Микротехнологий нанопористого Шаблоны золото для сотового материала исследования взаимодействия

Резюме

Мы сообщаем о методах micropattern нанопористых золото тонких пленок с помощью трафаретной печати и фотолитографии, а также методов культуры клеток на микроизготовленном узоров. Кроме того, мы опишем методы анализа изображений, чтобы охарактеризовать морфологию материала и культивируемые клетки с помощью сканирующей электронной и флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Наноструктурированных материалов с функцией размеров в десятки нанометров повысили производительность нескольких технологий, включая топливные элементы, биосенсоры, биомедицинские устройства покрытий, а также инструменты для доставки лекарств. Нанопористых золота (NP-Au) производства нано-процесса самосборки, является относительно новым материалом, который обладает большой эффективной площадью поверхности, высокой электропроводностью и каталитической активностью. Эти свойства сделали NP-Au привлекательным материалом для научного сообщества. Большинство исследований по NP-Au использовать макро-масштабе образцы и сосредоточить внимание на фундаментальную науку материала и его каталитические и датчик приложений. Макромасштабе образцов ограничить потенциальные NP-Au в миниатюрных систем, в том числе биомедицинских устройств. Для того, чтобы решить эти вопросы, мы изначально описывают два различных метода micropattern NP-Au тонких пленок на жестких носителях. Первый метод использует вручную производства трафаретов для создания масок миллиметрового масштаба NP-Au узоры, Whilе второе метод использует взрывной фотолитографии для формирования рисунка суб-миллиметрового масштаба модели. Как NP-Au тонкой пленки получаются методом распыления процесса осаждения, они совместимы с обычными методами микротехнологий, тем самым поддается легкому интеграции в Microsystems. Эти системы включают электрически адресацией биосенсоров платформ, благодаря высоким эффективная площадь поверхности, электропроводность, и золото-тиольными основе биоконъюгации поверхности. Опишем культуры клеток, иммунных и методы обработки изображений для количественной взаимодействие пр-Au с клетками млекопитающих, который является важным параметром производительность для некоторых биосенсоров. Мы ожидаем, что методы иллюстрируются здесь будет способствовать интеграции НП-Au в платформах на различных масштабах длины и в различных приложениях, в том числе биосенсоров, системы хранения энергии, и катализаторов.

Введение

Материалы с нано-функции показали обещание в повышении различных приложений, в том числе топливные элементы ¹, Датчики ^2,3 И биомедицинских устройств ^4,5. Относительно новый материал нанопористых золото (пр-Au), который получают путем нано-процесс самосборки. Предшественник пр-Au является сплава золота, которые наиболее часто состоит из серебра на 60% до 80% атомных процентах. Вкратце, характерные открытыми порами наноструктуры является результатом перегруппировки атомов золота в кластерах, как серебро растворяется сильной кислоты ( Например, Азотная кислота 70%) или под электрохимический потенциал ^6-8. Np-Au выгоды от нескольких желательных атрибутов, в том числе большой эффективной площадью поверхности, высокой электропроводностью, устоявшихся методов функционализации поверхности и биосовместимость ⁹. Хотя имело место быстрое расширение исследований по NP-Au, большинство из них сосредоточены на механические свойства NP-АС ^10,11, Каталитическая активность ¹², И биомолекулярных зондирования производительности ^13-15. В то время как желательные свойства очень полезны в течение нескольких биомедицинских инструментов ^16,17 Применение в этой области были ограничены. Одной из возможных причин этого является то, что большинство исследований преимущественно используются макромасштабе образцов ( Например, Листы, фольга, и слитки) и методы включения NP-Au в миниатюрных системах остаются недостаточными. На самом деле существует лишь несколько примеров с использованием обычных технологий, которые используют микротехнологий NP-Au фильмов ^16-20. С появлением технологии миниатюризации и потребность в новых биомедицинских инструментов, стало важным, чтобы иметь возможность интегрировать новых материалов в устройствах. Это обычно требует, чтобы материалы могут быть напылены и сформированы с обычными методами микротехнологии. Кроме того, быстрый количественной оценки клеточного материала взаимодействие обычно необходимо оценить биологическую совместимость нового материала. Целью данной статьи является демонстрация основных методов micropattern NP-Au фильмов и количественно и наноструктуры и клеточный материал взаимодействий с помощью цифровой обработки изображений.

протокол

1. Нанопористых Изготовление золота

1. Чистый субстратов в Piranha решение
   1. Добавить 25 мл перекиси водорода (30%) в 100 мл серной кислоты (96%) в чашке кристаллизации и смесь нагревают до 65 ° С на плите. ВНИМАНИЕ: жидкость чрезвычайно коррозии и должны быть обработаны с осторожностью. Отработанный раствор не следует хранить в плотно закрытой таре, так как она может взорваться.
   2. Место 1-дюймовый 3-дюймовые предметные стекла в смеси с использованием кислотостойких щипцов и очистить их в течение 10 мин. Использовать лодку фарфора иммуноокрашивания для пакетного очистки небольших покровные. Лечение небольшой покровные стекла с воздушной плазмы при 10 Вт в течение 30 с перед погружением в раствор.
   3. Промыть очищены образцов при кристаллизации блюда под проточной деионизированной (DI) воде в течение 3 мин. Сушить образцы с азотом пистолет над тканью без полотенца.
2. Подготовить трафарет маски (Метод 1: Использование этого для создания миллиметрового масштаба моделей)
   1. Удар 250 мкм толщиной силиконового эластомера листов с биопсией удары и / или надрезать из регионов со скальпелем над полутвердых пластиковой поверхности. Очистите обрабатываемых листов эластомера в 70% изопропанола и сухим азотом пистолет.
   2. Поместите перфорированный лист на безворсовой полотенце чистое помещение и выровняйте пираньи очисткой покровные по трафарету с образцом поверхности, обращенной к трафарет.
3. Pattern старт фоторезиста (Способ 2: Используйте это для создания суб-миллиметрового масштаба моделей)
   1. Наведите пираньи очисткой стекло микроскопа на спиннинг Чаком и сдуйте частицы азотом пистолет. Распределить 1,5 мл промотор адгезии (гексаметилдисилазана) на предметное стекло с помощью пластиковой пипетки. Распространение промоутер, крутя слайд последовательно при 500 оборотах в течение 5 секунд, 1500 оборотов в минуту в течение 30 сек. Выпекать слайда на плите при температуре 115 ° С в течение 7 мин и дайте ему остыть в течение 5 мин.
   2. Внесите 4 мл фоторезиста на стекле (3-дюймовый Bу 1-дюйм). Распространение фоторезиста, крутя слайд с тем же протоколом, для адгезии. Выпекать фоторезиста на плите при температуре 115 ° С в течение 1,5 мин и дайте ему остыть в течение 10 мин.
   3. Expose фоторезиста покрытием слайд с ультрафиолетовым светом (интенсивностью: 22 мВт / см ²⁾ через маску прозрачности на 15 сек. Выпекать фоторезиста на плите при температуре 115 ° С в течение 1,5 мин и ждать в течение 45 мин. Растворите фоторезиста подвергается в проявитель, по крайней мере 3,5 мин. Тщательно промыть водой DI. Проверьте разработана модель под оптическим микроскопом.
4. Депозит предшественников металлов для производства NP-Au тонких пленок
   1. Загрузите образцы в распылении машина, которая может независимо месторождения золота, серебра и хрома. Распылением очистить образцы в течение 90 сек при 50 Вт до 25 мторр атмосфере аргона обработки перед началом осаждения металла.
   2. Металлизированные хром течение 10 мин при 300 Вт при 10 мТорр аргона. Sputter золота в течение 90 сек при 400 Вт ООНдер 10 мторр аргона. Co-напылением золота и серебра в течение 10 мин с серебром на 200 Вт и Au мощности на 100 Вт Отключите источник золотого напыления около 10 секунд перед выключением серебра распылением источника.
5. Получить micropatterns предшественника металла
   1. Обрабатывают ультразвуком фоторезиста покрытием образцов в ~ 180 мл фоторезиста зачистки в течение 10 циклов по 20 сек ультразвуком и 2 мин пауза между циклами. Промыть образцов с деионизированной водой и сушат с азотом пистолета. Проверьте металл шаблонов под микроскопом.
   2. Пил эластомера трафарета от не-фоторезиста покрытых образцов с помощью двух пинцетов выявить осажденного металла.
6. Dealloy предшественника металла и модифицировать наноструктуры с помощью термической обработки
   1. Наполните 200 мл химический стакан на 170 мл азотной кислоты (70%) и поддерживают температуру раствора при 55 ° С на плите. ВНИМАНИЕ: азотной кислоты чрезвычайно коррозионных и должны быть обработаны соответствующими средствами защиты.
   2. Лечения небольших покровные воздушной плазмой на 10 Вт в течение 30 секунд перед погружением в азотную кислоту. Место 1 дюйм на 3 дюйма предметные стекла в стакан использованием кислотоупорной щипцов и dealloy их в течение 15 мин. Использовать лодку фарфора иммуноокрашивания для пакетной dealloying небольшой покровные.
   3. Промойте dealloyed образцы последовательно погружая их в два стакана с пресной водой DI три раза. Хранить образцов в деионизованной воде и заменить воду со свежей деионизированной воды каждый день в течение по крайней мере недели. Сушить образцы с азотом пистолет на безворсовой полотенца перед использованием.
   4. Загрузите образцы на чистую кремниевых пластин в быстрой термической обработки оборудования. Регулировка температуры в диапазоне от 200 ° C до 450 ° C и скорости нагрева 10 ° С / сек. Проэкспонируйте образцов заданной температуре в течение 10 мин в атмосфере азота в окружающую среду. Пусть камера прохладном (<100 ° C) и снимите образцов. Кроме того, медленно поместить образцы на конфорке для тепловой TreatmЛОР.

2. Культура клеток

1. Подготовьте NP-Au образцы для клеточной культуры
   1. Место NP-Au образцов полистирола блюда и обработать воздушной плазмы на 10 Вт в течение 30 сек и передачу образцов до 24-луночных культуральных планшетах.
   2. Добавить 500 мкл полной культуральной среде (модифицированная Дульбекко среда Игла с 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина) в каждую лунку. Хранить в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ до посева клеток (<1 час).
2. Поддерживать, прохождение, и семенной клетки
   1. Поддерживать интерес клетки (в данном случае 3T3-фибробласты NIH или мышиный астроциты) T75 в колбы с питательной среды и прохождения когда клетки 70% вырожденная.
   2. Для пассирования соты, удалить носитель из колбы, мыть дважды 10 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS), добавляют 2 мл 1x трипсин / ЭДТА и инкубировать пока клетки отсоединения (~ 5 мин). Добавьте 3 мл свежей среды ицентрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 3 минут. Супернатант и приостановить гранул в 2 мл среды.
   3. Удалить истощенных средах из лунок и семена клеток на покровных стеклах, при плотности 25000 клеток / см ² с до конечного объема 1 мл. Встряхнуть культуральный планшет вперед-назад и вправо-влево, чтобы гарантировать однородное нанесение клеток на образцах. Инкубируйте клетки до анализа при осмотре ежедневно.

3. Сотовые и Анализ материала

1. Пятно клетки для визуализации цитоскелета и ядра
   1. Удаления отработанного носителя из лунок и промыть клетки дважды с PBS. Fix клеток в 4% параформальдегид в PBS в течение 15 мин.
   2. Подготовка окрашивание раствора 300 нМ Alexa Fluor 488 фаллоидин в PBS с 1% бычьего сывороточного альбумина.
   3. Мытье клетки дважды с PBS, и проницаемыми их в 500 мкл 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 5 мин.
   4. Вымойте клетки дважды с PBS и передавать их для очистки скважин. Клякса 50 - 200 мкл окрашивающего раствора на образцах и хранить в темноте в течение 20 мин.
   5. Мытье клеток с PBS и контр-пятна с 3 нМ DAPI в PBS в течение 5 мин.
   6. Вымойте клеток с PBS, и опустите в деионизированной воде перед установкой на слайдах стеклянная крышка с монтажными средствами массовой информации и уплотнение с четкими лак для ногтей.
2. Получение изображений НП-Au образцов и клеточных культур на NP-Au поверхностей
   1. Изображение пр-Au поверхности с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) с 50000-кратным увеличением на 10 кВ энергии электронов использованием детектора вторичных электронов.
   2. Захват композитные изображения ячейки в разных местах на образцах с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа при 10-кратным увеличением с соответствующими светофильтрами.
3. Обработать изображения, чтобы определить пору и морфологии клеток
   1. Открытие изображений в ImageJ и разделяются на несколько отдельных каналов, если это применимо. Преобразовать образы в 8-битных, вычитания фона и сгладить их средний filteriнг. Отрегулируйте порог либо вручную, либо с помощью встроенного пороговых алгоритмов для выделения пор (пустот) и клеточных тел / ядер.
   2. Использование водоразделе команду для разделения объединенного поры или клеток. Установите параметры анализа частиц и выполнить команду для извлечения числа частиц, средняя площадь, и процент охвата частиц. Используйте DAPI-окрашенные изображения ячейку для подсчета клеток и фаллоидином окрашенные изображения клетки для количественного Процент охвата ячейки.
   3. Изменить включаемых файлов макросов выполнять пакетную анализ нескольких изображений.

Результаты

Рисунок 1 очерчиваются основные процедурные шаги, включая создание NP-Au узоры, культивирования клеток, количественной наноструктуры, и характеризующие морфологию клетки. Эластомер трафарета показано на рис 2а (вверху) используется для создания NP-Au моделей показано на ...

Обсуждение

Мы демонстрируем двух различных методов, чтобы micropattern NP-Au фильмов для расширения использования этих фильмов в Microsystems и биологических исследований. Распылением покрытие золото и серебро является универсальным методом для создания пр-Au узоров, как распыление, совместимый с обычными пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals