物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

要約

私たちは、ステンシル印刷やフォトリソグラフィーと同様、微細パターン上に培養細胞へのメソッドを経由して微細パターンナノポーラス金薄膜の技術について報告する。また、材料及び走査型電子顕微鏡、蛍光技術を用いて培養細胞の形態を特徴づける画像解析方法が記載されている。

要約

数十ナノメートルのフィーチャサイズを有するナノ構造材料は、燃料電池、バイオセンサー、生体医用器具​​用コーティング、および薬物送達ツールを含むいくつかの技術の性能を強化している。ナノスケールの自己組織化プロセスによって生成されたナノ多孔質金（NP-Auが）、大きな実効表面積、高い導電率、および触媒活性を示す比較的新しい材料である。これらのプロパティは、NP-Auのを科学界に魅力材料を作った。 NP-Auの上のほとんどの研究は、材料の基礎科学とその触媒とセンサアプリケーションにマクロスケール標本やフォーカスを採用しています。マクロスケール標本は生物医学デバイスを含む小型化システムにおけるNP-auの可能性を制限する。これらの問題に対処するために、我々は、最初に剛性基板上に微細パターンNP-Auの薄膜を2つの異なる方法が記載されている。最初の方法は、ミリスケールNP-Auのパターンを作成するための薬用手動生産ステンシルマスクを採用していますeは、第二の方法は、パターンのサブミリスケールパターンにリフトオフフォトリソグラフィーを使用しています。 NP-Auの薄膜をスパッタ堆積プロセスによって得られ、それらはマイクロへの容易な統合することにより適した従来の微細加工技術と互換性がある。これらのシステムは高い有効表面積の恩恵、電気伝導性、そして金 - チオール系表面バイオコンジュゲーションその電気的にアドレス可能なバイオセンサーのプラットフォームが含まれています。我々は、いくつかのバイオセンサーのための重要な性能パラメータである哺乳動物細胞でNP-Auからの対話を定量化するために、細胞培養、免疫染色し、画像処理技術を説明する。ここでは、図示の技法は、様々な長さスケールでのプラットフォームやバイオセンサー、エネルギー貯蔵システム、および触媒を含む多数の用途においてNP-Auを統合を支援することを期待している。

概要

材料は、燃料電池を含む様々なアプリケーションを高めるのに約束を示している ¹、センサー ^2,3、および生物医学装置 ^4,5。比較的新しい材料は、ナノスケールの自己組織化プロセスによって製造されるナノ多孔質金（NP-Au）である。 NP-Auの前駆体は、最も一般的に原子百分率が60％〜80％の銀で構成され、金合金である。銀は強酸によって溶解されるように簡単に説明すると、特徴的な開孔ナノ構造は、クラスタ内の金原子の再配列の結果である（例えば硝酸70％）又は電気化学ポテンシャルの下 ^6-8。大きな有効面積、高い導電率、十分に確立された表面機能化技術、および生体適合性を含むいくつかの望ましい属性から、NP-金給付 ⁹。 NP-Auの上の研究の急速な拡大、NP-auの機械的性質に焦点を当て、それらのほとんどがあったにもかかわらず、 ^10,11、触媒活性 ¹²、そして生体分子センシング性能 ^13-15。望ましい属性は、いくつかの生物医学的なツールのために非常に有用であるが ^16,17、この分野における用途が限られている。この理由の1つは、ほとんどの研究は、主にマクロスケール標本を使用している（例えばシート、ホイル、およびインゴット）と小型化システムでは、NP-Auのを組み込むための技術が不十分なままである。実際には、NP-Auの膜を用いる従来の微細加工技術の使用例のほんの一握りがある ^16-20。小型化技術と新規生物医学ツールの必要性の出現と、それはデバイスに新しい材料を統合できるようにすることが重要になってきている。これは通常、材料が堆積され、従来の微細加工技術を用いてパターニングすることができることを必要とする。また、細胞 - 材料の相互作用の迅速な定量化は、新しい材料の生体適合性を評価するために一般に必要である。本研究の目的は、微細NP-Auの膜への基本的な技術を示し、ナノ構造体及びディジタル画像処理を介して、細胞 - 材料の相互作用の両方を定量化することである。

プロトコル

1。ナノポーラス金の作製

1. ピラニア溶液中のクリーン基板
   1. 混合物をホットプレート上で65℃に結晶化皿および熱た100mlの硫酸（96％）を25ミリリットルの過酸化水素（30％）を追加します。注意：液体は極めて腐食性であり、慎重に取り扱わなければならない。それが爆発する可能性があるので使用済み溶液を、密封容器に保存されているべきではありません。
   2. 混合耐酸性ピンセットを用いて、10分間のためにそれらをきれいに3インチ顕微鏡スライドによって場所の1インチ。小さなカバースリップをバッチ洗浄のために磁器の免疫染色のボートを使用します。溶液中に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。
   3. 3分間脱イオン（DI）流水結晶皿にきれいにサンプルを洗浄します。糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。
2. （：ミリスケールのパターンを作成するためにこれを使用方法1）ステンシルマスクを準備
   1. パンチ生検パンチと250μmの厚さのシリコーンエラストマーシートおよび/または半硬質プラスチック表面上にメスで地域を切開。窒素銃でイソプロパノール、乾燥70％で処理されたエラストマーシートを清掃してください。
   2. リントフリークリーンルームタオルの上にパンチングシートを置き、ステンシルが直面している試料表面とステンシルオーバーピラニア洗浄をカバースリップを合わせます。
3. パターンリフトオフレジスト（方法2：サブミリスケールのパターンを作成するために使用します）
   1. チャックを回転にピラニア洗浄を顕微鏡スライドを置き、窒素銃で任意の粒子を吹き飛ばす。プラスチックピペットを用いてスライドガラス上に接着促進剤（ヘキサメチルジシラザン）1.5mlを分注する。 5秒、30秒のために1,500 rpmで500rpmで連続的にスライドを回転することによりプロモーターを広める。 7分間115℃のホットプレート上でスライドを焼いて5分間冷ます。
   2. スライドガラス上にフォトレジスト4mlのディスペンス（3インチByは1インチ）。接着促進剤の場合と同じプロトコルを使用してスライドを回転させてレジストを広げた。 1.5分間115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼くと10分間冷ます。
   3. 15秒のために透明マスクを介して：UV光でフォトレジストでコーティングされたスライド（22 MW / cm ^2と強度）を公開します。 1.5分間、115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼いて45分間待ちます。少なくとも3.5分間現像液に露光されたフォトレジストを溶解する。 DI水で十分に洗い流してください。光学顕微鏡下で開発されたパターンを点検します。
4. NP-Auの薄膜を製造するための前駆体の金属を堆積させる
   1. 独立して、金、銀、クロムを預けることができるスパッタ装置にサンプルをロードします。金属蒸着を開始する前に、25トルアルゴン処理雰囲気下、50 Wで90秒間のサンプルをスパッタクリーン。
   2. 10トルアルゴン下300 Wで10分間クロームスパッタ。 400 W国連で90秒間金をスパッタファンデ10トルアルゴン。 100 W.で200 WおよびAuパワーで銀と10分間、金と銀は、金、銀をオフにする前にソース約10秒スパッタ源をスパッタ切り共同スパッタ。
5. 前駆金属微細パターンを得る
   1. 20秒の超音波処理を10サイクルとサイクルの間に2分間の休止のためのフォトレジストストリッパーの〜180ミリリットルでフォトレジストでコーティングされたサンプルを超音波処理。 DI水でサンプルをすすぎ、窒素銃で乾燥させます。顕微鏡下で金属パターンを検査します。
   2. 堆積した金属を明らかにするために2つのピンセットを使用して非フォトレジスト被覆された試料からの剥離性エラストマーステンシル。
6. 熱処理経由Dealloy前駆金属および変更ナノ構造
   1. 硝酸（70％）170 mlのを200mlガラスビーカーを記入し、ホットプレート上で55℃に液温を維持する。注意：硝酸は非常に腐食性であり、適切な保護具を処理する必要があります。
   2. 硝酸に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。耐酸性ピンセットを用いてビーカーに置き、3インチ顕微鏡スライド1インチおよび15分のためにそれらをdealloy。バッチ脱合金小さなカバースリップ用磁器免疫染色のボートを使用してください。
   3. 順次新鮮なDI水で三回充填2ビーカーにそれらを浸漬することによりdealloyedサンプルをリンス。少なくとも1週間DI水のサンプルを保存し、毎日新鮮なDI水で水を交換してください。使用前に糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。
   4. 急速加熱処理装置におけるクリーンシリコンウェハー上にサンプルをロードする。 200°Cと450°Cとランプ速度との間に温度を調節10℃/秒。窒素雰囲気下で10分間所定の温度にサンプルを公開します。チャンバーは冷ます（<100℃）、サンプルを削除します。また、徐々に熱treatm用ホットプレート上のサンプルを配置ENT。

2。細胞培養

1. 細胞培養用NP-Auのサンプルを準備します
   1. ポリスチレンディッシュ内の場所NP-Auのサンプルを、30秒間10 Wで空気プラズマで処理し、24ウェル組織培養プレートにサンプルを移す。
   2. 各ウェルに500μlの完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを有する）を追加する。 37℃加湿インキュベーターに保管℃、細胞（<1時間）播種まで5％CO _2。
2. 維持するため、通路や種子細胞
   1. 培地、細胞が70％コンフルエントである経過とともにT75フラスコ中で目的の細胞（この場合は3T3-NIH線維芽細胞又はマウスアストロサイト）を維持する。
   2. 細胞を継代については、緩衝生理食塩水（PBS）を10mlのリン酸で二回洗い、フラスコからメディアを取り出し、細胞デタッチ（〜5分）まで、1×トリプシン/ EDTAとインキュベート2 mlを加える。 3ミリリットル新鮮な培地を追加し、3分間1,200 rpmで遠心。上清を吸引除去し、2 mlの培地中でペレットを中断します。
   3. 1ミリリットルの最終容量で25,000細胞/ cm ²の密度でカバーガラス上に井戸や種子細胞から過ごしたメディアを取り出します。サンプルの細胞の均一なコーティングを確保するために前進·バックと左右培養プレートを振る。毎日検査しながら分析まで細胞をインキュベート。

3。細胞と材料分析

1. 細胞骨格と核を可視化するために細胞を染色
   1. 井戸から過ごしたメディアを取り出し、PBSで細胞を2回洗浄する。 15分間PBS中4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
   2. 1％ウシ血清アルブミンを含むPBSで300 nMのアレクサフルーア488ファロイジンの染色溶液を調製。
   3. PBSで細胞を2回洗浄し、5分間PBSでトリトンX-100を500μlの0.1％それらを透過性。
   4. PBSで細胞を2回洗浄し、井戸をきれいにするために、それらを転送します。しみ50 - サンプルと20分間、暗所で店舗へ200μlの染色液。
   5. PBSで5分間PBS中DAPIの3 Nmのカウンター染色で細胞を洗浄します。
   6. PBSで細胞を洗浄し、クリアなマニキュアで取り付けメディアやシールでガラスカバースライド上にマウントする前に脱イオン水に浸す。
2. NP-Auの表面にNP-Auのサンプルと、細胞培養物の画像を取得する
   1. 画像NP-Auの二次電子検出器を使用して、10kVの電子エネルギーで50,000 Xの倍率で走査型電子顕微鏡（SEM）による表面。
   2. 適切なフィルタキューブで10倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡を用いてサンプル上の異なる箇所で複合セル画像をキャプチャします。
3. プロセスイメージは、毛穴や細胞形態を決定する
   1. ImageJのに該当する場合、個々のチャネルに分割オープン画像。 8ビットに画像を変換し、バックグラウンドを減算し、中央値filteriことによって、それらを滑らかにNG。手動または孔（ボイド）と細胞体/核を強調するためにアルゴリズムを閾値ビルトインによってしきい値を調整します。
   2. マージされた毛穴や細胞を分離するために流域コマンドを使用します。粒子解析パラメータを設定し、粒子による粒子、平均面積、およびパーセントカバレッジ数を抽出するためにコマンドを実行します。細胞計数およびパーセントセルカバレッジを定量化するためファロイジン染色細胞画像のDAPI染色細胞の画像を使用してください。
   3. 複数の画像を一括分析を実行するために含まれたマクロファイルを変更する。

結果

図1は 、培養細胞をNP-Auのパターンを作成するナノ構造を定量化し、細胞形態を特徴付ける含めて、主要な処理手順の概要を説明します。 図2aに示したエラストマーステンシル（上面）の下に画像に示すようにNP-Auのパターンを作成するために使用される。 図2bは、バッチ処理の試験片の磁器船の写真である。 図2cは、堆積された金属パター?...

ディスカッション

私たちは、マイクロシステムと生物学的研究におけるこれらのフィルムの使用を拡大するため微細NP-Auの膜には、2つの異なる技術を実証する。スパッタコーティング、金と銀は、スパッタリング、従来の微細加工プロセスと合金組成と厚さを簡単に個々のスパッタ銃のパワーを変化させることにより制御（金と銀の目標のために）とすることができますとの互換性があるように、NP-Auのパタ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals