Hücre-malzeme Etkileşim Araştırmalar Nanogözenekli Altın Patterns mikroimalat

Özet

Biz şablon baskı ve fotolitografi, hem de microfabricated desenleri kültür hücreleri yöntemleri ile micropattern nano altın ince filmler için teknikler hakkında rapor. Buna ek olarak, malzeme ve taramalı elektron ve floresan mikroskobu teknikleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi karakterize etmek için görüntü analiz yöntemleri açıklanmaktadır.

Özet

Nanometre onlarca özelliği boyutları ile nanoyapılar yakıt hücreleri, biyosensör, biyomedikal cihaz kaplamalar ve ilaç dağıtım araçları da dahil olmak üzere çeşitli teknolojileri, performansını geliştirmiştir. Bir nano ölçekli kendini montaj işlemi tarafından üretilen Nanogözenekli altın (NP-Au), geniş etkili yüzey alanı, yüksek elektrik iletkenliği ve katalitik aktivite sergileyen bir nispeten yeni bir malzemedir. Bu özellikler NP-Au bilimsel topluluk için çekici bir malzeme yaptık. NP-Au ile ilgili çalışmaların çoğu makro ölçekli örnekleri istihdam ve malzeme ve katalitik ve sensör uygulamaları temel bilim odaklanmak. Makro ölçekli örnekler biyomedikal cihaz da dahil olmak üzere minyatür sistemleri, NP-Au potansiyel sınırlar. Bu konuları ele için, başlangıçta sert yüzeylerde micropattern NP-Au ince filmler için iki farklı yöntem tarif. İlk yöntem, whil milimetre ölçekli NP-Au desenleri oluşturmak için elle üretilen şablon maskeler istihdame İkinci yöntem desen alt milimetre ölçekli desen havalanma fotolitografi kullanır. Np-Au ince filmler sıçramasına biriktirme işlemi ile elde edilir, onlar mikro içine basit entegrasyon böylece mükellef geleneksel imalat teknikleri, ile uyumludur. Bu sistemler yüksek etkili yüzey alanı, elektriksel iletkenlik ve altın-tiyol-esaslı yüzey bioconjugation gelen bu fayda elektrikle adresli biyosensör platformlar içerir. Bazı biyosensörler için önemli bir performans parametredir memeli hücreleri ile NP-Au etkileşimi ölçmek için hücre kültürü, immün ve görüntü işleme teknikleri anlatıyoruz. Burada gösterilen teknikleri çeşitli uzunluk-ölçeklerde ve biyosensörler, enerji depolama sistemleri ve katalizörler gibi birçok uygulamalarda platformlarda NP-Au entegrasyonu yardımcı olacağını bekliyoruz.

Giriş

Malzeme yakıt hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar, artırmada söz göstermiştir ¹, Sensörler ^2,3 Ve biyomedikal cihazlar ^4,5. Nispeten yeni malzeme bir nano ölçekli kendini montaj işlemi tarafından üretilen nano altın (NP-Au) vardır. NP-Au habercisi en sık atomik yüzde ile% 60 ila% 80 gümüş oluşan bir altın alaşımıdır. Kısaca, karakteristik açık gözenekli nano-gümüş kuvvetli bir asit ile çözülmüş olarak kümelerin altın atomlarının düzenlenmesi sonucudur ( Örneğin% 70 nitrik asit) veya bir elektrokimyasal potansiyeli altında ^6-8. Geniş etkili yüzey alanı dahil olmak üzere birçok arzu özellikleri, yüksek elektriksel iletkenlik, köklü yüzey işlevsellik teknikleri ve biyouyumluluk gelen NP-Au faydaları ⁹. NP-Au ile ilgili çalışmaların hızlı bir genişleme, NP-Au mekanik özellikleri odaklanmak çoğu olmuştur rağmen ^10,11, Katalitik aktivite ¹² Ve biyomoleküler algılama performansı ^13-15. Arzu edilen özellikleri çeşitli biyomedikal araçlar için son derece yararlı olsa da ^16,17, Bu alandaki uygulamalarda sınırlı olmuştur. Bu olası nedenlerinden biri, çoğu çalışmaların ağırlıklı olarak makro ölçekli örnekler kullanmış olan ( Örneğin Yaprak, folyo, ve külçe) ve minyatür sistemlerinde NP-Au içeren için teknikleri yetersiz kalmıştır. Aslında NP-Au filmler istihdam geleneksel imalat teknikleri kullanma örnekleri sadece bir avuç vardır ^16-20. Minyatür teknoloji ve yeni biyomedikal araçlar için ihtiyaç ile birlikte, bu cihazların içine yeni malzemeler entegre edebilmek için önemli hale gelmiştir. Bu, tipik olarak malzeme yatırılır ve bilinen imalat teknikleri ile desenli olabilir gerektirir. Buna ek olarak, hücre-malzeme etkileşimleri hızlı miktar yeni bir malzeme biyouyumluluk değerlendirmek için yaygın olarak gereklidir. Bu yazının amacı micropattern NP-Au filmlere temel teknikleri göstermek ve nanoyapı ve dijital görüntü işleme ile hücre-malzeme etkileşimleri hem ölçümüdür.

Protokol

1. Nanogözenekli Altın Fabrikasyon

1. Piranha çözüm temiz yüzeyler
   1. Bir kristalizasyon tabağına ve ısı ° C bir ocak 65 karışım, 100 ml sülfürik asit (% 96) 25 ml hidrojen peroksit (% 30) ilave edilir. DİKKAT: sıvılar son derece korozif ve dikkatle ele alınması gerekir. Bu patlayabilir gibi harcanan çözüm, kapalı bir kapta muhafaza edilmemelidir.
   2. Yer aside dayanıklı forseps ve 10 dakika boyunca bunları temizlemek kullanılarak karışımın içine 3 inç mikroskop 1-inç. Küçük lamelleri toplu temizlik için bir porselen immün tekne kullanın. Önce çözüm içine daldırma için 30 saniye boyunca 10 W hava plazma küçük lamelleri tedavi.
   3. 3 dakika deiyonize (DI) su altında kristalleşme yemekleri temizlenmelidir örnekleri durulayın. Tüysüz havlu üzerinde azot silahla darbe-kuru örnekleri.
2. Şablon maskesi (: milimetre ölçekli desenleri oluşturmak için bunu kullanın Yöntem 1) hazırlayın
   1. Biyopsi yumruklar ve / veya yumruk 250 mikron kalınlığında silikon elastomer levhalar yarı-sert plastik yüzey üzerinde bir neşter ile bölge dışarı insizyon. Azot silahla izopropanol ve kurutma 70% olarak işlenmiş elastomer yaprak temizleyin.
   2. Bir tüy bırakmayan temiz oda havlu üzerine delikli sac yerleştirin ve şablon bakan numune yüzeyi ile şablon üzerinde piranha-temizlenmelidir lamelleri hizalayın.
3. Desen kalkış ışığa (Yöntem 2: alt milimetre ölçekli desenleri oluşturmak için bunu kullanın)
   1. Chuck iplik üzerinde piranha-temizlenir mikroskop lamı yerleştirin ve azot tabanca ile herhangi bir parçacık kapalı darbe. Plastik bir pipet kullanarak cam slayt üzerine yapışma organizatörü (hekzametildisilazan) 1.5 ml dağıtın. 30 saniye 5 sn ve 1.500 rpm 500 rpm arda slayt iplik organizatörü yayıldı. 7 dakika 115 ° C de bir ocak slayt pişirin ve 5 dakika soğumasını bekleyin.
   2. Cam slayt üzerine ışığa 4 ml (3-inç b dağıtmaky 1 inç). Yapıştırma promoteri için aynı protokol ile slayt iplik fotorezist yayıldı. 1.5 dakika 115 ° C de bir ocak ışığa pişirin ve 10 dakika soğumasını bekleyin.
   3. 15 saniye için bir saydamlık maskesi ile: UV ışığı ile ışığa kaplı slayt (22 mW / cm ² yoğunluğu) Açığa. 1.5 dakika boyunca, 115 ° C 'de bir ocak üzerinde ışığa fırında ve 45 dakika boyunca bekleyin. En az 3,5 dakika için geliştirici olarak ışığa maruz çözülür. DI su ile iyice durulayın. Bir optik mikroskop altında geliştirilmiş modelleri kontrol edin.
4. NP-Au ince filmler üretmek için Mevduat habercisi metaller
   1. Bağımsız altın, gümüş ve krom yatırabilirsiniz bir püskürtme makinesi haline örnekleri yükleyin. Metal birikimi başlamadan önce 25 mTorr argon işleme atmosferi altında 50 W 90 sn için örnekler sıçramasına temizleyin.
   2. 10 mTorr argon altında 300 W 10 dakika krom Sputter. 400 W un az 90 saniye altın Sputterder 10 mTorr argon. Altın gümüş kapatmadan önce kaynak yaklaşık 10 sn sıçramasına kapatın 100 W. 200 W ve Au güçte gümüş ile 10 dakika altın ve gümüş ortak sıçramasına kaynak sıçramasına.
5. Habercisi metal micropatterns elde
   1. 20 sn Sonication 10 döngüleri ve döngüleri arasında 2 dakika duraklama için ışığa striptizci ~ 180 ml ışığa kaplı örnekleri sonikasyon. DI suyla yıkayın ve numuneler bir azot tabancası ile kurutun. Mikroskop altında metal kalıpları kontrol edin.
   2. Tevdi metal ortaya çıkarmak için iki cımbız kullanarak olmayan fotorezist kaplı örneklerinden elastomer şablon Peel.
6. Isıl işlem ile Dealloy habercisi metal ve değiştirmek nano
   1. Nitrik asit (% 70) 170 ml 'si ile, 200 ml'lik bir cam kabın doldurun ve bir ocak üzerinde 55 ° C'de çözelti sıcaklığı korur. DİKKAT: nitrik asit son derece korozif ve uygun koruyucu ekipman ile ele alınmalıdır.
   2. Önce nitrik asit içine daldırma için 30 saniye boyunca 10 W hava plazma küçük lamelleri tedavi. Aside dayanıklı forseps kullanarak beher içine 3-inç mikroskop slaytlar yerinde 1 inç ve dealloy onlar 15 dakika. Küçük lamelleri toplu Bozunumu için bir porselen immün tekne kullanın.
   3. Arda taze DI su ile üç kez dolu iki bardak bunları daldırarak dealloyed örnekleri durulayın. DI su örnekleri Mağaza ve en az bir hafta boyunca her gün taze DI su ile su değiştirin. Kullanmadan önce tüysüz havlu üzerinde azot silahla darbe-kuru örnekleri.
   4. Hızlı bir termal işleme ekipmanları temiz bir silikon yonga üzerine örnekler yükleyin. 200 ° C ile 450 ° C ve yükselme oranı arasındaki için sıcaklık ayarlama ile 10 ° C / sn. Nitrojen altında, ortam 10 dakika için öngörülen sıcaklığa örnekleri Açığa. Odası soğumasını bekleyin (<100 ° C) ve örnekleri çıkarın. Alternatif olarak, yavaş yavaş termal treatm için ocak örnekleri yerent.

2. Hücre Kültürü

1. Hücre kültürü için NP-Au örnekleri hazırlayın
   1. Yeri NP-Au polistiren yemekleri örnekleri ve 30 saniye boyunca 10 W hava plazma ile tedavi ve 24-iyi doku kültürü plakaları için örnekleri aktarın.
   2. Her kuyuya 500 ul komple kültür ortamında (% 10 fetal bovin serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı) ekleyin. 37 nemlendirilmiş bir inkübatör mağaza ° C ve hücreleri (<1 saat) tohum kadar% 5 CO _2.
2. Koruyun, geçit ve tohum hücreleri
   1. Kültür ortamı ve hücreler 70% konfluent geçişi ile T75 şişeler ilgi hücreleri (bu durumda 3T3-NIH fibroblast veya fare astrositler) koruyun.
   2. Hücrelerin pasajlanmasını için, şişeyi ortam çıkarın, 10 ml fosfat ile iki kez yıkayın tuzlu su (PBS), hücreleri ayırmak (~ 5 dakika) kadar 1x tripsin / EDTA ve inkübe 2 ml tampon. 3 ml taze medya ekleyin ve3 dakika 1.200 rpm'de santrifüj. Süpernatant aspire ve 2 ml medya pelet askıya.
   3. Kuyuları ve tohum 25,000 hücre / 1 ml nihai hacim ile ² cm 'lik bir yoğunlukta cam lameller üzerine hücrelerde harcanan ortam çıkarın. Örnekleri üzerinde hücre tek tip kaplama sağlamak için ileri-geri ve sağ-sol kültür plaka çalkalayın. Günlük teftiş ederken analizi kadar hücreleri inkübe edin.

3. Hücre ve Malzeme Analizi

1. Hücre iskeleti ve çekirdekleri görselleştirmek için hücreleri leke
   1. Kuyulardan geçirdi ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez hücreleri yıkayın. 15 dakika boyunca PBS içinde% 4 paraformaldehid hücreleri saptamak.
   2. % 1 sığır serumu albümini ile PBS içinde 300 nM, Alexa Fluor 488 falloidin arasında boyama çözeltisi hazırlayın.
   3. Iki kez PBS ile yıkayın hücreleri, ve 5 dakika boyunca 500 ul PBS% 0.1 Triton X-100, bunları geçirgenliği.
   4. PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve kuyu temizlemek için aktarabilirsiniz. Blot 50-20 dakika boyunca örnekleri ve karanlıkta mağaza üzerine 200 ul renk veren bir solüsyonun.
   5. PBS ve 5 dakika boyunca PBS içinde DAPI 3 nM karşı leke hücreleri yıkayın.
   6. PBS ile hücreleri yıkayın ve şeffaf tırnak cilası ile montaj medya ve mühür ile cam kapak slaytlar monte etmeden önce deiyonize su daldırma.
2. NP-Au yüzeylerde NP-Au örnekleri ve hücre kültürlerinin görüntüler elde
   1. Resim NP-Au ikincil elektron dedektörü kullanılarak 10 kV elektron enerji az 50.000 X büyütme ile elektron mikroskobu (SEM) ile yüzeyler.
   2. Uygun filtre küpleri ile 10X büyütme ters bir floresan mikroskop kullanılarak numuneler üzerinde farklı noktalarda kompozit hücre görüntüler yakalayın.
3. Süreç görüntüleri gözenek ve hücre morfolojisi belirlemek için
   1. ImageJ ve varsa her kanal bölünmüş Açık görüntüleri. 8-bit görüntüleri dönüştürmek, arka plan çıkarma ve medyan filtreleri Karşılaştır bunları düzeltmekng. El ile veya gözenekler (boşluklar) ve hücre gövdeleri / çekirdekleri vurgulamak için algoritmaları eşikleme yerleşik tarafından eşik ayarlayın.
   2. Birleştirilmiş gözenekleri veya hücre ayrı havza komutunu kullanın. Parçacık analiz parametreleri ayarlayın ve parçacıklar tarafından parçacıklar, ortalama alan ve yüzde kapsama sayısı ayıklamak için komutu çalıştırmak. Yüzde hücre kapsama ölçülmesi için hücre sayımı ve Phalloidin-lekeli hücre görüntüler için DAPI-lekeli hücre görüntüleri kullanın.
   3. Birden fazla görüntü toplu analizi gerçekleştirmek için dahil makro dosyaları değiştirin.

Sonuçlar

Şekil 1,, kültür hücreleri np-Au desenleri oluşturmak nano miktarının, ve hücre morfolojileri karakterize dahil olmak üzere, büyük prosedür adımları açıklar. Şekil 2a'da gösterildiği gibi elastomer şablon (üst) altına resimlerde gösterildiği NP-Au desen oluşturmak için kullanılır. Şekil 2b, toplu işlem numuneler için porselen kap bir fotoğrafıdır. Şekil 2c, kaplama metal desen renk değişimi gösterir öncesi ve B...

Tartışmalar

Biz mikro ve biyolojik çalışmalar bu filmlerin kullanımı genişletmek için micropattern NP-Au film için iki farklı teknikleri göstermek. Sıçramasına kaplama altın ve gümüş püskürtme Klasik imalat süreçleri ve alaşım bileşimi ve kalınlığı kolayca tek tek püskürtme tabancası güçleri değişen tarafından kontrol (altın ve gümüş hedefleri için) ve edilebilir ile uyumlu olarak, NP-Au desenleri oluşturmak için çok yönlü bir yöntemdir sırasıyla depozisyon süresi. Tipik NP-Au filmi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals