זו על ידי פיתוח שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, המשלבת את ההדמיה של חלבוני ניאון על ידי נטרול קרנית עם רקומבינציה mitotic ^20. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה, זיהוי מהיר ומדויק של הפורטוריקנים מוטציה בשיבוטי פסיפס, ברזולוציה של תא בודד (http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/). הוא מתאים לשימוש בניתוחים הקינטית, לבא הפורטוריקנים בודדים על פני תקופה של שבועות בחיים דרוזופילה. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT וטיפים לשימוש בו בניתוחים פשוטים, הקינטית של עיני פסיפס.

Protocol

1. חציית קווים עם העגבניות / GFP-FLP / FRT

הדור של זבובים שנשאו את המוטציה השיבוט דורש צלב יחיד בין קו המוטציה נושאת FRT והעגבניות / GFP-FLP / FRT המתאימה לטוס קו.

עבודה זו מנוצל אוסף BruinFly של מוטציות recombined-FRT (http://www.bruinfly.ucla.edu). ניתן להשתמש בו ארבעה קווי העגבניות / GFP-FLP / FRT, נושאים FRT RH1-tdtomatoninaC על כל זרועותיה של 2 ו -3 בכרומוזומים בשילוב עם מקור flipase (אי-FLP) וביטוי של ה-GFP בכל הפורטוריקנים החיצוניים (כטב"מ RH1-Gal4 -GFP) ^20:

- זרוע 2L: קו # 43,345, P {ר"י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר"י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ר"י [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {ר [+ MC] = כטב"מ-GFP-ninaC} 3

- זרוע 2R: קו # 43,346, P {ר"י [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ר"י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {ר"י [T7.2 +] = neoFRT} 42d P{ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {ר [+ MC] = כטב"מ-GFP-ninaC} 3

- זרוע 3L: קו # 43347, P {ר"י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר"י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = כטב"מ-GFP-ninaC} 2, P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ר"י [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, שחפת [1]

- זרוע 3R: קו # 43,348, P {ר"י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר"י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w P {ר"י [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, שחפת [1]; [+ MC] = כטב"מ-GFP-ninaC} 2

ארבע שורות אלה זמינות במרכז מניית Bloomington דרוזופילה. הם סיפקו מקור של FLP בעיני הפיתוח לייצור שיבוטים המיטוטי ^21. כרומוזום פראי מסוג נושאת רצף FRT ^וninaC RH1-tdTomato לבנות קידוד tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום, כסמן לwild-type ו הפורטוריקנים חיצוניים הטרוזיגוטיים. במבנה זה, 41 חומצות אמינו האחרונות של איזופורם p174 של ninaC (לא איון ולא הפעלת C) גן היה appended במסגרת לC-הסופית של רצף tdTomato. זנב C-מסוף של איזופורם p174 ninaC אחראי על לוקליזציה rhabdomeral של החלבון ²² והיתרים להדמיה חיות טוב יותר של הפורטוריקנים ניאון אדומים שימוש בטכניקת נטרול קרנית. אמרגן RH1 הוא נ"ב המינימלי 234 (-152 +82) אמרגן RH1. GFP סמן פלואורסצנטי הירוק בא לידי ביטוי בכל הפורטוריקנים החיצוניים, בשל נוכחותם של RH1-Gal4 (אמרגן 3KB) וכטב"מ-GFP ^ninaC בונה. צלבים בין המניה לטוס נושאת x מוטציה על כרומוזום FRT (FRT-x) וקווי העגבניות / GFP-FLP / FRT מניב צאצאים עם גנוטיפ הבא (דוגמא למוטציה ב2L): RH1-Gal4, אי-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ^ninaC / FRT40A-x; כטב"מ-GFP ^ninaC. בזבובים אלה, תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים מופקים על ידי רקומבינציה mitotic בדיסק העין מתפתח ומתחלקים על מנת לייצר שיבוט של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים (איור 2 א). הומוניתן לזהות תאים שעברו מוטציה zygous משום שהם מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק בלבד (GFP), ואילו wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים סביב לבטא גם tdTomato וGFP (2B דמויות ו-B ").

2. הכנת דרוזופילה להדמיה קולטי אור

להדמיה יחסי ציבור על ידי טכניקת נטרול קרנית, לשתק את הזבובים על צלחות agarose.

1. הכן בקבוק שטיפה מלא במים 4 ° C מזוקקים ולמקם אותו על קרח.
2. להמס agarose הרגיל במים (agarose 1.2-1.5% במי 100 מיליליטר) על ידי חימום במיקרוגל. מניחים את הבקבוק באמבט מים ב55 ° C ולאפשר פתרון agarose להתקרר לטמפרטורה זו. שמור את agarose על 55 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. הרדימי זבובים עם CO ₂ לדקות לפחות 1.
4. יוצקים את פתרון agarose החם (ב55 ° C) לתוך צלחת פטרי (35 x 10 מ"מ, 1.37 x 0.39 ב) ומקום היא מידately הרדים דרוזופילה על agarose. למתחילים, מתחיל עם 10 זבובים לכל צלחת פטרי הוא סביר. גם מנה גדולה יותר פטרי (60 x 15 מ"מ, 2.362 x 0.59 ב) יכולה לשמש.
5. תחת מיקרוסקופ לנתח, כוון את דרוזופילה על צידו עם מלקחיים, דוחף כנף אחת לתוך agarose, כך שהכנף וחצי של הגוף מוטבעים בagarose (איורים 3A-3A ""). היצמד האגף האחר על פני השטח של agarose. הערה: אם הזבובים אינם מוטבעים עמוק מספיק בagarose, הזבוב יהיה חופשי לנוע בראשה במהלך ההדמיה של יחסי הציבור, וזה יגרום לתמונות מטושטשות. הנטייה של העין תהיה גם יפריע לו. זה עלול להיות קשה לצלול לתוך דרוזופילה agarose, עקב או הריכוז של agarose או הטמפרטורה שלו. זה יותר קל להטביע זבובים בagarose מרוכז יותר, אבל אם את agarose מרוכז מדי, הזבוב עלול לשקוע. אם agarose הוא מגניב מדי, זה יכול להיות דיfficult להטביע את הזבוב, אבל גבוהה מדי טמפרטורה עלולה לגרום נזק לקרנית.
6. שים את צלחת פטרי על קרח ולאפשר agarose כדי לחזק.
7. עם מלקחיים, כוון את הראש כך שעין אחת חשופה למטרת הטבילה (איור 3 א 'ו 3 א ""). באופן כללי, עיניים יכולות להיחשב להיות מכוונות היטב תחת מיקרוסקופ לנתח כאשר pseudopupil (דמיינו ככתם שחור) הוא באמצע של העין. כיוון אופטימלי של העין מגדיל את הרוחב של שדה ommatidial בי הפורטוריקנים מתמקדים. מטרת צעד הנטייה היא למצוא את האזור של העין עם השדה הרחב של הפורטוריקנים ממוקדים, בדרך כלל במרכז העין. שלב זה הוא גם שימושי עבור הסרת כל רגליים או aristae מכסה את העין ומניעת ההדמיה שלה.
8. כסה את הזבוב עם מים קרים כקרח ולהשאיר את צלחת פטרי על קרח עד להדמיה. מים קרים כקרח שומר על הזבובים מורדמים.

3. חזותיקולטני אור מתחת למיקרוסקופ

להדמיה של הפורטוריקנים דרך הקרנית, פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ זקוף מצויד מטרת מים עם מרחק עבודה ארוך (W N-Achroplan 40X/0.75).

1. מניחים את צלחת פטרי מכוסה במים קרים כקרח בשקופית זכוכית על הבמה של מיקרוסקופ (איורים 3 לפני הספירה). צלחת פטרי יכולה להיות דבוקה לשקופית הזכוכית, כך שניתן להעביר אותו בצורה חלקה על עם ברגי מיקרומטר.
2. לצלול אובייקטיבי הטבילה לתוך המים של צלחת פטרי (איורים 3B'-3C '). מקם את הראש של הזבוב תחת קורה העירור (להתחיל עם מסנן ה-GFP, למשל). להזיז את הבמה למעלה ולמטה עד הקרן מתכנסת על העין. כאשר העין היא ברמה הנכונה, הוא נוטה לשקף את אור העירור.
3. להסתכל דרך העינית לקרינה. כאשר העין ממוקמת במרכז שדה הראייה, להתמקד בהמשךקרנית כדי להמחיש את קולטני אור הניאון.

הערה 1: כאשר מסתכלים דרך העינית, זה עשוי להיות לא נוח להבחין חלקי הגוף של הזבוב, ובעיקר החלק האחורי של הבטן והראש, למשל. במקרים כאלה, אתה צריך להסתכל ישירות בשלב כדי לשנות את מיקום דרוזופילה.

הערה 2: הקרינה קלאסית או confocal עשויה לשמש. מיקרוסקופיה confocal נותנת תמונות עם פחות רקע ושדה רחב יותר של הפורטוריקנים ממוקדים ממיקרוסקופיה קלאסית. הגדרת דוגמה לכך היא מיקרוסקופ confocal LSM510 (Zeiss) עם מטרת מים 40X. ניתן לקבל תוצאות טובות יותר על ידי פתיחת חריר של מיקרוסקופ confocal הרחב יותר מאשר בדרך כלל מומלץ לאובייקטיבי. לדוגמא, השתמש בשווי של 204, ולא ברירת המחדל 98 לצמצם של חריר.

הערה 3: רמות גבוהות יותר של פיגמנטציה + w של העין להפחית את הקרינה הרקע.

4. ויזואליזציה בזמן קורס של תאי קולטי אור

טיפול נדרש כאשר בעקבות גורלם של יחסי ציבור אינדיבידואליות באותה עין על פני תקופה של זמן.

1. מנמיך את הטמפרטורה של agarose ל45 ° C, על מנת למקסם את הישרדות דרוזופילה. Agarose מתמצק במהירות בטמפרטורה זו. יש להשתמש רק אחד דרוזופילה לכל צלחת פטרי, על מנת להבטיח כי זבובים אינם מעורבים במהלך תצפיות.
2. באופן שיטתי למקם את הזבובים באותו הצד, לצפייה של אותו עין. זו יכולה להיות מושגת על ידי נטילת הזבוב הרדים מהבקבוקון שלה על ידי כנף אחת והצבת דרוזופילה על agarose. תמיד לכוון את העין באותה הדרך, אם אפשר, מה שהופך את זה קל למצוא שיבוטים יחסי ציבור שכבר נצפו בעבר.
3. זהה את השיבוטים על בסיס הצורה שלהם מתחת למיקרוסקופ confocal. שדה הראייה ממוקם בסמוך לשיבוט של עניין לעתים קרובות. בsuch המקרים, העין צריכה להיות ההתמצאות מתחת למים, למרכז שדה הראייה על השיבוט של עניין, המבוסס על הקוטביות של העין (איור 4).

5. שחזור זבובים לאחר יזואליזציה

1. הסר את המים מצלחת פטרי.
2. משוך בעדינות את דרוזופילה מתוך agarose עם מלקחיים.
3. ייבש את דרוזופילה ברקמות.
4. להחזיר את דרוזופילה לבקבוקון, על מנת להבטיח שזה לא להיתקע במזון. מחמד לטוס לבוא עגול ב25 ° C.

תוצאות

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה או ביטוי מחוץ לרחם על ההתפתחות וההישרדות של הפורטוריקנים ברשתית דרוזופילה. זה מהיר, מה שהופך אותו אידיאלי למטרות הקרנה, כפי שמודגם ²⁰ לאחרונה. הנוכחות של הפורטוריקנים מוטציה ליד הפורטוריקנים wild-type באותה העין עושה את זה קל לזהות פגמים הקשורים הפורטוריקנים מוטציה ולהתייחס לנושא האוטונומיה תא.

הליקויים התפתחותיים נצפו בניתוח שלנו מושפעים תהליכים שונים, ובכלל זה גיוס יחסי ציבור, המורפוגנזה וקוטביות תא מישוריים ההקמה (PCP) (איור 5). שבעה שלא בפניו הוא נדרש לגיוס יחסי ציבור, במיוחד עבור R7 אחד יחסי הציבור הפנימיים. האובדן של שבע בתוצאות שלא בפניו באובדן של יחסי הציבור הפנימיים וכמה פורטוריקנים חיצוניים (איור 5 א). הראש מגורען (grh) מעורב בהקמת PCP וכמה האומטידיה הן inverted בgrh שיבוטים מוטציה (איור 5). שיטה זו מאפשרת לזהות את הפורטוריקנים המוטציה בהאומטידיה פסיפס, להקל זיהוי של הפורטוריקנים בהם נדרש הגן לרכישה הנכונה של PCP. הראנו grh שנדרש לרכישה הנכונה של PCP במבשרי R3 ^20. ואכן, אנו ציינו כי, בהאומטידיה ההפוכה, R4, שמקורו באופן חריג ממבשר R3, תמיד היה מוטציה. פירורים (Crbs) הוא חלבון קרום הפסגה נדרש להמורפוגנזה rhabdomere ^23. אובדן Crbs בתוצאות המוטציה Crbs ^11A22 בהפורטוריקנים לא סדירים, גדולים יותר או קטנים יותר (איור 5 ג).

גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים אחת במהלך הבגרות (איור 6). הוא אידיאלי עבור מחקרי ניוון מוחיים, כי קבוצה של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים ניתן לראות וניתן למצוא אותה הקבוצה באותה עיןאותו לעוף על פני תקופה של ימים או שבועות. ניתן, אפוא, לקבוע איזה הפורטוריקנים לשרוד ואשר נידונו למות, כי כל שיבוט יש צורה ייחודית שניתן להכיר כאשר העין ממוקמת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כרשתית מקוטבת, ניתן לכוון את הרשתית כדי למצוא את אותו השיבוט שוב, על בסיס צורתו. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי להראות שfatp ^k10307 מוטציה גורמת להתנוונות יחסי ציבור מתקדמת בבגרות (איור 6, ^24). גם שיטת הדמיה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את האוטונומיה תא. בfatp ^k10307 רשתית פסיפס, אובדן יחסי הציבור הוגבל לfatp הפורטוריקנים מוטציה, הפורטוריקנים פראי מהסוג להיות מושפעים. הדרישה של fatp לכדאיות יחסי ציבור ולכן תא אוטונומי. היינו גם יכול להציל את יחסי ציבור המוטציה fatp ידי reexpressing fatp wild-type עם נהג RH1-Gal4 ולבנות כטב"מ-fatp (איור 7).אפשרות של ביצוע ניסויי הצלה כזו היא אחד היתרונות של שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT על ניתוח משובט המבוסס על סעיפים היסטולוגית של רשתית-מוטבע שרף. אכן, זיהוי משובט עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT אינו מושפע מהשימוש בP (כטב"מ, W +) מבנים מהונדסים, ואילו פיגמנטציה האדומה הקשורים לגן המיני לבן (w +) מכסה את העין עם הפיגמנט האדום , מיסוך שיבוטים פסיפס בסעיפים היסטולוגית.

איור 1. ארגון של העין דרוזופילה. (א) תצלום של העין דרוזופילה נלקחה עם סטראו. עין דרוזופילה מורכבת מכ 800 אומטידיה. (ב) תרשים סכמטי של תחום 64 האומטידיה באמצע של העין. שישה תאי עצב קולטי האור חיצוניים (PRS) של כל אומטידיום,מוצג בירוק, מאורגנים בטרפז סטריאוטיפי המצביע על הקטבים הקרובים ביותר של העין. הם כתוצאה מכך מצביעים בכיוונים מנוגדים בגחון והחלק הגבי של העין והם תמונת ראי לדברי את הגבול בין שני חלקים, הנקרא קו המשווה. תרשים סכמטי (C) של אומטידיום. כל אומטידיום מכיל שמונה הפורטוריקנים. הפורטוריקנים R1 לR6, המוצג בירוק, נמצא הפורטוריקנים החיצוניים. הם מבטאים את rhodopsin1 המולקולה רגיש (RH1) והם המקביל של תאי מוט יונקים. הפורטוריקנים הפנימיים, R7 ו R8, מוצגים באפור (R7 יושב על גבי R8). הפורטוריקנים הפנימיים להביע rhodopsin 3, 4, 5 או 6 והם המקביל של תאי חרוט יונקים. לשם פשטות, רק rhabdomere, החלק רגיש לאור של יחסי הציבור, מוצג עבור כל יחסי ציבור. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2. יצירה באופן חזותי שיבוטים יחסי ציבור פסיפס בעיני דרוזופילה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) תרשים סכמטי של הדור של שיבוטים פסיפס בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיבוטים פסיפס נוצרים על ידי רקומבינציה mitotic, בשל הביטוי של flipase (תחת שליטה של ​​האמרגן חסר עיניים) במהלך התפתחות העין ורצפי FRT. לאחר רקומבינציה של רצף FRT וחלוקת תא, מוטציה הומוזיגוטים, פראי מסוג הומוזיגוטים ותאים הטרוזיגוטיים יכולה להיות שנוצרה מתאים הטרוזיגוטיים. תאים אלה מתחלקים שוב ליצירת שיבוטים פסיפס של הפורטוריקנים בעיניים המבוגרים. זיהוי של תאים שעברו מוטציה הוא הקל על ידי הוספת מבנה המבטא את tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום לכרומוזום wild-type, לתייג wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים. ויזואליזציה (B-B'') של שיבוטים יחסי ציבור פסיפס עם tשיטה שהוא העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT משלבת רקומבינציה mitotic, ניטרול הקרנית ומיקרוסקופיה confocal. כל הפורטוריקנים להביע GFP ירוק ניאון החלבון, המאפשר ההדמיה של הפורטוריקנים באמצעות נטרול קרנית ומיקרוסקופיה confocal (ב '). ניתן דמיינו הפורטוריקנים ברמת תא בודד. שיבוטים פסיפס מוטציה מופקים על ידי רקומבינציה mitotic ויכולים להיות מזוהה על ידי היעדר tdTomato האדום ניאון החלבון (ב '). כתוצאה מכך, בתמונות הממוזגות, הפורטוריקנים הומוזיגוטים מופיעים בירוק, בעוד הפורטוריקנים wild-type ו הטרוזיגוטיים הם צהובים (ב''). לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3. הגדרת דרוזופילה לvisualizatיון על ידי נטרול קרנית. (-'''') תצלומים של דרוזופילה משותקים על צלחת מלאה בagarose. בפנל'''', חתיכת agarose המכילה הזבוב נחתכה כדי לצלם פרופיל. דרוזופילה היא חצי משובצת בagarose, עם אגף ימין בתוך agarose והשמאל תקוע על פני השטח agarose (,'',''''). כאשר דרוזופילה מוטבעת בagarose, הראש שלה ממוקם לעתים קרובות בצורה גרועה להדמיה של העין (, '). הראש לכן יש reorientated עם מלקחיים כך שהאמצע של העין כלפי מעלה ('','' '). (B-B') תרשים סכמטי המציג דרוזופילה משותק על צלחת agarose והמיצוב של דרוזופילה תחת המטרה של המיקרוסקופ תצלומים. (C-C ') של ההגדרה של דרוזופילה על במתמיקרוסקופ תחת המטרה שלה. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 4. נטייה של העין לניתוח בזמן כמובן. איור מציג תצלומים של ראש דרוזופילה בשתי אוריינטציות שונות והשדות המתאימים של האומטידיה שנצפו על ידי נטרול קרנית, מיוצגים כדיאגרמות סכמטי. (א) במהלך התצפית הראשונה, העין ממוקמת כך ששיבוט של הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים או wild-type (בצהוב) נתפס באמצע השדה, ברמה של קו המשווה (קו אדום). (ב ') במהלך התצפית השנייה, העין היא לעתים קרובות לא בדיוק באותו הכיוון. לכן, ניתן למצוא אותה הקבוצה של הפורטוריקנים שוב, אבל זה לא אפשרי כדי להציגאותו מדויק שדה (משמאל). העין חייבת להיות ההתמצאות לאותו שדה כדי לראות שוב. עמדתו של קו המשווה יכולה לשמש כמדריך. בדוגמא זו, אנו יודעים כי השדה שנצפה הוא הגחון מדי, וכי העין ולכן צריכה להיות מופעלת ventrally למקם את קו המשווה באמצע השדה שנצפה שוב, כמו בתצפית הראשונה.

איור 5. דוגמאות לליקויי התפתחות יחסי הציבור זוהו על ידי שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) ויזואליזציה של הפורטוריקנים סינא פסיפס [BG02648] מוטציה, מראה את האובדן של הפורטוריקנים פנימיים. בהאומטידיה המוטציה, הפורטוריקנים חיצוניים מקובצים יחד בשל היעדר יחסי הציבור R7 הפנימי. ואכן, סינא ידוע להידרש לגיוס יחסי ציבור פנימי. ויזואליזציה (ב) לgrh פסיפס [s2140] הפורטוריקנים מוטציה מראים פגמים קוטביות. האומטידיה, surr המוטציה הפסיפסounded על ידי מעגל, מצביעים בכיוון ההפוך מהאומטידיה הסוג פראי, מה שמעיד על היפוך dorso-הגחון. מחקר מפורט בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הראה כי grh נדרש במבשרת R3 לרכישה הנכונה של קוטביות אומטידיום ^20. ויזואליזציה (C) של הפורטוריקנים CRB פסיפס [j1B5] מוטציה, מראה הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מעוות. CRB ידוע להידרש להמורפוגנזה rhabdomere.

איור 6. הניתוח בזמן במהלך fatp פסיפס [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, מעל 14 ימים. fatp פסיפס [k10307] רשתית מוטציה הוא ציין ביום 1 (, '), יום 4 ( ב ', ב'), יום 8 (C, C ') והיום 14 (ד', ד ') לאחר הבקיעה. אותה הקבוצה של הפורטוריקנים פסיפס יכולה להיות founד בכל נקודת זמן, בתחום הנצפה (מלבן לבן, A, B, C, D). בתחום זה של הפורטוריקנים (א ', ב', ג', ד '), הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מסומנים בירוק, ואילו הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים פראי מסוג מסומנים בצהוב. מיום 4 (ב ') ואילך, הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מתחילים להיעלם, המציין כי fatp [k10307] מוטציה גורמת לניוון הדרגתי של הפורטוריקנים אלה. לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 7. הצלה של fatp [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם ויזואליזציה ביצוע מיני לבן לבנות להביע fatp. הפורטוריקנים הפסיפס הם דמיינו עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT בזבובים 15 ימים בת. (א) לשליטת פסיפס הפורטוריקנים. (ב) Visualization של הפורטוריקנים פסיפס fatp מוטציה, מראים את האובדן של הפורטוריקנים מוטציה ויזואליזציה. (C) של פסיפס fatp הפורטוריקנים מוטציה בfatp זבוב reexpressing ביחסי הציבור חיצוני (RH1> fatp). הפורטוריקנים המוטציה הם חולצו. הנוכחות של גן מיני לבן ופיגמנטציה העיניים האדומה הקשורים בRH1> תנאי fatp אינו משנים עגבניות או GFP הקרינה או זיהוי משובט.

Discussion

עין דרוזופילה כבר בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי איתות ויסות פיתוח, שגשוג והישרדות. בתחילת 1990, מספר גדול של מסכים גנטי בוצע על מנת לזהות את המסלולים הנדרשים במהלך השלבים הראשונים של פיתוח יחסי ציבור ^25-27. היעילות של מסכי גנטיים גדלה במידה רבה על ידי טכניקת רקומבינציה mitotic, מה שהופך את זה אפשר לבדוק מוטציות אובדן של פונקציה בשיבוטי פסיפס ^21. לפיכך, תפקידה של מוטציות קטלניות עובריים יכול להיבדק באופן שיטתי בשיבוטי מוטציה הומוזיגוטים בעיניים של זבובים שהיו אחרת הטרוזיגוטיים. רוב הקרנות הפסיפס התמקדו בגיוס יחסי הציבור המוקדם, הבידול, הקרנת אקסון או המורפוגנזה מתרחשת בזחלים או גלמי ^10,25-31 המתפתחים. עד כה, רק אחד מסך פסיפס חקר את מנגנוני ויסות תפקוד יחסי ציבור מבוגרים, על ידי ניטור התגובה החזותית באמצעות electroretinogram הקלטות ^32. עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT והאפשרות של ביצוע ניתוח כמובן זמן חי חיות שעברו מוטציה, יש לנו תוכננו שיטה חדשה לזיהוי הגורמים המסדירים את יכולת קיום יחסי ציבור מבוגר ולתפקד ^20,24.

יש שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כמה יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית הקלאסי של עיניים משובצות שרף. ראשית, שיטה זו היא הרבה יותר מהר, זול יותר וקל יותר לביצוע מאשר השיטה היסטולוגית, ובלבד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במטרת טבילת מים מתאימה הוא זמין (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד). שנית, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש בשילוב עם ביטוי transgene, כגון הביטוי של P (כטב"מ, W +), שנשאה transgene מיני לבן. בניגוד לסעיפים היסטולוגית, שבי + w משמש לזיהוי משובט, במערכת העגבניות / GFP-FLP / FRT, P (כטב"מ, W +) לא מפריע ד המשובטetection מבוסס על חלבון פלואורסצנטי עגבניות. באמצעות P (כטב"מ-fatp, W +) זבובים מהונדסים, היינו יכול לדמיין את ההצלה של הפורטוריקנים מוטציה fatp (איור 7). שלישית, מכשול עיקרי של כל סוגי ניתוח משובט, ובכלל זה המבוסס על העגבניות / GFP-FLP / FRT, היא העמימות של גנוטיפ של הפורטוריקנים לאיבוד. ואכן, זה עשוי להיות לא ברור אם יחסי ציבור נעדר בגלל חוסר תפקוד גן מסוים או בגלל השפעה בלתי אוטונומית תא, במיוחד בגבול של השיבוט שעבר מוטציה. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT מקבלת לעקוף בעיה זו לניוון על ידי כך שניתן לעקוב wild-type ו הפורטוריקנים מוטציה באותו בעל חיים על פני תקופות של מספר שבועות. היינו מסוגל לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים פרט על ידי הקינטית ניתוחים על זבובים שעברו מוטציה fatp שונים (איור 6). אותו השיבוט יכול להיות מוכר בבעלי חיים ניתנו בזמנים שונים, בגלל צורתו המדויקת של השיבוטים פראי מהסוג שמסביב. אנחנו הצלחנו להראות חד משמעיly שכל הפורטוריקנים החסרים היו מוטציה לfatp, מצביעים על כך שתפקידם של מוטציות fatp בהפורטוריקנים הוא תאים אוטונומיים. לכן, על ידי ניטור אובדן הפורטוריקנים בניתוח קינטי, ניתן לקבוע את הגנוטיפ של הפורטוריקנים במודלים של ניוון ממבוגרים. לבסוף, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הוכיחה חזקה מאוד לזיהוי של גורמים המסדירים את הקמתה של PCP ^20. האפשרות של הבקיע מספר רב של האומטידיה פסיפס לפנוטיפ קוטביות ללא הצורך בחלקים, מאפשרת קביעה מהירה של דרישת יחסי הציבור להקמתה של PCP. עם זאת, ניתוח של יושרת יחסי הציבור עדין ידרוש חתך מסורתי ואחריו שלב בניגוד או microscopies האלקטרוני.

לסיכום, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT פותחת אפשרויות חדשות לסינון פסיפס יעיל כדי לזהות גורמים המסדירים את תהליכי התפתחות יחסי ציבור ופונקציות יחסי ציבור בוגרים, כגון מולתגובת רע"מ ויכולת קיום.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent
Agarose	Euromedex	D5-E	Regular agarose is used to immobilize the flies
Petri dish	BD Falcon	353001	35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch
Cold-ice water			To maintain the flies anesthetized
			Equipment
Dissecting microscope	Dutcher	SMZ645
Water Bath	Julabo	9550102	To keep the agarose solution at warm temperature
40X Water objective	Zeiss	420967-9900-000	Water dipping objective for the confocal microscope