Microfabrication של דפוסי זהב Nanoporous לסלולרי מהותי מחקרי אינטראקציה

Summary

אנו מדווחים על טכניקות לסרטים באמצעות הדפסת סטנסיל וphotolithography, כמו גם שיטות לתאי תרבות על דפוסי microfabricated הדקים זהב nanoporous micropattern. בנוסף, אנו מתארים שיטות ניתוח תמונה למאפיינות מורפולוגיה של החומר ואת התאים בתרבית באמצעות אלקטרונים סורקים וטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

חומרי Nanostructured עם גדלי תכונה בעשרות ננומטרים הגבירו את הביצועים של מספר טכנולוגיות, כולל תאי דלק, biosensors, ציפויי מכשיר ביו, וכלים אספקת סמים. זהב Nanoporous (NP-Au), המיוצר על ידי תהליך הרכבה עצמית בקנה מידה ננו, הוא חומר חדש יחסית שמציג שטח גדול משטח יעיל, מוליכות חשמלית גבוהות, ופעילות קטליטית. מאפיינים אלו הפכו את NP-Au חומר אטרקטיבי לקהילה מדעית. רוב המחקרים על NP-Au להעסיק דגימות מאקרו בקנה מידה ולהתמקד במדע בסיסי של החומר והיישומים קטליטיים וחיישן שלה. דגימות מאקרו בקנה המידה להגביל את הפוטנציאל של NP-Au במערכות מיניאטורי, כולל התקנים ביו. על מנת לטפל בבעיות אלה, אנחנו בהתחלה לתאר בשתי שיטות שונות לסרטים דקים micropattern NP-Au על מצעים נוקשים. השיטה הראשונה מעסיקה מסכות סטנסיל ידני המיוצרים ליצירת דפוסי NP-Au מילימטר בקנה מידה, whilדואר השיטה השנייה משתמשת photolithography המראה לדפוסים תת מילימטר בקנה מידת דפוס. ככל שהסרטים הדקים NP-Au מתקבלים על ידי תהליך גמגום בתצהיר, שהם בקנה אחד עם טכניקות microfabrication קונבנציונליות, ובכך המתאימים לשילוב קליל למיקרוסיסטמס. מערכות אלה כוללות פלטפורמות biosensor חשמליים-מיעון שנהנים מאזור הגבוה יעיל פני השטח, מוליכות חשמליות, ומשטח bioconjugation מבוסס זהב תיאול. אנו מתארים תרבית תאים, immunostaining, וטכניקות עיבוד תמונה לכמת האינטראקציה של NP-Au עם תאי יונקים, וזה פרמטר חשוב לביצועים מסוימים biosensors. אנו צופים כי בטכניקות מאוירות כאן יסייעו שילוב של NP-Au בפלטפורמות באורך סולמות שונים וביישומים רבים, כוללים חיישנים ביולוגיים, מערכות אחסון אנרגיה, וזרזים.

Introduction

חומרים בעלי תכונות בקנה מידה ננו הראו הבטחה בשיפור יישומים שונים, כולל תאי דלק ¹, חיישנים ^2,3 והתקנים, ביו ^4,5. חומר חדש יחסית הוא זהב nanoporous (NP-Au), אשר מופק על ידי תהליך הרכבה עצמית בקנה מידה ננו. מבשר על NP-Au הוא סגסוגת זהב שמורכב בדרך כלל מכסף ב -60% עד 80% על ידי אחוז האטומי. בקצרה, nanostructure הפתוחה הנקבובית האופיינית היא התוצאה של סידור מחדש של אטומי זהב באשכולות כמו כסף הוא נמס על ידי חומצה חזקה ( לדוגמה: חומצה חנקתית 70%) או מתחת לפוטנציאל אלקטרוכימי ^6-8. יתרונות NP-Au מכמה תכונות רצויות, כולל שטח פנים יעילים גדולים, מוליכות חשמליות גבוהות, טכניקות functionalization משטח מבוססות היטב, biocompatibility ⁹. למרות שחלה התרחבות מהירה של מחקרים בNP-Au, רובם מתמקדים בתכונות מכאניות של NP-Au ^10,11 פעילות הקטליטית ¹², וביצועי חישת biomolecular ^13-15. בעוד שהתכונות הרצויות הן שימושיות ביותר עבור מספר כלים ביו ^16,17, את היישומים בתחום זה היו מוגבלים. סיבה אפשרית אחת לכך היא שרוב המחקרים השתמשו בעיקר דגימות מאקרו בקנה מידה ( לדוגמה: גיליונות, foils, ומטילים) ואת הטכניקות לשילוב NP-Au במערכות מיניאטורי נשארו בינוני. למעשה יש רק קומץ דוגמאות של שימוש בטכניקות microfabrication קונבנציונליים המעסיקות סרטי NP-Au ^16-20. עם כניסתו של טכנולוגיית מזעור וצורך בכלים ביו רומן, זה הפך להיות חיוני כדי להיות מסוגל לשלב חומרים חדשים למכשירים. זה בדרך כלל דורש שניתן להפקיד את החומרים ועם דפס של טכניקות microfabrication קונבנציונליות. בנוסף, כימות מהירה של אינטראקציות תא מהותיות נחוצה בדרך כלל כדי להעריך את ההתאמה הביולוגית של חומר חדש. המטרה של מאמר זה היא להדגים טכניקות בסיסיות לסרטי NP-Au micropattern ולכמת גם nanostructure ואינטראקציות תא חומר דרך עיבוד תמונה דיגיטלי.

Protocol

1. ייצור זהב Nanoporous

1. מצעים נקיים בפתרון Piranha
   1. הוסף 25 מ"ל מי חמצן (30%) לחומצה גופרתית 100 מ"ל (96%) בצלחת גיבוש ומחמם את התערובת עד 65 מעלות צלזיוס על פלטה חמה. התראה: הנוזלים הם מאכל מאוד ויש לטפל בזהירות. הפתרון בילה לא צריך להיות מאוחסן במכל אטום, כפי שהוא עלול להתפוצץ.
   2. מקום 1 אינץ על ידי שקופיות מיקרוסקופ 3 אינץ לתוך התערובת באמצעות מלקחיים עמידי חומצה ולנקות אותם במשך 10 דקות. השתמש בסירת immunostaining פורצלן לתצווה ניקוי-coverslips קטנה. פנק coverslips קטנה עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות לפני הטבילה לתוך התמיסה.
   3. יש לשטוף את הדגימות ניקו במנות התגבשות תחת מים זורמים deionized (DI) במשך 3 דקות. דגימות מכה יבשות עם אקדח חנקן מעל נטולות סיבי מגבות.
2. הכן את מסכת סטנסיל (שיטה 1: השתמש באפשרות זו ליצירת דפוסי מילימטר בקנה מידה)
   1. 250 גיליונות סיליקון אלסטומר מיקרומטר בעובי אגרוף עם אגרופים ביופסיה ו / או לחתוך את אזורים עם אזמל על משטח פלסטיק חצי קשה. נקה את גיליונות אלסטומר מעובד ב70% isopropanol ויבשים עם אקדח חנקן.
   2. הנח את הגיליון חבט במגבת נטולת מוך חדר נקי וליישר את coverslips Piranha-ניקה מעל סטנסיל עם משטח המדגם מול סטנסיל.
3. photoresist המראת הדפוס (שיטה 2: השתמש באפשרות זו ליצירת דפוסים תת מילימטר בקנה מידה)
   1. הנח Piranha-ניקו שקופיות מיקרוסקופ על ספינינג צ'אק ולפוצץ את כל חלקיקים עם אקדח של חנקן. לוותר על 1.5 מ"ל של אמרגן הידבקות (hexamethyldisilazane) על גבי שקופית הזכוכית באמצעות פיפטה פלסטיק. מורחים את האמרגן ידי ספינינג את השקופית ברציפות ב 500 סל"ד במשך 5 שניות ו-1,500 סל"ד במשך 30 שניות. אופים את השקופית על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות ולתת לו להתקרר למשך 5 דקות.
   2. לוותר על 4 מ"ל של photoresist לשקופית הזכוכית (ב 3 אינץy-1 סנטימטר). מורחים photoresist על ידי ספינינג השקופית עם אותו הפרוטוקול כלאמרגן ההידבקות. לאפות photoresist על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות ולתת לו להתקרר במשך 10 דקות.
   3. לחשוף את שקופית photoresist המצופה עם אור האולטרה סגול (העצמה: 22 mW / ² ס"מ) דרך שקיפות מסכה במשך 15 שניות. לאפות photoresist על פלטה חמה על 115 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות ולחכות 45 דקות. ממיסים את photoresist נחשף במפתח לפחות 3.5 דקות. לשטוף ביסודיות עם מים די. בדוק את הדפוסים שפותחו תחת מיקרוסקופ אופטי.
4. מתכות מבשר הפקדה להפקת סרטים דקים NP-Au
   1. טען את הדגימות למכונה המקרטעת שעצמאית יכול להפקיד זהב, כסף, וכרום. גמגום-לנקות את הדגימות עבור 90 שניות ב 50 וואט מתחת לגיל 25 אווירת עיבוד ארגון mTorr לפני תחילת תצהיר מתכת.
   2. גמגום כרום עבור 10 דקות ב 300 וואט מתחת לגיל 10 mTorr ארגון. גמגום זהב עבור 90 שניות ב 400 W האו"םדר 10 mTorr ארגון. שיתוף גמגום זהב וכסף עבור 10 דקות בכסף ב 200 וואט וכוח Au ב 100 וו כבה זהב גמגום מקור כ -10 שניות לפני כיבוי כסף גמגום מקור.
5. השג micropatterns המתכת המבשר
   1. Sonicate דגימות photoresist מצופים ב~ 180 מ"ל של חשפנית photoresist במשך 10 מחזורים של 20 שניות וsonication להשהות 2 דקות בין המחזורים. יש לשטוף את הדגימות עם מים די ולייבש עם אקדח חנקן. בדוק את דפוסי המתכת תחת מיקרוסקופ.
   2. קולפים את הסטנסיל אלסטומר מדגימות שאינן מצופים photoresist באמצעות שתי פינצטה כדי לחשוף את המתכת שהופקדה.
6. Dealloy מתכת מבשר וnanostructure שינוי דרך טיפול תרמי
   1. מלא כוס זכוכית 200 מ"ל עם 170 מ"ל של חומצה חנקתית (70%) ולשמור על טמפרטורת הפתרון על 55 מעלות צלזיוס על פלטה חמה. זהירות: החומצה חנקתית היא מאכל מאוד ויש לטפל בציוד מגן מתאים.
   2. פנק coverslips קטנה עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות לפני הטבילה בחומצה חנקתית. מקום 1 אינץ על ידי שקופיות מיקרוסקופ 3 אינץ לתוך הכוס באמצעות מלקחיים חומצה עמידים וdealloy במשך 15 דקות. השתמש בסירת immunostaining פורצלן לתצווה dealloying-coverslips קטנה.
   3. יש לשטוף את דגימות dealloyed על ידי השיקוע שלהם ברציפות בשתי כוסות מלאות במים די טריים שלוש פעמים. לאחסן דגימות במי DI ולהחליף את המים עם מים די טריים בכל יום במשך שבוע לפחות. דגימות מכה יבשות עם אקדח חנקן על מגבות ונטולות מוך לפני השימוש.
   4. טען דגימות על גבי פרוסות סיליקון נקיות בציוד לעיבוד תרמי מהיר. כוון את הטמפרטורה לבין 200 ° C ו -450 ° C ושיעור הרמפה עד 10 מעלות צלזיוס / שנייה. לחשוף את הדגימות לטמפרטורה שנקבעה למשך 10 דקות תחת חנקן הסביבה. בואו קאמרי מגניב (<100 ° C) ולהסיר את הדגימות. לחלופין, מניח את הדגימות לאט על הפלטה החמה לtreatm תרמיתאף אוזן גרון.

2. תרבית תאים

1. הכן את דגימות NP-Au לתרבית תאים
   1. דגימות מקום NP-Au בצלחות קלקר ולטפל עם אוויר בפלזמה 10 וואט למשך 30 שניות ולהעביר את הדגימות לצלחות תרבית רקמת 24 באר.
   2. הוסף 500 תקשורת התרבות שלמה μl (בינוני נשר שינוי Dulbecco של 10% בסרום שור העובר ו1% פניצילין סטרפטומיצין /) זה טוב. החנות בחממת humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד זריעת התאים (<1 שעות).
2. לשמור, מעבר, וזרע תאים
   1. שמור על תאים של עניין (במקרה זה fibroblasts 3T3-NIH או האסטרוציטים עכבריים) ב T75 צלוחיות עם תקשורת והתרבות ומעבר כאשר תאים הם 70% ומחוברות.
   2. לpassaging התאים, להסיר מדיה מהבקבוק, לשטוף פעמיים עם פוספט 10 מ"ל נאגר מלוח (PBS), להוסיף 2 מ"ל של 1x טריפסין / EDTA ו לדגור עד שהתאים לניתק (~ 5 דקות). הוסף 3 מ"ל ותקשורת טריצנטריפוגות ב -1,200 סל"ד במשך 3 דקות. לשאוב supernatant ולהשעות את גלולה ב2 מ"ל תקשורת.
   3. הסר את המדיה בילתה מהבארות ואת תאי הזרע על coverslips הזכוכית בצפיפות של 25,000 תאים / ² ס"מ עם נפח סופי של 1 מ"ל. לנער את צלחת התרבות קדימה אחורה וימין שמאל כדי להבטיח ציפוי אחיד של תאים על פני הדגימות. דגירה התאים עד לניתוח תוך בדיקה יומית.

3. תא וניתוח חומר

1. כתם תאים לדמיין שלד תא וגרעינים
   1. הסר תקשורת בילתה מבארות ולשטוף תאים פעמיים עם PBS. תקן תאי paraformaldehyde 4% ב-PBS למשך 15 דקות.
   2. הכן את הפתרון מכתים של 300 ננומטר אלקסה פלואוריד 488 phalloidin בPBS עם 1% אלבומין בסרום שור.
   3. שטוף תאים פעמיים עם PBS, וpermeabilize ב500 μl 0.1% טריטון X-100 ב PBS למשך 5 דקות.
   4. שטוף תאים פעמיים עם PBS ולהעביר אותם לניקוי בארות. כתם 50 - הפתרון מכתים μl 200 על הדגימות ולאחסן בחושך במשך 20 דקות.
   5. שטוף תאים עם PBS ונגד כתם עם 3 ננומטר של DAPI בPBS במשך 5 דקות.
   6. שטוף תאים עם PBS, ולטבול במי deionized לפני ההרכבה בשקופיות עם כיסוי זכוכית תקשורת הרכבה וחותם עם לק ברור.
2. לרכוש תמונות של דגימות NP-Au בתרביות תאים על משטחי NP-Au
   1. משטחי התמונה NP-Au עם סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם הגדלה X 50,000 באנרגית אלקטרון ק 10 באמצעות גלאי אלקטרונים משניים.
   2. צלם תמונות סלולריים מרוכבים בנקודות שונות על את הדגימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה 10X עם קוביות המסנן המתאימות.
3. תמונות תהליך כדי לקבוע מורפולוגיה נקבובית ותא
   1. פתיחת תמונות ב ImageJ ומחולק לערוצים נפרדים במידת צורך. להמיר את התמונות ל8 סיביות, לחסר רקע, וחלקם על ידי filteri חציוןng. התאם סף באופן ידני או על ידי מובנה thresholding אלגוריתמים כדי להדגיש את הנקבוביות (חללים) וגופי תא / גרעינים.
   2. השתמש בפקודת פרשת מים כדי להפריד נקבוביות או תאים ממוזגים. להגדיר את פרמטרי ניתוח חלקיקים ולבצע את הפקודה כדי לחלץ מספר החלקיקים, באזור הממוצע, וכן כיסוי אחוזים על ידי חלקיקים. השתמש בתמונות סלולריים DAPI מוכתמים לספירת תאים ותמונות תא phalloidin מוכתמת לכימות כיסוי תא אחוזים.
   3. לשנות את קבצי מאקרו שנכללו לבצע ניתוח אצווה של תמונות מרובות.

תוצאות

איור 1 מתאר את הצעדים פרוצדורליים הגדולים, כולל יצירת הדפוסים NP-Au, תאי culturing, כימות nanostructure, ואפיון מורפולוגיות סלולריים. סטנסיל אלסטומר שמוצג באיור 2 א (עליון) משמש ליצירת דפוסי NP-Au המוצגים בתמונות שמתחת. איור 2b הוא תצלום של סירת הפורצלן לדגי?...

Discussion

אנו מדגימים שתי טכניקות שונות לסרטי NP-Au micropattern להרחבת שימוש בסרטים האלה במיקרוסיסטמס ומחקרים ביולוגיים. זהב גמגום ציפוי וכסף הוא שיטה תכליתית ליצור דפוסי NP-Au, כמקרטע תואם את תהליכי microfabrication קונבנציונליים וסגסוגת בהרכב והעובי ניתן לשלוט בקלות על ידי שינוי סמכויות הא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals