Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Zusammenfassung

Wir berichten über Techniken zur Mikrostruktur nanoporöse Gold Dünnschichten durch Schablonendruck und Photolithographie, sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf den mikrofabrizierten Muster. Darüber hinaus beschreiben wir Bildanalysemethoden der Morphologie des Materials und der kultivierten Zellen mit dem Rasterelektronenmikroskop und Fluoreszenzmikroskopie zu charakterisieren.

Zusammenfassung

Nanostrukturierte Materialien mit Strukturgrößen in zehn Nanometern haben die Leistung von mehreren Technologien, einschließlich Brennstoffzellen, Biosensoren, biomedizinischen Beschichtungen und Drug-Delivery-Tools erweitert. Nanoporöse Gold (np-Au), durch eine Nano-Self-Assembly-Verfahren hergestellt, ist ein relativ neues Material, das großen wirksamen Oberfläche, hohe elektrische Leitfähigkeit und katalytische Aktivität aufweist. Diese Eigenschaften haben np-Au ein attraktives Material für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Die meisten Studien auf np-Au beschäftigen Makroebene Proben und konzentrieren sich auf die Grundlagenforschung des Materials und seiner katalytischen und Sensor-Anwendungen. Die Makro-Skala Exemplare begrenzen np-Au Potenzial in miniaturisierten Systemen, einschließlich biomedizinische Geräte. Um diese Probleme anzugehen, haben wir zunächst beschreiben zwei verschiedene Methoden zur Mikrostruktur np-Au Dünnschichten auf starren Substraten. Die erste Methode beschäftigt manuell hergestellt Stencilmasken zum Erstellen Millimeter-Skala np-Au-Muster, while die zweite Methode verwendet lift-off Photolithographie Muster Sub-Millimeter-Skala-Muster. Da die np-Au Dünnschichten durch Sputter-Abscheidung erhalten werden, sind sie kompatibel mit herkömmlichen Mikrofabrikationstechniken, wodurch zugänglich facile Integration in Mikrosysteme. Diese Systeme umfassen elektrisch adressierbaren Biosensorplattformen profitieren vom hohen effektiven Oberfläche, die elektrische Leitfähigkeit und Gold-Thiol-basierte Oberfläche Biokonjugation. Wir beschreiben Zellkultur, Immunfärbung und Bildverarbeitung Techniken np-Au Interaktion mit Säugerzellen, die ein wichtiger Performance-Parameter für einige Biosensoren ist zu quantifizieren. Wir erwarten, dass die hier dargestellten Techniken wird die Integration von np-Au in Plattformen unterstützen auf verschiedenen Längenskalen und in zahlreichen Anwendungen, einschließlich Biosensoren, Energiespeicher und Katalysatoren.

Einleitung

Materialien mit nanoskaligen Eigenschaften haben Versprechen in Weiterentwicklung von verschiedenen Anwendungen, einschließlich Brennstoffzellen gezeigt ¹, Sensoren ^2,3 Und biomedizinische Geräte ^4,5. Ein relativ neues Material nanoporöse Gold (Au-np), die durch eine nanoskalige Selbstorganisation hergestellt wird. Der Vorläufer np-Au ist eine Goldlegierung, die am häufigsten aus Silber bei 60% bis 80% bezogen auf Atomprozent. Kurz gesagt, ist die charakteristische offenporigen Nanostruktur das Ergebnis der Neuordnung der Goldatome in Clustern als Silber mit einer starken Säure aufgelöst wird ( ZB Salpetersäure 70%) oder in einem elektrochemischen Potenzial ^6-8. Np-Au Nutzen verschiedener wünschenswerte Eigenschaften, einschließlich der großen effektiven Oberfläche, eine hohe elektrische Leitfähigkeit, etablierte Oberfläche Funktionalisierungstechniken und Biokompatibilität ⁹. Auch wenn es eine schnelle Ausweitung der Studien auf np-Au, die meisten von ihnen auf die mechanischen Eigenschaften np-Au Konzentrieren ^10,11, Katalytische Aktivität ¹² Und molekularbiologische Erfassungsleistung ^13-15. Während die wünschenswerte Eigenschaften sind sehr nützlich für verschiedene biomedizinische Werkzeuge ^16,17 Haben die Anwendungen in diesem Bereich begrenzt. Ein möglicher Grund dafür ist, dass die meisten Studien haben überwiegend Makroebene Proben verwendet ( ZB Der Bleche, Folien und Barren) und die Techniken zur Einarbeitung np-Au in miniaturisierten Systemen blieben unzureichend. In der Tat gibt es nur eine Handvoll Beispiele für die Verwendung herkömmlicher Mikrofabrikationstechniken die np-Au Filme beschäftigen ^16-20. Mit dem Aufkommen der Technologie Miniaturisierung und die Notwendigkeit für neue biomedizinische Tools, hat es von entscheidender Bedeutung, um in der Lage sein, um neue Materialien in die Geräte zu integrieren. Dies erfordert in der Regel, dass die Materialien aufgebracht und strukturiert werden können mit herkömmlichen Mikrofabrikationstechniken. Außerdem ist eine schnelle Quantifizierung von Zellmaterial Wechselwirkungen häufig notwendig, die Biokompatibilität eines neuen Materials zu bewerten. Das Ziel dieser Arbeit ist es, grundlegende Techniken zur Mikrostruktur np-Au Filme zeigen und zu quantifizieren sowohl Nanostruktur und Zell-Material-Wechselwirkungen über digitale Bildverarbeitung.

Protokoll

1. Gold-Fabrication Nanoporöse

1. Saubere Substrate in Piranha-Lösung
   1. In 25 ml Wasserstoffperoxid (30%) auf 100 ml Schwefelsäure (96%) in einem Kristallisationsschale und die Mischung auf 65 ° C auf einer Heizplatte. ACHTUNG: Die Flüssigkeiten sind extrem ätzend und muss mit Vorsicht behandelt werden. Die verbrauchte Lösung sollte nicht in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt werden, da sie explodieren können.
   2. Platz 1-Zoll mit 3-Zoll-Objektträgern in die Mischung unter Verwendung von Säure-resistenten Pinzette und reinigen Sie sie für 10 min. Verwenden Sie eine Porzellan Immunfärbung Boot für Batch-Reinigung von kleinen Deckgläschen. Gönnen kleine Deckgläschen mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 Sekunden vor dem Eintauchen in die Lösung.
   3. Spülen Sie die gereinigten Proben in Kristallisation Geschirr unter fließendem deionisiertem (DI) Wasser für 3 min. Föhnen Proben mit einem Stickstoff-Gewehr über fusselfreien Handtücher.
2. Bereiten Stencilmaske (Methode 1: Verwenden Sie diese Funktion zum Erstellen von Millimeter-Skala-Muster)
   1. Punch-250 um dicken Siliconelastomerfolien mit Biopsieausstanzungen und / oder einzuschneiden out-Regionen mit einem Skalpell über eine semi-harten Kunststoff-Oberfläche. Reinigen Sie die verarbeiteten Elastomerplatten in 70% Isopropanol und mit Stickstoff trocken gun.
   2. Legen Sie das Lochblech auf einem fusselfreien Handtuch Reinraum und richten Sie die Piranha-gereinigt Deckgläsern über die Schablone mit der Probenoberfläche mit Blick auf die Schablone.
3. Muster Lift-off-Fotolack (Methode 2: Verwenden Sie diese Funktion zum Erstellen von Sub-Millimeter-Skala-Muster)
   1. Legen Sie eine Piranha-gereinigt Objektträger auf Drückfutter und blasen Sie alle Partikel mit Stickstoff gun. Teststreifen 1,5 ml Haftvermittler (Hexamethyldisilazan) auf die Objektträger mit einem Kunststoff-Pipette. Verbreiten der Promotor durch Drehen der Folie nacheinander bei 500 UpM für 5 sec und 1500 rpm für 30 Sekunden. Backen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 7 min und abkühlen lassen für 5 min.
   2. Dosieren 4 ml Photoresists auf dem Glasträger (3-Zoll-by 1-inch). Verbreiten des Photoresists durch Drehen der Folie mit dem gleichen Protokoll wie für den Haftvermittler. Backen Sie den Fotolack auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 1,5 min und abkühlen lassen für 10 min.
   3. Freilegen Photoresist beschichteten Folie mit UV-Licht (Intensität: 22 mW / cm ²⁾ durch eine Transparenz-Maske für 15 Sekunden. Backen Sie den Fotolack auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 1,5 min, und warten Sie 45 min. Man löst den Fotolack belichtet in den Entwickler für mindestens 3,5 min. Gründlich mit DI-Wasser. Überprüfen Sie die entwickelten Muster unter einem optischen Mikroskop.
4. Kaution Vorläufer Metalle np-Au dünne Filme produzieren
   1. Legen Sie die Proben in einem Sputter-Maschine, die unabhängig hinterlegen kann Gold, Silber und Chrom. Sputter-Reinigen Sie die Proben für 90 sec bei 50 W unter 25 Torr Argon Verarbeitung Atmosphäre bevor Metallabscheidung.
   2. Sputter Chrom für 10 min bei 300 W unter 10 Torr Argon. Sputter Gold für 90 Sekunden bei 400 W under 10 Torr Argon. Co-Sputter-Gold und Silber für 10 min mit Silber bei 200 W und Au Macht bei 100 W. Schalten Gold Sputter-Quelle ca. 10 sec vor dem Ausschalten des Silber Sputter-Quelle.
5. Erhalten Vorläufermetalls Mikrostrukturen
   1. Beschallen Fotolack beschichteten Proben in ~ 180 ml aus Fotolack Stripperin für 10 Zyklen von 20 sec und 2 min Beschallung Pause zwischen den Zyklen. Spülen Sie die Proben mit DI-Wasser und trocknen Sie mit einem Stickstoff-gun. Überprüfen Sie die Metall-Muster unter dem Mikroskop.
   2. Schälen Sie die Elastomer Schablone aus Nicht-Fotolack beschichteten Proben mit zwei Pinzetten, um das abgeschiedene Metall offenbaren.
6. Dealloy Vorläufer Metall und modify Nanostruktur durch thermische Behandlung
   1. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 170 ml Salpetersäure (70%) und halten die Temperatur der Lösung bei 55 ° C auf einer Heizplatte. ACHTUNG: Die Salpetersäure ist stark ätzend und sollten mit geeigneter Schutzausrüstung gehandhabt werden.
   2. Gönnen kleine Deckgläschen mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 Sekunden vor dem Eintauchen in Salpetersäure. Platz 1-Zoll mit 3-Zoll-Objektträgern in das Becherglas mit säurebeständigen Pinzette und dealloy sie für 15 min. Verwenden Sie eine Porzellan Immunfärbung Boot für Batch-Legierungsauflösung kleine Deckgläschen.
   3. Spülen Sie die dealloyed Proben durch sukzessives Eintauchen in zwei Becher mit frischem Wasser gefüllt DI dreimal. Lagern Sie die Proben in DI-Wasser und ersetzen Sie das Wasser mit frischem DI-Wasser jeden Tag für mindestens eine Woche. Föhnen Proben mit einem Stickstoff-Gewehr über fusselfreien Tücher vor dem Gebrauch.
   4. Legen Proben auf einem sauberen Silizium-Wafer in einem Rapid Thermal Processing Equipment. Stellen Sie die Temperatur zwischen 200 ° C und 450 ° C und die Rampe auf 10 ° C / sec. Expose der Proben auf die vorgeschriebene Temperatur für 10 min unter Stickstoffatmosphäre. Lassen Sie die Kammer kühl (<100 ° C) und entfernen Sie die Proben. Alternativ legen Sie die Proben langsam auf der Heizplatte zur thermischen treatmENT.

2. Cell Culture

1. Bereiten np-Au Proben für die Zellkultur
   1. Platz np-Au Proben in Polystyrol Gerichte und behandeln mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 s und übertragen Sie die Proben bis zum 24-well-Zellkulturplatten.
   2. In 500 ul komplette Kulturmedien (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in jede Vertiefung. Shop in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ bis Aussäen der Zellen (<1 h).
2. Pflegen, Passage, und Samenzellen
   1. Pflegen Zellen von Interesse (in diesem Fall 3T3-Fibroblasten NIH oder murine Astrozyten) in T75-Flaschen mit Nährmedien und Passage, wenn die Zellen 70% konfluent sind.
   2. Für Passagieren der Zellen entfernen Medien aus dem Kolben, zweimal waschen mit 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 ml 1x Trypsin / EDTA und Inkubation bis die Zellen detach (~ 5 min). In 3 ml frisches Medium undZentrifuge bei 1.200 rpm für 3 min. Saugen Sie den Überstand und setzt das Pellet in 2 ml Medium.
   3. Entfernen Sie die verbrauchte Medien aus den Vertiefungen und Samen die Zellen auf den Deckgläsern in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm ² mit einem Endvolumen von 1 ml. Schütteln Sie die Kultur Platte vorwärts-rückwärts und rechts-links, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellen über die Proben zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen bis zur Analyse bei der Inspektion täglich.

3. Zell-und Materialanalyse

1. Stain Zellen Zytoskeletts und Kerne visualisieren
   1. Entfernen verbrauchte Medium aus den Vertiefungen und wäscht die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min.
   2. Bereiten Färbelösung von 300 nM Alexa Fluor 488 Phalloidin in PBS mit 1% Rinderserumalbumin.
   3. Waschen der Zellen zweimal mit PBS permeabilisiert und sie in 500 ul 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min.
   4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und übergeben sie an Brunnen reinigen. Blot 50-200 ul Färbelösung auf die Proben und nur im Dunkeln für 20 min.
   5. Waschen der Zellen mit PBS und Gegenfärbung mit 3 nM DAPI in PBS für 5 min.
   6. Waschen der Zellen mit PBS, und tauchen in entionisiertem Wasser vor der Montage auf Glas Abdeckung gleitet mit Montageplatte Medien und Dichtung mit klarem Nagellack.
2. Erwerben Sie Bilder von np-Au Proben und Zellkulturen auf np-Au Oberflächen
   1. Bild np-Au Oberflächen mit Rasterelektronenmikroskop (SEM) mit 50.000-facher Vergrößerung bei 10 kV Elektronenenergie mit Sekundärelektronen-Detektor.
   2. Erfassen Verbundzelle Bilder an verschiedenen Stellen auf den Proben unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit den entsprechenden Filter Würfel schneiden.
3. Bild bearbeiten, um festzustellen, Poren-und Zellmorphologie
   1. Öffnen von Bildern in ImageJ und aufgeteilt in einzelne Kanäle falls zutreffend. Konvertieren Sie die Bilder auf 8-bit, subtrahieren Sie den Hintergrund und glätten sie durch Median filtering. Stellen Schwelle entweder manuell oder durch eingebaute Schwellwertbildung Algorithmen, um die Poren (Hohlräume) und Zellkörper / Kerne zu markieren.
   2. Verwenden Wasserscheide Befehl fusionierten Poren oder Zellen zu trennen. Set Partikelanalytik Parameter und führen Sie den Befehl auf die Anzahl der Teilchen, durchschnittliche Fläche und Prozent Deckung durch Partikel zu extrahieren. Verwenden DAPI-gefärbte Zelle Bilder zur Zellzählung und Phalloidin-gefärbte Zelle Bilder zur Quantifizierung Prozent Netzabdeckung.
   3. Ändern Sie die enthaltenen Dateien auf Makro-Batch-Analyse von mehreren Bildern durchzuführen.

Ergebnisse

Abbildung 1 fasst die wichtigsten Verfahrensschritte, einschließlich der Erstellung der np-Au-Muster, das Kultivieren von Zellen, die Quantifizierung der Nanostruktur und Charakterisierung Zellmorphologien. Das Elastomer Schablone in 2a gezeigt (oben) ist für die Erstellung der np-Au-Muster in den Bildern unten gezeigt werden. 2b ist ein Foto von der Porzellan-Boot für die Batch-Verarbeitung Proben. Abbildung 2c zeigt die Farbänderung der abgeschied...

Diskussion

Wir zeigen zwei verschiedene Techniken, um Mikrostruktur np-Au Filme für den Ausbau der Nutzung dieser Filme in der Mikrosystemtechnik und biologische Studien. Sputter-Beschichtung Gold und Silber ist eine vielseitige Methode, um np-Au-Muster zu erstellen, wie Sputtern ist kompatibel mit konventionellen microfabrication Prozesse und die Legierung Zusammensetzung und Dicke leicht durch Variation der einzelnen Sputterkanone Mächten gesteuert werden kann (für Gold-und Silber-Ziele) und die Abscheidung jeweils. Typische ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals