Microfabrication de Patterns d'or nanoporeux d'études sur l'interaction cellule-matériau

Résumé

Nous rapportons sur les techniques à micromotif nanoporeux films minces d'or via l'impression par stencil et la photolithographie, ainsi que des méthodes pour cultiver des cellules sur les modèles micro-usinés. En outre, nous décrivons des méthodes d'analyse d'images pour caractériser la morphologie du matériau et des cellules cultivées à l'aide électronique à balayage et les techniques de microscopie à fluorescence.

Résumé

Les matériaux nanostructurés avec des tailles de fond dans des dizaines de nanomètres ont amélioré la performance de plusieurs technologies, y compris les piles à combustible, les biocapteurs, les revêtements d'appareils biomédicaux et les outils d'administration de médicaments. Or nanoporeux (np-Au), produite par un processus d'auto-assemblage de nano-échelle, est un matériau relativement nouveau qui présente une grande surface effective, une conductivité électrique élevée, et l'activité catalytique. Ces propriétés ont fait np-Au un matériau intéressant pour la communauté scientifique. La plupart des études sur np-Au emploient spécimens macro-échelle et de se concentrer sur la science fondamentale de la matière et ses applications catalytiques et le capteur. Les spécimens macro-échelle limitent le potentiel de np-Au dans les systèmes miniaturisés, y compris les appareils biomédicaux. Afin de répondre à ces questions, nous décrivons d'abord deux méthodes différentes pour micromotif np-Au couches minces sur des substrats rigides. La première méthode utilise des masques pochoir produits manuellement pour créer l'échelle millimétrique np-Au modèles, tout en recueillante la seconde méthode utilise lift-off photolithographie pour motif motifs sub-millimétrique échelle. Comme les films minces np-Au sont obtenus par un procédé de pulvérisation-dépôt, ils sont compatibles avec les techniques de microfabrication conventionnelles, ce qui se prêtent à l'intégration facile dans des microsystèmes. Ces systèmes comprennent électriquement adressables plateformes de biocapteurs qui bénéficient d'une grande zone efficace de la surface, la conductivité électrique, et bioconjugaison de surface à base de thiol-or. Nous décrivons la culture cellulaire, immunologique, et des techniques de traitement d'images pour quantifier l'interaction np-Au avec des cellules de mammifères, ce qui est un paramètre important de la performance pour certains biocapteurs. Nous nous attendons à ce que les techniques illustrées ici vont faciliter l'intégration des np-Au dans les plates-formes à différentes échelles de longueur et dans de nombreuses applications, y compris des biocapteurs, des systèmes de stockage d'énergie, et des catalyseurs.

Introduction

Matériaux avec des fonctionnalités nano-échelle ont montré des résultats prometteurs dans l'amélioration de diverses applications, y compris les piles à combustible ¹ Capteurs, ^2,3 Et dispositifs biomédicaux ^4,5. Un nouveau matériau est relativement or nanoporeux (np-Au), qui est produite par un procédé d'auto-assemblage à l'échelle nanométrique. Le précurseur de np-Au est un alliage d'or qui se compose le plus souvent de l'argent de 60% à 80% en pourcentage atomique. En bref, la nanostructure à pores ouverts caractéristique est le résultat d'un réarrangement d'atomes d'or dans les amas comme l'argent est dissous par un acide fort ( Par exemple Acide nitrique à 70%) ou en vertu d'un potentiel électrochimique ^6-8. Np-Au bénéficie de plusieurs attributs souhaitables, y compris une grande surface efficace et de haute conductivité électrique, les techniques de fonctionnalisation surface bien établies, et la biocompatibilité ⁹. Même si il ya eu une expansion rapide des études sur np-Au, la plupart d'entre eux se concentrer sur les propriétés mécaniques de np-Au ^10,11, L'activité catalytique ¹², Et biomoléculaire performances de détection ^13-15. Bien que les caractéristiques souhaitables sont très utiles pour plusieurs outils biomédicaux ^16,17 Les applications dans ce domaine ont été limitées. Une raison possible à cela est que la plupart des études ont principalement utilisé des spécimens macro-échelle ( Par exemple Feuilles, feuilles, et lingots) et les techniques d'incorporation np-Au dans les systèmes miniaturisés sont restés insuffisants. En fait, il ya seulement une poignée d'exemples de l'utilisation de techniques de microfabrication conventionnelles qui emploient np-Au cinéma ^16-20. Avec l'avènement de la technologie de la miniaturisation et le besoin de nouveaux outils biomédicaux, il est devenu essentiel d'être en mesure d'intégrer de nouveaux matériaux dans des dispositifs. Cela nécessite généralement que les matériaux peuvent être déposés et modelé avec des techniques de microfabrication conventionnelles. En outre, la quantification rapide des interactions cellule-matériau est généralement nécessaire d'évaluer la biocompatibilité d'un nouveau matériau. Le but de ce papier est de démontrer les techniques de base pour micromotif np-Au films et de quantifier à la fois nanostructure et les interactions cellule-matériau par traitement d'image numérique.

Protocole

1. Nanoporeux Fabrication d'or

1. Substrats propres dans une solution Piranha
   1. Ajouter 25 ml de peroxyde d'hydrogène (30%) à 100 ml d'acide sulfurique (96%) dans une boite de Pétri et porter le mélange à 65 ° C sur une plaque chauffante. ATTENTION: Les liquides sont extrêmement corrosifs et doivent être manipulés avec soin. La solution passé ne devrait pas être conservé dans un récipient hermétique, elle pourrait exploser.
   2. La place de 1 pouce par des lames de microscope de 3 pouces dans le mélange en utilisant une pince résistant à l'acide et les nettoyer pendant 10 min. Utilisez un bateau de immunohistochimique de porcelaine pour le lot de nettoyage de petites lamelles. Traiter de petites lamelles avec plasma d'air à 10 W pour 30 secondes avant l'immersion dans la solution.
   3. Rincer les échantillons nettoyés dans des boîtes de cristallisation sous l'eau déminéralisée (DI) en cours d'exécution pendant 3 min. Échantillons brushing avec un fusil d'azote plus non pelucheux serviettes.
2. Préparer pochoir (Méthode 1: Utilisez-le pour créer des motifs échelle millimétrique)
   1. Poinçon 250 feuilles d'élastomère silicone um d'épaisseur avec des pinces à biopsie et / ou inciser des régions avec un scalpel sur une surface de matière plastique semi-dur. Nettoyer les feuilles d'élastomères transformés à 70% d'isopropanol et sec avec un pistolet d'azote.
   2. Placez la feuille découpée sur un chiffon non pelucheux serviette de salle blanche et alignez les lamelles piranha nettoyés sur le pochoir avec la surface de l'échantillon face au pochoir.
3. Motif lift-off photosensible (Méthode 2: Utilisez-le pour créer des motifs sous-millimétrique)
   1. Placez un piranha nettoyé lame de microscope sur la filature mandrin et souffler les particules avec un pistolet à azote. Distribuer 1,5 ml de promoteur d'adhérence (hexaméthyldisilazane) sur la lame de verre à l'aide d'une pipette en plastique. Passez le promoteur en faisant tourner le coulisseau successivement à 500 tpm pendant 5 s et 1 500 tours par minute pendant 30 secondes. Cuire la lame sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 7 min et laisser refroidir pendant 5 min.
   2. Verser 4 ml de résine photosensible sur la lame de verre (3 pouces bY 1 pouce). Répandre la résine photosensible en faisant tourner la lame avec le même protocole que pour le promoteur d'adhérence. Faire cuire la résine photosensible sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 1,5 min et laisser refroidir pendant 10 min.
   3. Dégager la lame revêtue de résine photosensible avec une lumière UV (intensité: 22 mW / cm ²⁾ à travers un masque de transparence pendant 15 s. Cuire la résine photosensible sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 1,5 min et attendre pendant 45 min. Dissoudre la résine photosensible exposée dans le révélateur pour au moins 3,5 min. Rincez abondamment avec de l'eau DI. Inspectez les modèles développés dans le cadre d'un microscope optique.
4. métaux précurseurs de dépôt de produire du NP-Au couches minces
   1. Charger les échantillons dans une machine de pulvérisation cathodique pouvant indépendamment dépôt d'or, d'argent et de chrome. Pulvérisation nettoyer les échantillons pendant 90 secondes à 50 W de moins de 25 mTorr atmosphère d'argon traitement avant de commencer le dépôt de métal.
   2. Pulvérisation chrome pendant 10 min à 300 W de moins de 10 mTorr argon. Pulvérisation d'or pendant 90 secondes à 400 W ONUder 10 mTorr argon. Co-pulvérisation d'or et d'argent pendant 10 min avec de l'argent à 200 W et Au puissance à 100 W. Éteignez or source de pulvérisation environ 10 secondes avant d'éteindre l'argent source de pulvérisation.
5. Obtenir micropatterns métalliques précurseurs
   1. Soniquer échantillons revêtus de photoresist en ~ 180 ml de décapant résine photosensible pour 10 cycles de 20 sec ultrasons et 2 min de pause entre les cycles. Rincer les échantillons avec de l'eau DI et séchez avec un pistolet d'azote. Inspectez les motifs métalliques sous un microscope.
   2. Peler le pochoir en élastomère à partir d'échantillons non revêtus résine photosensible à l'aide de deux pinces pour révéler le métal déposé.
6. Dealloy précurseur métallique et nanostructure de modification via un traitement thermique
   1. Remplir un bécher en verre de 200 à 170 ml d'acide nitrique (70%) et de maintenir la température de la solution à 55 ° C sur une plaque chauffante. ATTENTION: L'acide nitrique est extrêmement corrosif et doit être manipulé avec équipement de protection approprié.
   2. Traiter de petites lamelles avec plasma d'air à 10 W pour 30 secondes avant l'immersion dans l'acide nitrique. La place de 1 pouce par des lames de microscope de 3 pouces dans le bécher en utilisant une pince résistant à l'acide et dealloy eux pendant 15 min. Utilisez un bateau de immunohistochimique de porcelaine pour le lot-dealloying petites lamelles.
   3. Rincer les échantillons dealloyed en les plongeant successivement dans deux béchers remplis d'eau DI frais trois fois. Conserver les échantillons dans de l'eau DI et remplacer l'eau avec de l'eau DI frais tous les jours pendant au moins une semaine. Échantillons brushing avec un fusil d'azote sur des serviettes non pelucheux avant l'utilisation.
   4. Charger des échantillons sur une plaquette de silicium pur dans un équipement de traitement thermique rapide. Amener la température à entre 200 ° C et 450 ° C et la vitesse de rampe à 10 ° C / s. Exposer les échantillons à la température prescrite pendant 10 min sous azote ambiant. Soit la chambre froide (<100 ° C) et retirer les échantillons. Sinon, placez lentement les échantillons sur la plaque chauffante pour treatm thermiqueent.

2. Culture cellulaire

1. Préparer np-Au échantillons pour la culture cellulaire
   1. Lieu np-Au échantillons dans des boîtes de polystyrène et traiter avec plasma d'air à 10 W pour 30 sec et transférer les échantillons de plaques de culture tissulaire à 24 puits.
   2. Ajouter 500 ul de milieu de culture complet (milieu Eagle modifié par Dulbecco avec 10% de sérum de veau fœtal et 1% de pénicilline / streptomycine) dans chaque puits. Magasin dans un incubateur humidifié à 37 ° C et 5% de _CO2 jusqu'à ce que l'ensemencement des cellules (<1 h).
2. Maintenir, passage, et des semences cellules
   1. Maintenir les cellules d'intérêt (dans ce cas fibroblastes NIH 3T3-ou les astrocytes murins) dans des flacons T75 avec les milieux de culture et de passage lorsque les cellules sont 70% de confluence.
   2. Pour repiquage des cellules, retirez le support du flacon, laver deux fois avec 10 ml de tampon phosphate salin (PBS), ajouter 2 ml de 1x trypsine / EDTA et incuber jusqu'à ce que le détachement des cellules (environ 5 min). Ajouter 3 ml de milieu frais etcentrifuger à 1200 rpm pendant 3 min. Aspirer le surnageant et suspendre le culot dans 2 ml de milieu.
   3. Retirez les supports usés du puits et épépiner les cellules sur les lamelles de verre à une densité de 25.000 cellules / cm ² avec un volume final de 1 ml. Agiter la plaque de culture de l'avant-arrière et droite-gauche afin d'assurer un revêtement uniforme des cellules sur les échantillons. Incuber les cellules jusqu'à l'analyse lors de l'inspection quotidienne.

3. Cellulaire et l'analyse des matériaux

1. Colorer les cellules de visualiser cytosquelette et les noyaux
   1. Retirez le support dépensé des puits et laver les cellules deux fois avec du PBS. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 15 min.
   2. Préparer la solution de coloration de 300 nM Alexa Fluor 488 phalloïdine dans PBS avec 1% de sérum albumine bovine.
   3. Laver les cellules deux fois avec du PBS, et perméabiliser dans 500 ul de 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min.
   4. Laver les cellules deux fois avec du PBS et de les transférer à nettoyer les puits. Blot 50 - 200 solution de coloration ul sur les échantillons et les stocker dans l'obscurité pendant 20 min.
   5. Laver les cellules avec du PBS et contre-coloration avec 3 nM de DAPI dans PBS pendant 5 min.
   6. Laver les cellules avec du PBS, et le tremper dans de l'eau déminéralisée avant de monter sur des lames de couverture en verre avec les médias de fixation et joint avec du vernis à ongles transparent.
2. Acquérir les images de NP-Au échantillons et des cultures cellulaires sur np-Au surfaces
   1. Image np-Au surfaces avec microscope électronique à balayage (MEB) avec 50.000 X grossissement à 10 kV énergie des électrons en utilisant un détecteur d'électrons secondaires.
   2. Capturez des images de cellules composites à différents endroits sur les échantillons à l'aide d'un microscope inversé à fluorescence à un grossissement de 10X avec les blocs de filtres appropriés.
3. images de processus pour déterminer la morphologie des pores et des cellules
   1. Ouverture d'images dans ImageJ et divisée en canaux individuels le cas échéant. Convertir les images en 8 bits, il faut soustraire le fond, et les lisser par filteri médianeng. Régler seuil soit manuellement, soit par haut-seuillant algorithmes de mettre en évidence les pores (vides) et des organismes cellulaires / noyaux.
   2. Utilisez la commande bassin versant de séparer pores ou des cellules fusionnées. Définissez les paramètres d'analyse de particules et d'exécuter la commande pour extraire le nombre de particules, superficie moyenne, et la couverture pour cent par des particules. Utiliser des images de cellules DAPI-souillé pour le comptage des cellules et des images de cellules phalloïdine tachés pour quantifier la couverture cellulaire pour cent.
   3. Modifiez les fichiers de macro inclus, pour effectuer des analyses de lots de plusieurs images.

Résultats

La figure 1 présente les principales étapes de la procédure, y compris la création des modèles np-Au, la culture de cellules, la quantification de la nanostructure, et la caractérisation des morphologies cellulaires. Le pochoir en élastomère montre la figure 2a (en haut) est utilisé pour créer les modèles np-Au représentés dans les images en dessous. Figure 2b est une photographie du bateau de la porcelaine pour les spécimens de traitement par lots.

Discussion

Nous démontrons deux techniques différentes pour micromotif np-Au films pour étendre l'utilisation de ces films dans des microsystèmes et des études biologiques. Or pulvérisation cathodique et de l'argent est une méthode polyvalente pour créer np-Au modèles, comme la pulvérisation est compatible avec les procédés de microfabrication conventionnelles et la composition de l'alliage et l'épaisseur peut être facilement contrôlée en faisant varier les pouvoirs d'armes à feu de pulvérisat...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold target	Lesker	EJTAUXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target	Lesker	EJTCRXX353A2	Adhesive layer
Silver target	Lesker	EJTAGXX403A2	Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat	Thomas Scientific	8542E40	Used for processing small samples
Nitric acid	Sigma-Aldrich	43873	Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid	J.T Baker	7664-93-9	Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide	J.T Baker	7722-84-1	Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches	Ted Pella	150xx	Available in several sizes
Silicone elastomer sheets	Rogers Corporation	HT 6240	Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane	Sigma-Aldrich	440191-100ML	Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26	Shipley	38490	Positive photoresist developer
PRS 3000	J.T Baker	JT6403-5	Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm)	Ted Pella	26023	Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch)	Ted Pella	26007	Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape	VWR	82030-950	Used for securing elastomer
Transparency masks	Output City		Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G	Used for activating glass surfaces
Sputtering machine	Kurt J. Lesker	LAB18	Used for depositing metals